3哺乳动物组织基因组DNA提取..ppt

Genomic DNA Extraction from Mammal Tissue哺乳动物组织基因组哺乳动物组织基因组DNA提取提取1/22/20231一、一、实验目的实验目的(Experimental Purpose)After the experiment is finished,students should be able to extract genomic DNA from mammal tissue,and to run an agarose gel.1.1.掌握动物基因组掌握动物基因组DNADNA提取的操作方法。提取的操作方法。2.2.掌握琼脂糖凝胶电泳的操作的方法。掌握琼脂糖凝胶电泳的操作的方法。1/22/20232二、二、实验原理实验原理(Experimental Principle)lThe detergents SDS(sodium dodecyl sulfate)is added to denature proteins and solubilize lipids in membranes leading to cell lysis.The cell lysate is often treated with enzymes that hydrolyze RNA and proteins.本本实实验验利利用用去去垢垢剂剂SDS(十十二二烷烷基基磺磺酸酸钠钠)是是为为了了使使蛋蛋白白变变性性并并溶溶解解细细胞胞膜膜中中的的脂脂质质从从而而导导致致细细胞胞裂裂解解，而细胞裂解物又常用蛋白酶而细胞裂解物又常用蛋白酶K进行水解处理。进行水解处理。1/22/20233真核生物染真核生物染色体色体DNADNA组组装不同层次装不同层次的结构的结构1/22/20234lThen they are treated with phenol and chloroform to remove the remaining proteins,which will either enter the organic phase or,if they had denatured,appear at the interphase.Alcohol help to concentrate the DNA while removing nucleotides,amino acids,oligonucleotides and peptides.随随后后用用酚酚氯氯仿仿进进行行抽抽提提，以以去去除除残残留留的的蛋蛋白白质质，这这时时蛋蛋白白质质将将进进入入有有机机相相，或或者者假假如如己己变变性性的的话话将将呈呈现现在在有有机机相相与与水水相相之之间间。乙乙醇醇沉沉淀淀处处理理则则可可以以浓浓缩缩DNA，同时去除核苷酸、氨基酸以及低分子量的寡核苷酸和肽。同时去除核苷酸、氨基酸以及低分子量的寡核苷酸和肽。1/22/20235lWe can add the eathylene diamine tetraacetic acid(EDTA)to keep the integrity of DNA.EDTA can chelate Mg2+and reduce deoxyribonuclease(DNase)activity,because these enzymes require Mg2+to work.为为了了进进一一步步保保护护DNA样样品品的的完完整整性性，通通常常需需要要在在缓缓冲冲液液中中添添加加乙乙二二胺胺四四乙乙酸酸(EDTA)以以整整合合Mg2+，这这样样将将会会 减减 少少 脱脱 氧氧 核核 糖糖 核核 酸酸 酶酶(DNase)的的活活性性，因因为为该该酶酶必必须须在在有有Mg2+存存在在时时才才会会起起作用。作用。1/22/20236 本本实实验验方方法法分分离离得得到到的的染染色色体体DNA长长度度为为100-150kb，适适用用于于构构建建基基因因组组文文库库和和Southern杂杂交交分分析析。如如果果要要求求得得到到较较大大分分子子量量的的DNA，则则必必须须省省略略其其中中的的振荡步骤。振荡步骤。