PCR体系学习教程.pptx

模板：单链或双链DNA引物：1对长16-30bp的寡核苷酸(决定扩增产物特异性的关键)DNA聚合酶：耐热的DNA聚合酶(常用Taq酶或Pfu酶)底物：四种脱氧三磷酸核苷dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTPMg2+：DNA聚合酶的激活剂PCR反应体系的五要素：第1页/共7页2通用PCRPCR反应体系组分组分终浓度终浓度10PCR buffer1MgCl21-4mM（常用（常用1.5mM）dNTP0.2mM each（200uM each）Primer F0.1-1.0uMPrimer R0.1-1.0uMTemplate DNA0.01-10ngTaq(Pfu)0.2-1UddH2OUp to final volumeTotal volume15-50uL某些公司生产的某些公司生产的buffer会预先含有会预先含有Mg离子，因此不必额外再添加离子，因此不必额外再添加Mg离子。离子。第2页/共7页3缓冲液(buffer)：提供合适的pH值和DNA聚合酶的激活剂10mM TrisHCl（pH8.3-9.0），1.5mM MgCl2，50mM K+多次冻融会使dNTP 降解。如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR 产物的产量。Mg2+浓度过高，反应特异性降低,出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA 聚合酶的活性,使反应产物减少。dNTP（底物）：等摩尔浓度的 4 种 dNTP（即 dATP、dTTP、dCTP和dGTP），终浓度一般为 0.2mM（即饱和浓度），dNTP 的浓度会影响扩增的产量、特异性和保真度。第3页/共7页引物(Primer)：1M/L 上游引物：与目的序列5端相同下游引物：与目的序列3端互补上游引物下游引物注：当双链解开成单注：当双链解开成单链后，引物总是结合链后，引物总是结合于靶序列的于靶序列的3端。端。4第4页/共7页5模板：单、双链DNA均可。模板的纯度要求不是很高，但其数量会直接影响扩增的效果。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。目前有两种Taq DNA 聚合酶供应,一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR 反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul 时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。DNADNA聚合酶聚合酶：最常用的是最常用的是TaqTaq DNA DNA聚合酶，聚合酶，最适反应温度最适反应温度7575。Pfu Pfu DNADNA聚合酶：聚合酶：是目前使用最广泛的具有是目前使用最广泛的具有 3-5 3-5 外切酶外切酶活性（高保真）的活性（高保真）的 PCR PCR 酶，目前为止酶，目前为止错配率最低错配率最低的耐高温的耐高温DNADNA聚合酶。聚合酶。第5页/共7页谢谢！第6页/共7页谢谢您的观看！第7页/共7页