DNA的复制和修复2.pptx
2.复制体的组成（与原核生物相比较）真核生物真核生物复制酶复制酶pol/进行性因子进行性因子增殖细胞核抗原（增殖细胞核抗原（PCNA）夹子装置器夹子装置器RF-C(replication factor C)引物合成酶引物合成酶pol 去除引物去除引物RNaseH1 和和 MF-1（53 外切酶）外切酶）滞后链修复滞后链修复pol 和和DNA连接酶连接酶消除拓扑张力消除拓扑张力 拓扑异构酶拓扑异构酶解螺旋酶解螺旋酶T抗原抗原单链结合单链结合RP-A(replication protein A)SSBDnaB旋转酶旋转酶pol和和DNA连接酶连接酶polDnaG 复合物复合物 夹子夹子pol原核生物原核生物第1页/共39页A schematic view of the major components at the eukaryotic replication fork.MF-1（单链结合蛋白）（复制酶）（夹子）（夹子装置器）（拓扑异构酶）（解旋酶）（引物合成酶）（DNA连接酶）第2页/共39页Structure of the PCNA homotrimer.Note that the trimeric PCNA ring of eukaryotes is remarkably similar to its prokaryotic counterpart,the dimeric sliding clamp.第3页/共39页（二）真核生物DNA复制过程1.真核与原核生物在复制过程上的相同之处：-半不连续复制；半不连续复制；-具有相似的起始、延伸等过程。具有相似的起始、延伸等过程。第4页/共39页原核生物原核生物真核生物真核生物复制子复制子1个个多个多个起始点起始点1个（可连续启动复制）个（可连续启动复制）多个多个延伸速度延伸速度105bp/min10003000bp/min冈崎片段冈崎片段10002000个核苷酸个核苷酸100200个核苷酸个核苷酸引发策略引发策略引物合成酶催化合成引物引物合成酶催化合成引物pol 催化合成引物和催化合成引物和寡聚脱氧核苷酸寡聚脱氧核苷酸延伸策略延伸策略由由pol异源二聚体催化前导异源二聚体催化前导链和滞后链的合成链和滞后链的合成两个两个pol 分别催化分别催化前前导链和滞后链的导链和滞后链的合成合成2.真核与原核生物DNA复制一般特点的比较第5页/共39页（三）端粒及端粒的合成1.端粒（telomere）真核生物线性染色体末端的特殊结构，由许真核生物线性染色体末端的特殊结构，由许多成串短的重复顺序组成，具有稳定染色体末多成串短的重复顺序组成，具有稳定染色体末端结构的功能。端结构的功能。四膜虫四膜虫 TTGGGG(仅列一条链的序仅列一条链的序列列)人人 TTAGGG第6页/共39页2.端粒酶（telomerase）含有含有RNA链的逆转录酶，它以所含链的逆转录酶，它以所含RNA为模为模板来合成板来合成 DNA端粒结构。端粒结构。3.端粒的合成 端粒酶结合到端粒的端粒酶结合到端粒的3 末端上，酶分子中末端上，酶分子中RNA链链5 末端识别末端识别DNA 3 末端并互补配对。末端并互补配对。以以RNA链为模板使链为模板使DNA链延伸，合成一个重复链延伸，合成一个重复单位后再向前移动一个单位。单位后再向前移动一个单位。3 单链可回折单链可回折作为引物，合成其互补链。作为引物，合成其互补链。第7页/共39页(a)Telomeres on human chromosomes consist of the hexanucleotide sequence TTAGGG repeated between 1000 and 1700 times.(b)Like other telomerases,human telomerase is a ribonucleoprotein.第8页/共39页 Problem posed in the replication of linear DNA:the end of one daughter strand will be shortened after each round of replication.第9页/共39页Synthesis of telomeric DNA by telomerase extends the 3-end.第10页/共39页七、生物体DNA复制的基本特点复制方式为半保留复制。复制方式为半保留复制。复制起始于特定位置；原核生物、病毒是单复制复制起始于特定位置；原核生物、病毒是单复制子，具一个复制起点；真核生物是多复制子，具多子，具一个复制起点；真核生物是多复制子，具多个复制起点。个复制起点。复制有单向和双向复制（后者更为常见）。