1/22/20237核酸的分离纯化、测定及核酸的分离纯化、测定及研究方法研究方法一、一、分离核酸的一般原则分离核酸的一般原则 因因为为遗遗传传信信息息全全部部贮贮存存在在核核酸酸的的一一级级结结构构中中，故故完完整整的的一一级级结结构构是是保保证证核核酸酸结结构构与与功功能能研研究究的基础。的基础。1/22/20238（一）核酸的分离和纯化时应遵循两个原则（一）核酸的分离和纯化时应遵循两个原则 保证核酸一级结构的完整性；保证核酸一级结构的完整性；排除其它分子的污染。排除其它分子的污染。（二）核酸的纯度要求（二）核酸的纯度要求 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；的金属离子；其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；最低程度；排除其它核酸分子的污染，如提取排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时，应去除分子时，应去除RNA，反之亦然，反之亦然。1/22/20239（三）核酸分离纯化的注意事项（三）核酸分离纯化的注意事项l为保证分离核酸的完整性和纯度，在实验中应注意：为保证分离核酸的完整性和纯度，在实验中应注意：l 尽尽量量简简化化操操作作步步骤骤，缩缩短短提提取取过过程程，以以减减少少各各种种有有害害因因素素对对核核酸酸的的破坏；破坏；l 减减少少化化学学物物质质对对核核酸酸的的降降解解，为为避避免免过过酸酸、过过碱碱对对核核酸酸链链中中磷磷酸酸二二酯键的破坏，操作多在酯键的破坏，操作多在pH4pH41010条件下进行；条件下进行；l 防防止止核核酸酸的的生生物物降降解解。细细胞胞内内或或外外来来的的各各种种核核酸酸酶酶水水解解核核酸酸链链中中的的磷磷酸酸二二酯酯键键，直直接接破破坏坏核核酸酸的的一一级级结结构构。其其中中DNADNA酶酶需需要要金金属属二二价价阳阳离离子子MgMg2+2+，CaCa2+2+的的激激活活，因因此此使使用用金金属属离离子子螯螯合合剂剂，如如EDTAEDTA或或柠柠檬檬酸酸盐盐等等基基本本上上可可以以抑抑制制DNADNA酶酶的的活活性性。而而RNARNA酶酶不不但但分分布布广广泛泛、极极易易污污染染样样品品，而而且且耐耐高高温温、耐耐酸酸碱碱、不不易易失失活活，所所以以生生物物降降解解是是RNARNA提提取取过过程程中中的的主主要要危害因素；危害因素；l 减减少少物物理理因因素素对对核核酸酸的的降降解解，物物理理降降解解因因素素主主要要是是机机械械剪剪切切力力，其其次是高温。次是高温。1/22/202310高高温温：如如长长时时间间煮煮沸沸，除除水水沸沸腾腾带带来来的的剪剪切切力力外外，高高温温本本身身对对核核酸酸分分子子中中的的某某些些化化合合键键也也有有破破坏坏作作用用。核核酸酸提提取取过过程程中中常常规规操操作作温温度度为为0 044以以降降低低核核酸酸酶的活性从而减少对核酸的生物降解。酶的活性从而减少对核酸的生物降解。机机械械剪剪切切力力：包包括括强强力力高高速速的的溶溶液液振振荡荡、搅搅拌拌，细细胞胞突突然然置置于于低低渗渗液液中中；细细胞胞爆爆炸炸式式地地破破裂裂及及DNADNA样样品品的的反反复复冻冻融融等等。这这些些操操作作细细节节在在实实验验操操作作中中应应加加倍倍注注意意。机机械械剪剪切切作作用用的的主主要要危危害害对对象象是是大大分分子子量的线性量的线性DNADNA分子，如真核细胞的染色体分子，如真核细胞的染色体DNADNA等等。1/22/202311二、核酸分离纯化的一般步骤二、核酸分离纯化的一般步骤l破碎细胞破碎细胞去除蛋白质、多糖、脂类等生物大分去除蛋白质、多糖、脂类等生物大分子子沉淀核酸沉淀核酸去除盐类、有机溶剂等杂质去除盐类、有机溶剂等杂质纯纯化干燥化干燥溶解。溶解。l核酸提取方案，应根据具体生物材料和待提取核核酸提取方案，应根据具体生物材料和待提取核酸分子的特点而定。对于某特定细胞器中富集的酸分子的特点而定。对于某特定细胞器中富集的核酸分子，采用先提取细胞器后再提取目的核酸核酸分子，采用先提取细胞器后再提取目的核酸分子的方案，可获得完整性和纯度两方面质量均分子的方案，可获得完整性和纯度两方面质量均高的核酸分子。高的核酸分子。