(8.3.1)--7-3细菌生化鉴定实验.ppt
模块三模块三 细菌生化鉴定实验细菌生化鉴定实验细菌的生化试验细菌的生化试验细菌的生化试验细菌的生化试验 用用生化的方法来检测细菌生化的方法来检测细菌对各种基质的代谢作用及代谢对各种基质的代谢作用及代谢产物产物，借以鉴别细菌种类，这种生化试验称为细菌的生化反，借以鉴别细菌种类，这种生化试验称为细菌的生化反应试验；是应试验；是鉴别细菌鉴别细菌的重要依据的重要依据 。常常见见的的生生化化反反应应碳水化合物碳水化合物代谢试验代谢试验碳源和氮源碳源和氮源利用试验利用试验蛋白质和氨基蛋白质和氨基酸代谢试验酸代谢试验各种酶类试验各种酶类试验糖发酵试验糖发酵试验甲基红试验（甲基红试验（MRMR）V-PV-P试验试验柠檬酸盐柠檬酸盐利用试验利用试验吲哚试验吲哚试验硫化氢试验硫化氢试验IMViCIMViC试验试验试验试验硝酸还原酶试验硝酸还原酶试验，淀粉水解试验淀粉水解试验一、糖发酵试验一、糖发酵试验 根据细菌根据细菌分解利用糖能力的差异分解利用糖能力的差异表现表现出是否产酸产气作为鉴定菌种的依据。出是否产酸产气作为鉴定菌种的依据。各种糖各种糖细菌细菌有机酸有机酸（乳酸、醋酸、丙酸等）（乳酸、醋酸、丙酸等）气体气体 （氢气，二氧化碳等）（氢气，二氧化碳等）产酸：产酸：指示剂指示剂 （溴甲酚紫），由紫色（溴甲酚紫），由紫色（pH6.8以上以上)变为黄色变为黄色（pH5.4以下以下)产气产气 倒置的德汉氏小管倒置的德汉氏小管二、二、IMViC试验试验l 是一组试验；是一组试验；l l IMViCIMViC是靛基质试验或称是靛基质试验或称吲哚试验吲哚试验（I I）、）、甲甲基红试验基红试验（M M）、）、V-PV-P试验试验（V V）和）和柠檬酸盐利柠檬酸盐利用试验用试验（C C）的缩写，）的缩写，i i是为了发音的需要加上是为了发音的需要加上的；的；l常用于革兰氏阴性的肠道细菌检测中，可用于常用于革兰氏阴性的肠道细菌检测中，可用于区分产气杆菌属和大肠杆菌属。区分产气杆菌属和大肠杆菌属。1、吲哚（、吲哚（靛基质靛基质）试验）试验 原理原理 色氨酸色氨酸几乎存在所有蛋白质中，几乎存在所有蛋白质中，某些细菌如大肠杆某些细菌如大肠杆菌等具有菌等具有色氨酸酶色氨酸酶。蛋白胨中的蛋白胨中的色氨酸色氨酸色氨酸酶色氨酸酶靛基质靛基质（无色无色吲哚）吲哚）吲哚试剂吲哚试剂（对二甲基氨基苯甲醛对二甲基氨基苯甲醛）玫瑰吲哚玫瑰吲哚（阳性反应）（阳性反应）2、V-P试验试验 原理原理 葡萄糖葡萄糖丙酮酸丙酮酸缩合缩合乙酰乳酸乙酰乳酸脱羧脱羧乙酰甲基甲醇乙酰甲基甲醇碱性条件碱性条件二乙酰二乙酰与培养基中精氨酸与培养基中精氨酸的胍基结合的胍基结合红色红色化合物（阳性反应）化合物（阳性反应）3、MR试验试验 原理原理 葡萄糖葡萄糖丙酮酸丙酮酸大量混合酸大量混合酸pH值降至值降至4.5以下以下培养基培养基变红变红(阳性反应阳性反应)甲基红指示剂甲基红指示剂非酸性末端产物非酸性末端产物(醇、醛等）醇、醛等）pH值值6 6.2甲基红指示剂甲基红指示剂培养基培养基橘黄色橘黄色(阴性反应阴性反应)4、柠檬酸盐柠檬酸盐(利用利用)试验试验 原理原理 柠檬酸盐柠檬酸盐产气杆菌利用为产气杆菌利用为C源源产生碱性物质产生碱性物质培养基培养基绿色变为深蓝绿色变为深蓝色色 (阳性反应阳性反应)1%溴麝香草酚蓝指示剂溴麝香草酚蓝指示剂pH值升高值升高淀粉淀粉淀粉淀粉三、淀粉水解试验三、淀粉水解试验 原理原理 检测细菌是否可以产生分泌到胞外的检测细菌是否可以产生分泌到胞外的淀粉酶淀粉酶。淀粉酶淀粉酶糊精，双糖和单糖等糊精，双糖和单糖等碘液碘液不出现蓝色反应，菌落不出现蓝色反应，菌落周围呈现透明圈周围呈现透明圈蓝色蓝色四、硫化氢试验四、硫化氢试验 原理原理 含硫有机物（含硫有机物（胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸）产生产生H H2 2S S黑色的硫化铅或硫化铁黑色的硫化铅或硫化铁(阳性反应阳性反应)培养基中铅培养基中铅盐或铁盐盐或铁盐 实验材料实验材料实验材料实验材料 培养基：培养基：葡萄糖发酵培养基，乳糖发酵培养基，葡萄糖发酵培养基，乳糖发酵培养基，葡萄糖蛋白胨水培养基，蛋白胨水培养葡萄糖蛋白胨水培养基，蛋白胨水培养 基，固体淀粉培养基。基，固体淀粉培养基。