蛋白质的定量测定实验报告.docx

试验名称(Title of Experimetn)蛋白质的定量测定Folin-酚试剂法试验日期(Date of Experiment)合作者(Partner)总分XXXX XXXX教师签名试验地点(Lab No.) 指导教师(Instructor)XXXX XXXX批改日期(Total Score)一、试验预习1.0 试验目的(Signature)(Date)l 初步了解各种蛋白质含量测定的常用方法。l 把握 Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的原理及生疏和把握试验操作技术。l 把握用excel 制作标准曲线和通过标准曲线及标准管方法求样品溶液中待测定物质含量。1.1 试验原理1.1.1 总体概述Folin-酚试剂法是经过科学家改进的测定蛋白质含量的方法，Folin 首创这种方法：利用蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基酚基复原酚试剂磷钨酸 -磷钼酸 起蓝色反响。而后，Lowry 对此法进展了改进，先于标本中加碱性铜试剂，再与酚试剂反响，提高了灵敏度，灵敏度的范围为： 20 250m g ，故使得试验的准确度大大提高， 但同时也存在着干扰物质多、费时、操作严格计时等问题。1.1.2 双缩脲反响在碱性溶液中，双缩脲 H 2 NOC - NH - CONH 2 能和 Cu2+ 作用，发生配位反响，形成紫色或紫红色的络合物，即为双缩脲反响。由于蛋白质的肽键构造与双缩脲构造相像，故在碱性溶液中，蛋白质的分子中肽键能和碱性铜试剂中的Cu2+ 作用，生成紫红色的蛋白质- Cu2+ 复合物。对于蛋白质的测定来说，这一步是根底，这也是 Folin-酚法的根底原理。1.1.3 Folin-酚显色反响Folin-酚试剂在碱性条件下极不稳定，其磷钼酸盐-磷钨酸盐易背酚类化合物复原而呈现蓝色。酪氨酸Tyr含有酚羟基，故蛋白质- Cu2+ 复合物含有的酪氨酸或色氨酸残基复原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成蓝色的化合物。在肯定的浓度范围内，蓝色的深浅与蛋白质的浓度呈线性关系。故可以利用上述两种反响通过分光光度法测定待测样品的蛋白质含量。1.1.4 分光光度法测定样品的蛋白质的含量本试验以上述两个反响原理为根底，再通过设置空白比照组，标准管中设置蛋白标准液的一系列浓度梯度 0.2mL ， 0.4mL ， 0.6mL ， 0.8mL 通过分光光度计测定吸光度，从而猎取标准曲线，样品管通过测定的吸光度值，在标准曲线中找到较为准确对应的含量。1.2 试验材料1.2.1 试验样品血清稀释液正常人血清稀释 300 倍1.2.2 试验试剂 200 mg/ml 牛血清白蛋白标准液BSA； 碱性硫酸铜溶液 组成：碱溶液与硫酸铜溶液按 50:1 混合而成，使用时该溶液必需颖配制，当日有效； Folin-酚试剂配制过程较为简单注：此次试验所用的试剂全部已由教师制备好，所以无配制过程，但需知道配制流程，可查阅试验书 P105。1.2.3 试验仪器及器材V-1100 可见光分光光度计；恒温水浴箱；试管 6 支、试管架；加样枪、加样枪架。1.3 试验步骤1.3.1 试验流程溶液混合滴加碱性硫酸铜静置 10min参加 Folin-酚试剂水浴 10min比色测定绘图取结果1.3.2 试验步骤步骤操作取 6 只干净的试管，利用加样枪按要求量取相应量的溶液， 混合均匀各试管的需参加的试剂和量见下表：123456牛血清蛋白质标准液00.20.40.60.80样品液000000.5蒸馏水1.00.80.60.40.20.5（1） 反响体系设置试剂空白管标准管样品管每隔一分钟，依次往 1 号试管到 6 号试管中参加 2mL 的碱性（2） 双缩脲反响 硫酸铜溶液，摇匀并记录每支试管的参加硫酸铜时间，室温静置 10min将静置时间到达 10min 中的试管中，参加 0.20mL 的Folin-（3） Folin-酚反响酚试剂，快速摇匀一般在 2s 以内。在 40 0C 下水浴加热 10min 钟同样需计时。10min 钟后取出冷却至室温。转动波长旋钮，调制 500.0nm，按“mode”键切换到 T 档， 分别将1-6 号试管中混合液放入比色杯中利用1 号试管为空（4） 比色测定白，校置 100；调至 A 档，依次测定 2-6 试管的吸光度，并读取数据。