1/22/202312三、试剂与器材三、试剂与器材(Reagents and apparatus).Instruments High speed refrigerated centrifuge（高速冷冻离心机）、（高速冷冻离心机）、Glass homogenizer（玻璃匀浆器）（玻璃匀浆器）、Electrophoresis System（电泳系统）（电泳系统）、Ultraviolet transilluminator（紫外透（紫外透射仪）射仪）、Ultra cold storage freezer（超低温冰箱）（超低温冰箱）、Autoclave（高压灭菌锅）（高压灭菌锅）、Pipettes（微量加样器）（微量加样器）、Electronic balance（电子天平）（电子天平）、Acidometer（酸度计）（酸度计）1/22/202313.Material Liver of mice 1/22/202314.ReagentsTris、SDS、EDTA、HCl、NaOH、Sodium acetate(NaAc)、Acetic acid(HAc)、Phenol、Chloroform、Ethanol、Isoamylol、TE buffer、Protease K、RNase A、Agarose、DNA molecular weight markers、Boric acid、Sugar、Bromophenol blue、Fluorescent dye(Gelview)1/22/2023151.1.5 mol5 molL L NaClNaCl 2.2.1 mol1 molL L TrisTris HClHCl pH8.0 pH8.03.3.0.5 mol0.5 molL EDTA pH8.0 L EDTA pH8.0 4.dddH4.dddH2 2O O 5.5.3 mol3 molL L NaAcNaAc pH5.2 pH5.2 6.6.生理盐水（生理盐水（0.850.85 NaClNaCl）7 7.10.10SDS SDS 8.8.5 5TBETBE 9.10mg9.10mgmLmL蛋白酶蛋白酶K-20K-20保存保存 10.10.10mg10mgmLmL无无DNADNA酶的酶的RNARNA酶酶 -20-20保存保存11.11.6 6凝胶加样缓冲液凝胶加样缓冲液（一）（一）储备液的制备储备液的制备四、实验步骤四、实验步骤(Experimental Procedures)1/22/202316四、实验步骤四、实验步骤(Experimental Procedures)冰浴处理生理盐水冰浴处理生理盐水 玻璃匀浆器玻璃匀浆器 冰冷的生理盐水清洗（冰冷的生理盐水清洗（3次）次）配制工作液配制工作液 处死小鼠处死小鼠 取出肝脏取出肝脏 组织匀浆液组织匀浆液 酶解液酶解液2ml2ml匀浆液匀浆液 组织细胞液组织细胞液 玻璃匀浆器匀浆玻璃匀浆器匀浆 移至移至1.5ml离心管离心管 5000r5000rmin30min3060s 60s 加加400ul 400ul 吹散吹散 加加400ul400ul 离心离心 无菌水无菌水 酶解液酶解液 水浴处理（水浴处理（55、1218h）（二）（二）破碎、酶解细胞（过夜）破碎、酶解细胞（过夜）0.2g4弃上清弃上清1/22/202317四、实验步骤四、实验步骤(Experimental Procedures)等量分装在两支离心管内等量分装在两支离心管内 加入加入20ul20ul的的RNaseRNase 加入等体积加入等体积提取液提取液(翻转混匀翻转混匀)4 10min 4 10min酶解样品酶解样品 待抽提的样品待抽提的样品 抽提抽提 静置静置 离心离心 配制配制 TETE缓冲液缓冲液 加等体积加等体积提取液提取液500ul500ul10000r10000rminmin离心离心10min 10min 4 10min4 10min 移出水相移出水相 至离心管至离心管 抽提抽提 静置静置 10000r10000rminmin离心离心10min 10min 加加1/10 1/10 加加2 2倍倍 放入放入离心离心 移出移出水相水相 NaAcNaAc 无水乙醇无水乙醇 -20 1-2h 12000r-20 1-2h 12000rminmin离心离心15min 15min 