复制有单向和双向复制（后者更为常见）。复制时，复制时，DNA链由链由53延伸，需延伸，需RNA引物，引物，复制过程为半不连续复制。复制过程为半不连续复制。第11页/共39页第二节 DNA的损伤及修复第12页/共39页 导致DNA损伤的因素生物因素：物理因素：化学因素：复制错误等。复制错误等。紫外线电离辐射如：HNO2 烷化剂可使同一条链上相邻嘧啶形成嘧啶二聚体可使同一条链上相邻嘧啶形成嘧啶二聚体（TT,CT,CC）打断打断DNA双链或单链，破坏碱基双链或单链，破坏碱基使碱基脱氨基，使碱基脱氨基，AI,CU，造成碱基错配，造成碱基错配可导致碱基错配、可导致碱基错配、DNADNA交联、碱基脱嘌呤等交联、碱基脱嘌呤等第13页/共39页修复系统错配修复错配修复直接修复直接修复切除修复切除修复重组修复重组修复倾错修复倾错修复第14页/共39页（一）错配修复（mismatch repair）定义：定义：复制后的复制后的DNA在短时间内在短时间内GATC序列是半甲基序列是半甲基化的，一旦发现错配碱基，包括错配碱基在内的未化的，一旦发现错配碱基，包括错配碱基在内的未甲基化的新链可被切除，并以甲基化的链为模板进甲基化的新链可被切除，并以甲基化的链为模板进行修复合成。行修复合成。第15页/共39页（二）直接修复某些损伤的核苷酸和错配的碱基可以被某些蛋某些损伤的核苷酸和错配的碱基可以被某些蛋白质识别和修复，这些蛋白质为了能够找出特白质识别和修复，这些蛋白质为了能够找出特别损伤部位可以连续监测别损伤部位可以连续监测DNA。这些蛋白质。这些蛋白质不切断不切断DNA或切除碱基而是直接实施修复，或切除碱基而是直接实施修复，这样的损伤修复机制称为这样的损伤修复机制称为直接修复。直接修复。第16页/共39页 可见光激活光复活酶，其可以分解由于紫外线照射形成的嘧啶二聚可见光激活光复活酶，其可以分解由于紫外线照射形成的嘧啶二聚体，恢复体，恢复DNA的正常结构。的正常结构。光复活修复（photoreactivation repair）此修复方式从低等生物到鸟类皆有，此修复方式从低等生物到鸟类皆有，在植物中比较重要。在植物中比较重要。第17页/共39页DNA is distorted at the site of T-T dimer.第18页/共39页通过光复活酶修复胸腺嘧啶二聚体的过程通过光复活酶修复胸腺嘧啶二聚体的过程第19页/共39页（三）切除修复(excision repair)v定义：v 包括：碱基切除修复（碱基切除修复（base-excision repair）核苷酸切除修复（核苷酸切除修复（nucleotide-excision repair）在一系列酶的作用下，将在一系列酶的作用下，将DNA分子中受损伤分子中受损伤部分切除掉，并以完整链的一条链为模板，合成部分切除掉，并以完整链的一条链为模板，合成切去的部分，使切去的部分，使DNA恢复正常结构的过程。恢复正常结构的过程。第20页/共39页（四）重组修复v定义：含有嘧啶二聚体或其他结构损伤的含有嘧啶二聚体或其他结构损伤的DNA进行复制进行复制时，子代时，子代DNA链在损伤部位出现缺口。通过遗传重组，链在损伤部位出现缺口。通过遗传重组，从完整的母链上将相应的片段移至子链的缺口处，然从完整的母链上将相应的片段移至子链的缺口处，然后用再合成的多核苷酸链补上母链的空缺。后用再合成的多核苷酸链补上母链的空缺。第21页/共39页（五）应急反应(SOS)和易错修复 许多可造成许多可造成DNA损伤或抑制复制的处理损伤或抑制复制的处理均能引起一系列复杂的诱导反应，称为均能引起一系列复杂的诱导反应，称为SOS反应。反应。1.应急反应包括：DNA损伤修复损伤修复诱变效应诱变效应细胞分裂的抑制细胞分裂的抑制溶原性细菌释放噬菌体溶原性细菌释放噬菌体（细胞癌变也与（细胞癌变也与SOS反应有关）反应有关）第22页/共39页倾错的倾错的DNA聚合酶聚合酶IV、V避免差错的修复（error free repair）倾向差错的修复（error prone repair）2.SOS反应诱导的修复系统错配修复、直接修复、错配修复、直接修复、切除修复、重组修复切除修复、重组修复3.SOS反应机制 由Rec A蛋白和LexA阻遏物相互作用引起的。第23页/共39页4.SOS反应的意义 SOS反应包括两方面：反应包括两方面：DNA修复修复和和导致变导致变异异。修复可使。修复可使DNA恢复正常结构，而变异可增恢复正常结构，而变异可增加物种生存的机会，在进化中是十分有意义的。加物种生存的机会，在进化中是十分有意义的。第24页/共39页第三节 RNA指导下的DNA的合成第25页/共39页第26页/共39页逆转录作用（reverse transcription）是以是以RNA为模板，即按照为模板，即按照RNA中的核苷酸顺序合成中的核苷酸顺序合成DNA的过程。