RNAi作用机制.ppt
RNAi作用机制RNAi机制机制外源外源病毒病毒转座子座子目目标识别内切内切酶切割目切割目标外切外切酶降解降解RNA RdRP合成合成RNA激活的激活的siRNA复合物复合物双双链siRNA异常异常ssRNARdRP合成合成RNA二二级siRNA Dicer定位于胞浆中，但核内mRNA剪切修饰后，向核外运输过程中也存在RNAi现象，可能有其他类似功能的酶发挥作用。现认为2125nt大小在3端带有23个碱基悬端和5端磷酸化的siRNA诱导的RNAi效应最强。19 nt duplex2 nt 3 overhangssiRNAs have a defined structure siRNA具有低分子质量、低浓度、沉默信号可在细胞间传递甚至传播至整个有机体以及可遗传等特点。而大于30bp的dsRNA可引起机体非特异性干扰素样反应和蛋白激酶(PKR)的激活而使其被降解，从而大大减少了其对mRNA的抑制作用。在RNAi启始过程中发挥酶切作用的Dicer酶属于RNase核糖核酸酶家族中的第三个家族，该家族的RNase含有两个催化结构域，一个螺旋酶及PAZ模体(motif)，其功能是特异地将dsRNA降解成siRNA，因此，Dicer酶被认为是启动RNAi效应的关键。然而，令人费解的是，为什么Dicer酶的降解产物是21nt23nt的siRNA呢?最近对RNase催化结构域的结构的研究使其真相大白。Dicer Dicer 一种核酸酶,负责将dsRNA 转化为siRNA：它属于RNase 家族,具有两个催化结构域、一个解旋酶(helicase)结构域和一个PAZ(Piwi/Argonaute/Zwille)结构域,Dicer 在催化过程中以二聚体的形式出现,其催化结构域在dsRNA 上反平行排列,形成四个活性位点,但只有两侧的两个位点有内切核酸酶活性,这两个位点在相距约22bp 的距离切断dsRNA,各种生物体内Dicer结构略有不同,致使siRNA 长度存在微小差别。DicerModels for Dicer cleavage启始阶段启始阶段加工加工酶加工成加工成21-23核苷酸片段核苷酸片段DicerRISCmRNA被核酸外切酶或核酸内切酶降解被核酸外切酶或核酸内切酶降解 siRNA的形成的形成siRNADicerRISC(2)RNA诱导的沉默复合物形成阶段诱导的沉默复合物形成阶段 生成的siRNA和RNAi特异性酶，如AGO-2、MUT-7、RED-1、PAZ蛋白和DNA-RNA螺旋酶结合形成RISC（RNA-induced silencing complex），具有序列特异性核酸内、外切酶和解旋酶活性，能特异地降解与siRNA同源的靶mRNA。RNA诱导的沉默复合物诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)(3)效应阶段效应阶段 siRNA引导RISC与同源性的mRNA结合，在ATP及解旋酶(如Rde-3、MUT-6、MUT-14)的作用下使siRNA链解离，并使RISC由250X103大小的前体形式变成约100X103左右活性形式，同时解旋酶催化同源mRNA与siRNA的正义链互换，核酸酶在mRNA与反义RNA所形成的双链区的5起始端下游710个核苷酸处切断mRNA，起到特异地抑制基因表达的效果。效应阶段效应阶段mRNA被核酸外切被核酸外切酶或核酸内切或核酸内切酶降解降解解旋解旋酶核酸外切核酸外切酶同源性同源性检索活性索活性核酸内切核酸内切酶RISC 在这些机制中，在这些机制中，RISC是一个很是一个很灵活的平台，在不同的情况下结合不灵活的平台，在不同的情况下结合不同的调节分子从而具有不同的功能。同的调节分子从而具有不同的功能。RISC复合物的核心负责接受从复合物的核心负责接受从Dicer加工来的小加工来的小RNA，并用该小，并用该小RNA作作为识别其同源底物的向导从而介导为识别其同源底物的向导从而介导RNAi的发生。的发生。RISC（RNA-induced Silencing Complex）解旋酶核酸内切酶Argonaute proteinsiRNAmRNA250KD(inactive)100KD(active)ATP4/16/2023(4)扩增阶段扩增阶段 该反应以siRNA中的一条链为引物，以靶mRNA为模板，在RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP)作用下，扩增靶mRNA，产生新的二级siRNA，而这些siRNA又能继续反作用于靶mRNA。RdRP不仅能增加siRNA的拷贝数，而且能将异常的单链RNA转变为dsRNA。RdRP还是一个重要的“感应器”，它能识别正常和异常的RNA。转基因RNA和病毒RNA都在RdRP的识别下启动RNAi的反应过程。RNAi扩大效应扩大效应 目前，对这些现象的解释至少有目前，对这些现象的解释至少有四种机制：四种机制：Dicer酶将长dsRNA分子切成短的“初级siRNA”，再由后者降解同源的mRNA，故dsRNA的长度决定了放大效应的水平；siRNA在酶作用中，可多次利用，能进一步提供放大的信号；移行RNAi(transitive RNAi)中，siRNA可作为靶mRNA的引物，在RdRP和Dicer等的作用下产生“次级siRNA”，导致沉默信号的扩增。“异常RNA”(aberrant RNA)无需引物，可在RdRP的作用下生成dsRNA，并由Dicer酶切生成siRNA。以上四种机制中，尤其是移行RNAi的发现为阐明沉默效应的扩增及传递提供了重要线索。移行移行RNAi 移行RNAi是指沉默信号沿特定基因的移动。即沉默信号沿特定的mRNA由3 5方向移动，这就是“移行RNAi”。在移行RNAi中新生成的siRNA并非直接来自导入的dsRNA，而是在细胞中RdRP的作用下，以初级siRNA的反义链为引物，以靶mRNA为模板，生成dsRNA，随后在Dicer酶及ATP的作用下产生新的siRNA，称为次级siRNA。除RdRP通过产生次级siRNA参与RNAi信号扩增外，其他与RdRP具有同源序列的蛋白类似物也通过相同的方式产生次级siRNA参与沉默信号的扩增。此外，RNAi的扩增效应还可能存在另外两种机制：(1)Dicer将长dsRNA切成初级siRNA，这一放大水平取决于dsRNA的长度；(2)siRNA在酶的作用下可以多次应用，产生进一步的放大效应。此此课件下件下载可自行可自行编辑修改，修改，仅供参考！供参考！感感谢您的支持，我您的支持，我们努力做得更好！努力做得更好！谢谢!