加入加入超低温冰箱超低温冰箱 融化、离心融化、离心 弃上清液弃上清液 洗涤洗涤 12000r12000rminmin离心离心15min 15min 干燥干燥 混匀混匀75%75%冷乙醇冷乙醇 离心离心 弃上清液弃上清液 加加TETE50ul50ul （三）（三）抽提抽提DNA、乙醇沉淀纯化、乙醇沉淀纯化DNA37 水浴水浴1hDNADNA(4(4 存放存放存放存放)1/22/202318四、实验步骤四、实验步骤(Experimental Procedures)Agarose Gel Electrophoresis：Preparation of the gel 制备制备0.3琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 Loading DNA samples DNA samples 16l+Loading buffer4l Gel 电压电压120V Gel photography（四）（四）、琼脂糖凝胶电泳检测、琼脂糖凝胶电泳检测DNA1/22/2023191.制制备备 0.3 琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶。称称取取 0.06 g 琼琼脂脂糖糖，放放人人锥锥形形瓶瓶中中，加加入入 20 mL的的 0.5TBE 缓缓冲冲液液，放放入入微微波波炉炉加加热热至至完完全全溶溶化化，则则为为 0.3 琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶液液。（由由于于蒸蒸发发作作用用，溶溶解解前前在在容容量量瓶瓶上上作一个记号，溶解后用三蒸水补足作一个记号，溶解后用三蒸水补足）2.制胶器的安装。制胶器的安装。3.将将将将熔熔熔熔化化化化的的的的琼琼琼琼脂脂脂脂糖糖糖糖凝凝凝凝胶胶胶胶液液液液转转转转入入入入Gelview专专专专用用用用的的的的三三三三角角角角瓶瓶瓶瓶中中中中，然然然然后后后后加加加加入入入入Gelview 2 2 l l。4.将冷到将冷到60左右，缓缓倒入制胶器左右，缓缓倒入制胶器(注意不要形成气泡注意不要形成气泡)。5.待待胶胶凝凝固固后后（80min），轻轻轻轻拔拔掉掉梳梳子子，将将凝凝胶胶盘盘从从制制胶胶槽槽中中取出，放入电泳槽内。取出，放入电泳槽内。6.加入电泳缓冲液加入电泳缓冲液(0.5)至电泳槽中。至电泳槽中。1/22/2023205 5TBETBE（电泳缓冲液）（电泳缓冲液）100mL100mLl5.4gTris，l2.75g硼酸，硼酸，l2mL 0.5mol/L EDTA(pH8.0)l加蒸馏水到加蒸馏水到100mllpH8.00.5TBE1/22/2023216 6上样缓冲液上样缓冲液l0 02525溴酚蓝：取溴酚蓝：取60ml60ml三蒸水，将三蒸水，将250mg250mg溴酚蓝溶解于其中溴酚蓝溶解于其中l4040(W(WV)V)蔗糖水溶液：在上述溶液中加蔗糖水溶液：在上述溶液中加入入40g40g蔗糖蔗糖1/22/202322 Illuminate the gel with UV light and then take pictures.By comparing product bands with bands from the known molecular-weight markers,you should be able to identify any product fragments which are of the appropriate molecular weight.通过紫外透射仪检测凝胶，然后获取图通过紫外透射仪检测凝胶，然后获取图片。并将产物条带与已知分子量的标淮条带片。并将产物条带与已知分子量的标淮条带进行比较，便可以对合适分子量大小的产物进行比较，便可以对合适分子量大小的产物进行鉴定。进行鉴定。1/22/202323五、实验结果五、实验结果(experimental results)1/22/202324l哺乳动物基因组哺乳动物基因组DNA的提取的提取 （综合性实验报告）（综合性实验报告）六、实验报告六、实验报告1/22/202325溶液溶液的配制的配制摩尔质量的计算摩尔质量的计算:质量质量(g)分子量分子量 5 mol5 molL L NaClNaCl 分子量分子量58.4458.44 x58.44(1)5mol/L氯化钠（氯化钠（NaClNaCl）：）：溶解溶解14.6g14.6g氯化钠于足量的水中，定容至氯化钠于足量的水中，定容至50ml50ml。