免疫比浊法检测免疫球蛋白PPT讲稿.ppt

免疫比浊法检测免疫球蛋白第1页，共23页，编辑于2022年，星期五免疫浊度法是可溶性抗原、抗体在液相中特异免疫浊度法是可溶性抗原、抗体在液相中特异结合，产生一定大小的复合物，形成光的折射结合，产生一定大小的复合物，形成光的折射或吸收，或吸收，测定这种折射或吸收后的透射光或散测定这种折射或吸收后的透射光或散射光射光作为计算单位。作为计算单位。第2页，共23页，编辑于2022年，星期五免免疫疫比比浊浊法法分分类类当一束光当一束光线通过溶线通过溶液受到光液受到光散射和光散射和光吸收两个吸收两个因素的影因素的影响而使光响而使光的强度减的强度减弱弱透射比浊法透射比浊法透射比浊法透射比浊法:在光源的光路方向（在光源的光路方向（在光源的光路方向（在光源的光路方向（0 0 0 00 0 0 0）测量透射光强度和被检测测量透射光强度和被检测测量透射光强度和被检测测量透射光强度和被检测溶液微粒浓度关系的方法。溶液微粒浓度关系的方法。溶液微粒浓度关系的方法。溶液微粒浓度关系的方法。散射比浊法散射比浊法散射比浊法散射比浊法:在光源的光路方向（在光源的光路方向（在光源的光路方向（在光源的光路方向（5 5 5 50-0-0-0-969696960 0 0 0）角的方向上测量透射光强度角的方向上测量透射光强度角的方向上测量透射光强度角的方向上测量透射光强度和被检测溶液中微粒浓度关和被检测溶液中微粒浓度关和被检测溶液中微粒浓度关和被检测溶液中微粒浓度关系的方法。系的方法。系的方法。系的方法。第3页，共23页，编辑于2022年，星期五 透射比浊法和散射比浊法光路透射比浊法和散射比浊法光路检测器检测器A检测器检测器BICI0II 透射比浊法透射比浊法 散射比浊法散射比浊法第4页，共23页，编辑于2022年，星期五（一）（一）基本原理基本原理v 是个极其简单的方法。在抗原过量情况下，与待测样品中相是个极其简单的方法。在抗原过量情况下，与待测样品中相应的应的IgIg发生抗原发生抗原-抗体反应，形成可溶性复合物，使反应介抗体反应，形成可溶性复合物，使反应介质的浊度发生改变。质的浊度发生改变。v 测量方法利用分光光度计测量被吸收的量。读数以吸收单测量方法利用分光光度计测量被吸收的量。读数以吸收单位（位（A A）或）或ODOD值表示，值表示，A A值反映了入射光和透射光的比率。待测物值反映了入射光和透射光的比率。待测物中中IgIg含量可通过标准曲线计算得出。含量可通过标准曲线计算得出。v 待测样品中的抗原含量与吸光度呈正比，而与透射光呈反比。待测样品中的抗原含量与吸光度呈正比，而与透射光呈反比。v 反应在反应在PEGPEG的作用下，加速复合物的形成。的作用下，加速复合物的形成。免疫透射比浊法免疫透射比浊法第5页，共23页，编辑于2022年，星期五透射比浊法测定原理光光源源诱导诱导剂剂第6页，共23页，编辑于2022年，星期五样品光电计滤光片光源透射比浊法测定原理第7页，共23页，编辑于2022年，星期五透射比浊法的缺陷：(1)溶液中存在的抗原抗体复合物分子应足够大，分子太小则阻挡不了光线的通过。(2)溶液中的抗原抗体复合物的数量要足够多。如果数量太小，溶液浊度变化太小，对光通量影响不大。(3)透射比浊是依据透射光减弱的原理来定量的，因此只能测定抗原抗体反应的第二阶段，检测仍需抗原抗体温育反应时间，检测时间较长。光通量是每单位时间到达、离开或通过曲面的光通量是每单位时间到达、离开或通过曲面的光能数量光能数量 第8页，共23页，编辑于2022年，星期五原理原理散射比浊法散射比浊法在入射光的在入射光的一定角度一定角度检测粒子发出的散射光，检测粒子发出的散射光，散射光的强度与散射光的强度与ICIC的含量呈正比的含量呈正比。第9页，共23页，编辑于2022年，星期五散射比浊法测定原理增增增增 加加加加 散散散散 透透透透 率率率率:660nm:660nm测测测测 定定定定 散散散散 射射射射 光光光光聚集聚集形成形成诱导剂诱导剂第10页，共23页，编辑于2022年，星期五散射光测定散射光测定检测器(LED)光电计样品100%0%时间散射光强度第11页，共23页，编辑于2022年，星期五 速率散射比浊法速率散射比浊法 （一）（一）基本原理基本原理 是测定抗原抗体结合反应的动态过程。是测定抗原抗体结合反应的动态过程。所谓速率，是在所谓速率，是在单位时间内单位时间内抗原抗体结合形成抗原抗体结合形成 复合物的速度。将各单位时间内形成复合物的复合物的速度。将各单位时间内形成复合物的 速率及测定的散射信号连接在一起，即是动态速率及测定的散射信号连接在一起，即是动态 的速率比浊分析。的速率比浊分析。当仪器测定到某一时当仪器测定到某一时 间内形成速率下降时，间内形成速率下降时，即出现即出现速率峰速率峰，该峰，该峰 值的高低，即代表所值的高低，即代表所 测抗原的量。测抗原的量。