重复操作，再读取数据 2 次，并记录。数据表格见表 1利用测得的数据，绘制以 A值为纵坐标，牛血清清蛋白标500（5） 绘制标准曲线 准液浓度为横坐标的预备曲线，具体绘制利用 excel 制作，结果可见图 2依据样品管6 管的吸光度值，在标准曲线中找到对应的蛋白质浓度，再乘以稀释倍数300，得出每毫升未稀（6） 测样品蛋白质含量释血清含蛋白质的微克数，即每毫升血清中蛋白质的微克数(mg/ml)。血清蛋白浓度( g/ml) = 样品蛋白质浓度×2×300参考：正常人血清蛋白浓度范围为 6080 g/L。1.3.3 留意事项试剂要求：试验所需的试剂必需是颖配制，不然会存在被空气及其他物质氧化复原的状况，干扰试验的测定。掌握时间：Lowry 反响的显色随时间不断加深，因此各项操作必需准确掌握时间。严格依据试验步骤的操作，规定的时间是多少就多少。水浴时间也不宜过长。同时， 在最终从水浴加热后取出冷却后，需准时的进展比色测定。防止混合液中物质发生系列变化和反响。参加 Folin-酚试剂后，需要马上混合摇匀，防止磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏。干扰物质的影响：凡干扰双缩脲反响的基团，均可干扰 Folin-酚反响。这些物质在所测样品中含量较高时，则需做校正曲线。假设所测的样品中含硫酸铵，则需增加碳酸钠氢氧化钠浓度即可显色测定。假设样品酸度较高，也需提高碳酸钠氢氧化钠浓度 12 倍，这样即可订正显色后色浅的弊病。绘制曲线要求：作过原点的直线或光滑连续的曲线，该线表示试验点的平均变动状况，因此该线不需全部通过各点，但应尽量使未经过线上的试验点均匀分布在曲线或直线两侧。(电脑 Excel 绘图，可以不考虑)操作要依据试验步骤，一步一步来，防止操作问题导致的操作误差的消灭等。二、试验记录2.1 试验条件材料及试剂：本次试验的试剂和材料均是试验室配制好的，比例和浓度同试验预习， 故不再赘述。试验时间表：总表试验步骤混合溶液 滴加溶液静置加 Folin-酚试剂、水浴消耗时间未计时10min 10min室温冷却等待比色测定27min 20min 6min附表工程时刻表试管 1试管 2试管 3试管 4试管 5试管 6加硫酸铜842”09843”20844”29845”45846”55847”55水浴852”09853”20854”29855”45856”55857”55冷却等待902”09903”22904”29905”45906”55908”00操作技巧：在这一次的试验中，关键的要点在于滴加 Folin-酚试剂的摇匀，必需快速摇匀， 保证反响优先进展。振荡试管时，振荡的正确方法是用手腕的力左右摇摆，使试管中液体混合均匀且不漏出。最终放入到水浴中加热。在分光比色的时候，测量一次后重凋零，不能连续测量等。操作失误：全部试验过程中，就消灭了一次失误，即在试管4 参加 Folin-酚试剂，充分摇匀，在放入水浴加热之间，局部液体由于磕碰而溅出。其余操作严格依据要求一步步完成，理论不存在着失误。分析：Folin-酚与液体已经混合均匀并反响，在后面的水浴加热后，只是影响到了整体的试管 4 的反响后得到的溶液量，而不影响颜色的变化及最终的比色测定，故该失误不会对试验产生测定的偏差。2.2 试验现象在滴加硫酸铜溶液后，摇匀，产生较多的黏性气泡且附着在液体外表。液体颜色变化不深。在滴加 Folin-酚试剂水浴加热后，除试管 1 为淡黄色外，其余试管均成不同的蓝色。具体看以下图：图一 水浴后各试管的状况图分析：标准液的试管中2-5蓝色不断加深，同实际的标准液的含量多少正相关， 而试管 6 的颜色不深，在 1-2 试管之间，依据试验原理初步可以判定的是：该样品液的蛋白质含量将不会在 60-80g/L 之间，而是在 0-40g/L。即试验存在肯定的问题，详见结果的分析与争论。