0.05(L)5（mol/L）x 14.61（g）体积体积(L)摩尔体积（摩尔体积（mol/L）1/22/202326(2)0.5mol/L(2)0.5mol/L乙二胺四乙酸（乙二胺四乙酸（EDTAEDTA）:配制等摩尔的配制等摩尔的NaNa2 2EDTAEDTA和和NaOHNaOH溶液（溶液（0.5mol/L0.5mol/L），），混合后形成混合后形成EDTAEDTA的三钠盐。或称取的三钠盐。或称取9.31g9.31g的的NaNa2 2EDTAEDTA2H2H2 2O O和和1g1g的的NaOHNaOH，pHpH调至调至8.08.0，并溶于约，并溶于约40ml40ml水中，定容至水中，定容至50ml 50ml。（3)3mol/L3)3mol/L乙酸钠（乙酸钠（NaAcNaAc）：）：溶解溶解20.4g20.4g的三水乙酸钠于约的三水乙酸钠于约40ml40ml水中，用冰乙酸水中，用冰乙酸调溶液的调溶液的pHpH至至5.25.2，再加水定容到，再加水定容到50ml 50ml。1/22/202327(4)10(4)10十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（SDSSDS）：）：称取称取5gSDS5gSDS慢慢转移到约含慢慢转移到约含40ml40ml的水的烧杯中，用磁力的水的烧杯中，用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解。用水定容至搅拌器搅拌直至完全溶解。用水定容至50ml 50ml。(5)40%(5)40%氢氧化钠（氢氧化钠（NaOHNaOH）：）：溶解溶解40g40g氢氧化钠颗粒于约氢氧化钠颗粒于约90ml90ml水的烧杯中（磁力搅拌水的烧杯中（磁力搅拌器搅拌），氢氧化钠完全溶解后用水定容至器搅拌），氢氧化钠完全溶解后用水定容至100ml 100ml。(6)1mol/L(6)1mol/L盐酸（盐酸（HClHCl）：）：加加8.6ml8.6ml的浓盐酸至的浓盐酸至91.4ml91.4ml的水中。的水中。1/22/202328(7)20mg/ml(7)20mg/ml蛋白酶蛋白酶K K（proteinaseproteinase K K）：）：将将200mg200mg的蛋白酶的蛋白酶k k加入到加入到9.5ml9.5ml水中，轻轻摇动，水中，轻轻摇动，直至蛋白酶直至蛋白酶K K完全溶解。不要涡旋混合。加水定容完全溶解。不要涡旋混合。加水定容到到10ml10ml，然后分装成小份贮存于，然后分装成小份贮存于-20-20。(8)(8)10mg/mlRnase10mg/mlRnase（无（无DNaseDNase）（）（DNaseDNasefree free RNaseRNase）：）：溶解溶解10mg10mg的胰蛋白的胰蛋白RNARNA酶于酶于1ml1ml的的10mmol/L10mmol/L的乙酸钠的乙酸钠水溶液中（水溶液中（pH 5.0pH 5.0）。溶解后于水浴中煮沸）。溶解后于水浴中煮沸15min15min，使，使DNADNA酶失活。用酶失活。用1mol/L1mol/L的的TrisTrisHClHCl调调pHpH至至7.57.5，于，于-20-20贮存。（配制过程中要戴手套）贮存。（配制过程中要戴手套）1/22/202329(9)(9)1 mol1 molL L TrisTris缓冲液（缓冲液（TrisTrisHClHCl bufferbuffer）将将121g121g的的TrisTris碱溶解于约碱溶解于约0.9L0.9L水中，再根据所要求的水中，再根据所要求的pHpH（2525下）加一定量的浓盐酸（下）加一定量的浓盐酸（11.6N11.6N），用水调整终），用水调整终体积至体积至1L1L。