菌种菌种：大肠杆菌，枯草杆菌，普通变形菌，产气：大肠杆菌，枯草杆菌，普通变形菌，产气 肠杆菌肠杆菌试剂试剂：卢戈氏碘液，甲基红指示剂，：卢戈氏碘液，甲基红指示剂，40%KOH40%KOH，5%-5%-萘酚，吲哚试剂，萘酚，吲哚试剂，1.6%1.6%溴甲酚紫溴甲酚紫仪器：仪器：略略 方法和步骤方法和步骤方法和步骤方法和步骤 1 1、试管（平板）标记试管（平板）标记 葡萄糖发酵管葡萄糖发酵管乳糖发酵管乳糖发酵管吲哚试验管吲哚试验管V-P试验管试验管淀粉水解试验平板：淀粉水解试验平板：4个个各各 9支支用记号笔或者标签纸在平板底用记号笔或者标签纸在平板底部划成或者区分为部划成或者区分为 2 2 部分部分 2 2、接种培养、接种培养 试管接种试管接种：以：以无菌操作无菌操作分别接种少量待测菌到以上相应试管分别接种少量待测菌到以上相应试管中，每菌接中，每菌接2 2支管支管,留留1 1管作空白对照不接种，置管作空白对照不接种，置3737恒温箱中恒温箱中培养培养242448h48h。葡萄糖和乳糖微量发酵管接种葡萄糖和乳糖微量发酵管接种:采用接种针采用接种针平板接种：平板接种：以无菌操作分别接种少量待测菌到以上相应平板以无菌操作分别接种少量待测菌到以上相应平板中中,每平板接每平板接2种菌种菌,将平板倒置在将平板倒置在 3737温箱中培养温箱中培养 24h.24h.确定有无细菌生长确定有无细菌生长？确定各菌对糖的分解利用情况：确定各菌对糖的分解利用情况：不利用：用不利用：用 “”表示表示产酸：产酸：用用 “+”表示表示产酸产气：产酸产气：用用 表示表示3 3、观察记录（观察记录（直接观察记录或加入试剂反应后再观察记录直接观察记录或加入试剂反应后再观察记录）糖发酵试验（糖发酵试验（糖发酵试验（糖发酵试验（直接观察记录直接观察记录）1、确定有无细菌生长？确定有无细菌生长？2、向蛋白胨水培养液内加入向蛋白胨水培养液内加入乙醚乙醚1-2mL，用力振荡，静置，用力振荡，静置分层后，分层后，沿管壁缓缓加入沿管壁缓缓加入5-10滴滴吲哚试剂，吲哚试剂，若上层乙醚层若上层乙醚层呈呈玫瑰红玫瑰红色者，为吲哚试验反应阳性。色者，为吲哚试验反应阳性。吲哚（吲哚（吲哚（吲哚（靛基质靛基质靛基质靛基质）试验）试验）试验）试验3 3、“+”表示阳性反应，表示阳性反应，“-”表示阴性反应。表示阴性反应。1 1、确定有无细菌生长？并用空试管将、确定有无细菌生长？并用空试管将葡萄糖蛋白胨水培养液分葡萄糖蛋白胨水培养液分为为2半；半；2 2、将其中、将其中1 1半葡萄糖蛋白胨水培养液内加入半葡萄糖蛋白胨水培养液内加入5-10滴滴 40%KOH，然后加入然后加入等量的等量的 5%-萘酚溶液萘酚溶液，用力振荡，再放入，用力振荡，再放入 3737温箱温箱中保温中保温 15-30min15-30min。若培养物呈。若培养物呈红色红色者，为者，为VP VP 试验反应阳性试验反应阳性V-PV-PV-PV-P试验试验试验试验3 3、“+”表示阳性反应，表示阳性反应，“-”表示阴性反应。表示阴性反应。1 1、将另一半葡萄糖蛋白胨水培养液内加入、将另一半葡萄糖蛋白胨水培养液内加入甲甲基红试剂基红试剂 2 2 滴滴，培养基变为，培养基变为红色红色者为阳性，变黄者为阳性，变黄色者为阴性。色者为阴性。MR试验试验2 2、“+”表示阳性反应，表示阳性反应，“-”表示阴性反应。表示阴性反应。1 1、观察各种细菌的生长情况；、观察各种细菌的生长情况；2 2、将平板打开盖子，、将平板打开盖子，滴入少量碘液于平皿中滴入少量碘液于平皿中，轻轻旋转平板，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板。如菌苔周围出现无色透明圈，说明使碘液均匀铺满整个平板。如菌苔周围出现无色透明圈，说明淀粉己被水解，为阳性。透明圈的大小可初步判断该菌水解淀淀粉己被水解，为阳性。透明圈的大小可初步判断该菌水解淀粉能力的强弱，粉能力的强弱，即产生胞外淀粉酶活力的高低。即产生胞外淀粉酶活力的高低。3 3、“+”表示产生淀粉酶，水解淀粉，无蓝色反应；表示产生淀粉酶，水解淀粉，无蓝色反应；“-”表示阴性结果，即培养基变蓝色。表示阴性结果，即培养基变蓝色。淀粉水解试验淀粉水解试验淀粉水解试验淀粉水解试验 思考题思考题 2 2、你怎样解释淀粉酶是胞外酶而非、你怎样解释淀粉酶是胞外酶而非胞内酶？胞内酶？3 3、不利用碘液你怎样证明淀粉水解的存在、不利用碘液你怎样证明淀粉水解的存在？1 1、讨、讨论论 IMViC 试验在微生物学检验上的试验在微生物学检验上的意义？意义？