2.3 试验原始数据本次试验原始数据是在 500nm 的波长下，各试管混合液的吸光度值，结果见下表 1表 1 500nm 波长吸光度值记录测定次数各管吸光度值A2345005610.3530.5610.7440.9380.172三、结果与争论3.1 数据处理3.1.1 利用原始数据，可得到各管的平均值：2 管： A500=0.353+0.350+0.351/3=0.3513；3 管： A500=0.561+0.562+0.562/3=0.5617；依次得到 4-6 管的吸光度值如下所示：各管吸光度值A测定次数5003.1.2 Excel 绘制蛋白质的标准曲线依据用 Excel 绘制标准曲线 PPt 所示步骤，最终得到如下结果：20.3500.5620.7440.9380.1723各管平均值A 5000.3510.5620.7430.9380.17223456各管平均值A5000.35130.56170.74370.93800.1720图 2 标准曲线图从图中我们可以看到线性方程： y = 0.0062 · x ， R2 = 0.9659将样品溶液的吸光度(即 y 值)代入方程，可得出样品浓度(即 x 值)；由相关指数值R 2 可看出误差大小。 y = 0.1720x = 0.1720 ¸ 0.0062 = 27.74m g / mL血清蛋白浓度(mg/ml) = 样品蛋白质浓度×2×300 故得血清蛋白浓度为16.65g / L 。3.2 结果由上数据处理可知，最终的待测样品的蛋白质含量为16.65g / L 。而真正的正常人血清蛋白浓度范围为 6080 g/L。因此，存在肯定问题，具体分析见 3.3 分析与争论。3.3 分析与争论首先，我们回忆了整个操作过程，在整个过程中，我们根本都是依据要求操作，并不存在着明显的操作问题。通过上面水浴加热后的图可以明显看到，结果确实应当在0-20g/L 之间。同时我们与和我们一样使用试剂的组争论后觉察，他们的结果也是在10 几左右；同时，很多组测出的结果都偏低，故可以初步判定结果的测量方式上不存在明显问题。其次，回忆全部过程的原理，我们猜测可能存在的造成结果低的状况为：在室温冷却后，试验室没有空余的分光光度计，排队时间应当是全部小组中最长的，根本花去 30 多分钟。而这也导致了最终的显色增加其具体的显色缘由可能为物质间的简单反响导致从而使得最终的标准曲线的斜率增大，导致测定的标准的样品液蛋白质含量的下降。即 A<B,如下图：吸光值样品液吸光值增色反响增加后的标准曲线原本的标准曲线AB蛋白质含量分光光度计的比色杯清楚不干净，存在蒸馏水的稀释，且稀释的总体效果是使样品液的含量测定下降。开头试验的试管清洗的不充分，可能存在局部的杂质，导致显色反响的增加。分光光度计的几个比色杯透亮面被遇到，影响到了液体的吸光度，吸光度的下降， 使得样品液的测定值偏低。最终，有可能在以后的时间里，可以重做该试验，从多方面来验证自己的分析。多和教师同学沟通，得到较好的结果3.4 复习思考题参考资料来源：生物化学与分子生物学试验技术王晓华，朱文渊主编1、试述Folin-酚试剂法的优点？答：依据所学及所查学问，优点总结如下：测定蛋白质灵敏度高，较为准确，可检测最低蛋白质量达 5 m g ，通常范围为：20250m g 在生物化学领域应用广泛。操作虽受时间限定，但是只需参加两种试剂，即可起作用，总体上说，操作简洁， 原理清楚易懂。适用性广，除测定蛋白质的含量，还可特定的适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。2、应用本方法有哪些干扰作用？为什么？应如何留意？答:对双缩脲反响有干扰的离子，同样干扰 Lowry 反响，且影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris 缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。缘由是：Lowry 反响的第一步即是双缩脲反响，即为之根底。需要尽可能地降低杂质的影响，严格掌握试验时间，提高反响的效率。浓度较低的尿素(质量分数为 05)、硫酸钠(质量分数为 1)、硝酸钠(质量分数为 1)、三氯乙酸(质量分数为 05)、乙醇(体积分数为 5)、乙醚(体积分数为 5)、丙酮(体积分数为 05)等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必需作校正曲线。含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠一氢氧化钠溶液，即可显色测定，假设样品酸度较高， 显色后会色浅，则必需提高碳酸钠一氢氧化钠溶液的浓度 12 倍。