浓盐酸的体积（ml）pH14148.68.6212128.528.5383846465656666671.371.376 76 9.09.08.88.88.68.68.48.48.28.28.08.07.87.87.67.67.47.47.2 7.2 1/22/202330(10)5(10)5TBETBE（电泳缓冲液）（电泳缓冲液）100mL100mLl5.4gTris5.4gTris，l2.75g2.75g硼酸，硼酸，l2mL 0.5mol2mL 0.5molL EDTA(pH8.0)L EDTA(pH8.0)l加加蒸馏蒸馏水到水到100mL 100mL pH8.0pH8.0(11)6上样缓冲液上样缓冲液 0.25溴酚蓝：取溴酚蓝：取60ml双蒸水，将双蒸水，将250mg溴酚蓝溶解于其中溴酚蓝溶解于其中 40(WV)蔗糖水溶液：在上述溶液中加入蔗糖水溶液：在上述溶液中加入40g蔗糖蔗糖1/22/202331（1212）组织匀浆液）组织匀浆液 （装入（装入10ml10ml离心管中）离心管中）10ml10ml l100mmol100mmolL L NaClNaCl：0.2ml0.2ml（5M 5M NaClNaCl）l25 25 mmolmmolL EDTA(pH8.0)L EDTA(pH8.0)：0.5ml0.5ml（0.5M 0.5M EDTA pH8.0)EDTA pH8.0)ll0mmoll0mmolL L TrisTris HCIpHHCIpH 8.0)8.0)：0.1ml0.1ml（1M 1M TrisTris HCIpHHCIpH 8.0)8.0)l加三蒸水加三蒸水:9.2ml:9.2ml计算方法：计算方法：5 molL NaCl 100mmolL 5 molL x 0.1molL 10ml 0.2ml 1/22/202332（1313）酶解液（装入酶解液（装入1.5ml1.5ml离心管中）离心管中）1ml1mll200mmol200mmolL L NaClNaCl：0.04ml0.04ml （5M 5M NaClNaCl）l50mmol50mmolL L EDTA(pHEDTA(pH 8.0)8.0)：0.1ml0.1ml （0.5M 0.5M EDTA pH8.0)EDTA pH8.0)l20mmol20mmolL L TrisTrisHCl(pHHCl(pH 8.0)8.0)：0.02ml0.02ml（1M 1M TrisTris HCIpHHCIpH 8.0)8.0)l1 1SDSSDS：0.1ml0.1ml（1010 SDSSDS）l200g200gmLmL蛋白酶蛋白酶K K：0.02ml0.02ml（10mg10mgmLmL）l加三蒸水加三蒸水:0.72ml0.72ml1/22/202333 （1414）提取液）提取液1 1 ：平衡酚：平衡酚(pH8.0)(pH8.0)：氯仿：异戊醇：氯仿：异戊醇 （2525：2424：1 1）即配即用即配即用 每管加每管加500ul500ul 平衡酚平衡酚(pH8.0)(pH8.0)：250ul250ul 氯仿：氯仿：240ul240ul 异戊醇：异戊醇：10ul10ul（15）提取液）提取液2 ：氯仿：异戊醇（：氯仿：异戊醇（24：1）即配即用即配即用 每支试管加每支试管加 500 ul500 ul 氯仿：氯仿：480ul480ul 异戊醇：异戊醇：20ul20ul1/22/202334（1616）TETE缓冲液：缓冲液：5ml5mll10mmol10mmolL L TrisTris HCl(pHHCl(pH 8.0)8.0)：0.05ml0.05ml（1M L 1M L TrisTrisHCIHCI pH 8.0)pH 8.0)l1mmol1mmolL EDTA(PH8L EDTA(PH80)0)：0.01ml0.01ml（0.5M EDTA pH8.0)0.5M EDTA pH8.0)加三蒸水至加三蒸水至4.94mL4.94mL1/22/202335酚抽提除去蛋白质的示意图酚抽提除去蛋白质的示意图1/22/202336核酸的沉淀核酸的沉淀l原理：核酸与钠、钾、镁形成的盐在许多有机原理：核酸与钠、钾、镁形成的盐在许多有机溶剂中不溶，也不会变性。溶剂中不溶，也不会变性。l醋酸钠为沉淀醋酸钠为沉淀DNA、RNA的最常用盐类。的最常用盐类。l有机溶剂：乙醇、异丙醇、聚乙二醇。有机溶剂：乙醇、异丙醇、聚乙二醇。l温度：冰水温度：冰水1/22/202337