第12页，共23页，编辑于2022年，星期五CONCENTRATIONRATE在速率峰基础上完成的标准曲线在速率峰基础上完成的标准曲线第13页，共23页，编辑于2022年，星期五方法评价：方法评价：敏感度高敏感度高 快速快速(不必达平衡）不必达平衡）抗原抗体结合的动态测定，理论上测定不受本底抗原抗体结合的动态测定，理论上测定不受本底散射信号的影响散射信号的影响 可检测微量样品可检测微量样品第14页，共23页，编辑于2022年，星期五 原理原理2.2.终点散射比浊法终点散射比浊法让抗原抗体作用一定时间，使其反应让抗原抗体作用一定时间，使其反应达到平衡达到平衡后，测定其后，测定其ICIC形成的量。形成的量。ICIC的浊度不再受时间的影响的浊度不再受时间的影响，但反应，但反应ICIC聚合聚合产生絮状沉淀之前，进行浊度测定。产生絮状沉淀之前，进行浊度测定。第15页，共23页，编辑于2022年，星期五散射比浊法散射比浊法的缺陷的缺陷(1)(1)因为是一次性测定光吸收值，没有考虑每一个待因为是一次性测定光吸收值，没有考虑每一个待测样本的吸收和散射效果，可测定结果不准确测样本的吸收和散射效果，可测定结果不准确(2)(2)测定的仍是抗原抗体反应的第二阶段，不适合测定的仍是抗原抗体反应的第二阶段，不适合快速检测。快速检测。(3)(3)终点法存在反应本底终点法存在反应本底，测定样本的含量越低本底，测定样本的含量越低本底比例越大，故在微量测定时，本底的干扰是影响准比例越大，故在微量测定时，本底的干扰是影响准确测定的重要因素。确测定的重要因素。第16页，共23页，编辑于2022年，星期五影响免疫比浊测定的因素1 1、抗原抗体比例、抗原抗体比例2 2、抗体的质量、抗体的质量 抗体的特异性、效价、亲和力抗体的特异性、效价、亲和力3 3、反应的溶液、反应的溶液4 4、增浊剂的使用、增浊剂的使用第17页，共23页，编辑于2022年，星期五1 1、透射比浊操作简便，适用于普通的自动生化分析仪和普通、透射比浊操作简便，适用于普通的自动生化分析仪和普通的分光光度计，几乎所有的实验室均能开展。不足的是灵敏度和的分光光度计，几乎所有的实验室均能开展。不足的是灵敏度和精密度均不够理想，所需的抗血清量大，检测的周期较长。精密度均不够理想，所需的抗血清量大，检测的周期较长。2 2、散射比浊的优点是灵敏度、精密度均较高，检测快速。、散射比浊的优点是灵敏度、精密度均较高，检测快速。其缺点是需特定的分析仪器，试剂价格高。其缺点是需特定的分析仪器，试剂价格高。透射比浊法和散射比浊法优缺点比较透射比浊法和散射比浊法优缺点比较第18页，共23页，编辑于2022年，星期五免疫浊度法测定中应注意的问题免疫浊度法测定中应注意的问题1 1、伪浊度的影响、伪浊度的影响 伪浊度形成原因很复杂，主要是抗血清含有非特异性的交伪浊度形成原因很复杂，主要是抗血清含有非特异性的交叉反应性杂抗体成分；增浊剂浓度和反应时间掌握不当；样品叉反应性杂抗体成分；增浊剂浓度和反应时间掌握不当；样品本身的浊度处理不当；试剂的污染和变质；器材尤其是比色杯本身的浊度处理不当；试剂的污染和变质；器材尤其是比色杯等不够清洁等因素。等不够清洁等因素。2 2、非特异性散射光的影响、非特异性散射光的影响 免疫浊度法经常受内源性光散射的干扰，为避免这些免疫浊度法经常受内源性光散射的干扰，为避免这些非特异性光散射的影响，应用透射比浊法时需保证抗体组非特异性光散射的影响，应用透射比浊法时需保证抗体组分在分在3 3以下，散射比浊法需保证在以下，散射比浊法需保证在 0.50.5以下。以下。第19页，共23页，编辑于2022年，星期五本实验中应用聚乙二醇的生理特性本实验中应用聚乙二醇的生理特性 聚乙二醇是聚乙二醇是中性、无毒中性、无毒且具有独特理化性质和良好的生物相溶性且具有独特理化性质和良好的生物相溶性的高分子聚合物，的高分子聚合物，聚乙二醇即聚乙二醇即PEGPEG具有高度的亲水性具有高度的亲水性，在水，在水溶液中有较大的水动力学体积，并且溶液中有较大的水动力学体积，并且没有免疫原性没有免疫原性。当藕联。当藕联到药物分子或药物表面时，可以将其优良性质赋予修饰后的药到药物分子或药物表面时，可以将其优良性质赋予修饰后的药物分子，物分子，改变它们在水溶液中的生物分配行为和溶解性改变它们在水溶液中的生物分配行为和溶解性，在其修饰的药物周围产生空间屏障，减少药物的酶解，避在其修饰的药物周围产生空间屏障，减少药物的酶解，避免在肾脏的代谢中很快消除，并使药物能被免疫系统的细免在肾脏的代谢中很快消除，并使药物能被免疫系统的细胞识别胞识别。第20页，共23页，编辑于2022年，星期五1.1.免疫球蛋白试剂免疫球蛋白试剂A,M,GA,M,G2.2.免疫球蛋白试剂免疫球蛋白试剂A,M,GA,M,G校准品，蒸馏水校准品，蒸馏水3.3.微量加样枪微量加样枪4.4.分光光度仪分光光度仪第21页，共23页，编辑于2022年，星期五Ig浓度（g/L）=Ig校准浓度（g/L）样本管吸光度校准管浓度第22页，共23页，编辑于2022年，星期五Thank you!第23页，共23页，编辑于2022年，星期五