的过程。第27页/共39页1964 年，年，Temin 提出前病毒学说，即在致提出前病毒学说，即在致癌癌RNA病毒的感染过程中存在一个病毒的感染过程中存在一个DNA中间中间体（前病毒）。体（前病毒）。1970年，年，Temin和和Baltimore分别从致癌分别从致癌RNA病毒中发现逆转录酶。病毒中发现逆转录酶。（一）逆转录酶（reverse transcriptase）的发现致癌致癌RNA病毒是一大群能引起鸟类、哺乳类等动物白血病和肉瘤以及其它肿瘤的病毒是一大群能引起鸟类、哺乳类等动物白血病和肉瘤以及其它肿瘤的病毒。这类病毒侵染细胞后并不引起细胞死亡，却可以使细胞发生恶性转化。病毒。这类病毒侵染细胞后并不引起细胞死亡，却可以使细胞发生恶性转化。第28页/共39页1975年，获诺年，获诺贝尔生理医学贝尔生理医学奖。奖。第29页/共39页（二）逆转录酶的性质活性：RNA指导的DNA聚合酶活力 DNA指导的DNA聚合酶活力 核糖核酸酶H的活力以以4种种dNTP为底物为底物需要有模板和引物需要有模板和引物聚合方向：聚合方向：53 需需Mg2+（Mn2+）数目：70个/病毒粒子 结构：含、两个亚基第30页/共39页逆转录病毒的基因组通常有两条相同的（+）RNA链所组成，在靠近5端的区域以氢键结合在一起。5端具有帽子结构，3端具有多聚腺苷酸。靠近5有1分子宿主tRNA，作为逆转录引物。典型逆转录病毒基因组长约7000-100000核苷酸，携带3个基因（gag，编码核心蛋白、pol，编码蛋白酶、整合酶、逆转录酶、env，编码膜蛋白)。基因组RNA的两端具有同样的序列，成为正向重复。第31页/共39页General structure of an integrated retrovirus genome.The long terminal repeats(LTRs)have sequences needed for the regulation and initiation of transcription.The sequence denoted is required for packaging retroviral RNAs into mature virus particles.第32页/共39页第33页/共39页（三）逆转录病毒生活史逆转录病毒生活史:逆转录病毒逆转录病毒进入宿主细胞进入宿主细胞进入宿主细胞进入宿主细胞在逆转录酶的催化下，以病毒的在逆转录酶的催化下，以病毒的RNA为模板合成为模板合成互补互补互补互补DNADNA（cDNAcDNA），形成，形成RNA-DNA杂化体，逆转录酶将杂化体，逆转录酶将杂化体中的杂化体中的RNA降解，同时以剩下的降解，同时以剩下的DNA链为模板合链为模板合成另一条互补的成另一条互补的DNA链，链，结果形成双链结果形成双链结果形成双链结果形成双链DNADNA双链双链DNA整合到宿主整合到宿主整合到宿主整合到宿主DNADNA中中利用宿主复制和转录机器生产大量的利用宿主复制和转录机器生产大量的病毒病毒病毒病毒RNARNA第34页/共39页转录出的转录出的mRNA翻译成病毒的包膜蛋白，逆转录酶翻译成病毒的包膜蛋白，逆转录酶和壳体蛋白和壳体蛋白将病毒将病毒RNA、逆转录酶和壳体蛋白组装成病毒的、逆转录酶和壳体蛋白组装成病毒的核壳体核壳体核壳体结合包膜蛋白形成核壳体结合包膜蛋白形成完整的逆转录病毒完整的逆转录病毒完整的逆转录病毒完整的逆转录病毒逆转录酶没有逆转录酶没有3-5外切酶活性或校正活性，所以它外切酶活性或校正活性，所以它的错误率比任何的错误率比任何DNA聚合酶都高聚合酶都高第35页/共39页+病毒RNA侵染宿主细胞RNA-cDNA杂交分子RNA指导的DNA聚合酶-DNA整合入染色体基因组DNA指导的DNA聚合酶-+双链DNA逆转录过程核糖核酸酶H病毒RNA自身蛋白质转录翻译+第36页/共39页cDNAcDNA：几乎所有真核生物几乎所有真核生物mRNAmRNA分子的分子的3 3末端都有末端都有一段一段polyA,polyA,当加入寡聚当加入寡聚dTdT作为引物时，作为引物时，mRNAmRNA就可作就可作为模板，在逆转录酶催化下在体外合成与其互补的为模板，在逆转录酶催化下在体外合成与其互补的DNADNA，称为，称为cDNAcDNA。第37页/共39页（四）逆转录酶应用与逆转录研究意义逆转录酶的应用（如：cDNA的获得、逆转录病毒病毒作为信息载体作为基因治疗等）研究意义：揭示HIV病毒和嗜肝DNA病毒的致病机理与防治研究用于分子生物学研究的材料第38页/共39页感谢您的欣赏！第39页/共39页
