高三生物一轮复习课件：动物细胞工程.pptx

专题专题2 2 细胞工程细胞工程 2.2 2.2 动物细胞工程动物细胞工程动物细胞工程常用的技术手段：动物细胞工程常用的技术手段：l动物细胞培养动物细胞培养l动物细胞核移植动物细胞核移植l动物细胞融合动物细胞融合l生产单克隆抗体等生产单克隆抗体等1 1、概念、概念 P P4444 2 2、目的：、目的：3 3、原理：、原理：一、动物细胞培养一、动物细胞培养 从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后然后,放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。获得获得细胞细胞或或细胞产物细胞产物；不能获得完整动物个体不能获得完整动物个体。细胞增殖细胞增殖（有丝分裂有丝分裂）剪碎组织剪碎组织 制成细胞悬液制成细胞悬液转入培养转入培养液中进行液中进行原代培养原代培养贴满瓶壁的细胞用贴满瓶壁的细胞用胰蛋白酶分散成单胰蛋白酶分散成单个细胞，个细胞，分瓶培养分瓶培养转入培养液中转入培养液中进行进行传代培养传代培养原代培养和传代培养都要放原代培养和传代培养都要放在在二氧化碳培养箱二氧化碳培养箱中培养中培养4 4、动物细胞培养的动物细胞培养的过程过程取健康动物组织块取健康动物组织块用用胰蛋白酶胰蛋白酶处理处理分散成单个细胞分散成单个细胞细胞贴壁，接触抑制细胞贴壁，接触抑制动物动物胚胎胚胎或或幼龄幼龄动物的组织、器官动物的组织、器官细胞悬液细胞悬液1010代细胞代细胞无限传代无限传代单个细胞单个细胞加培养液加培养液剪碎、剪碎、胰蛋白酶胰蛋白酶（或胶原蛋白酶）（或胶原蛋白酶）胰蛋白酶胰蛋白酶5050代细胞代细胞原代培养原代培养传代培养传代培养分裂旺盛、分化程度低，易培养分裂旺盛、分化程度低，易培养使细胞与培养液充分接触，使细胞与培养液充分接触，有利于进行物质交换。有利于进行物质交换。细胞贴壁细胞贴壁，接触抑制接触抑制分瓶分瓶培养培养细胞贴壁细胞贴壁：动物细胞生长的特点动物细胞生长的特点悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上。悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上。培养瓶或培养皿内表面光滑、无毒、易于贴附。培养瓶或培养皿内表面光滑、无毒、易于贴附。要求：要求：接触抑制接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触相互接触时，细胞就会时，细胞就会停止分裂增殖停止分裂增殖。贴壁贴壁接触抑制接触抑制 瓶壁上的细胞层数是：瓶壁上的细胞层数是：一层一层（或（或单层单层）！）！l原代培养原代培养：通常将动物组织经胰蛋白酶消化后的：通常将动物组织经胰蛋白酶消化后的初次初次培养培养称为原代培养。称为原代培养。l传代培养传代培养：贴满瓶壁的细胞贴满瓶壁的细胞,出现接触抑制后，需要重出现接触抑制后，需要重新用胰蛋白酶等处理，然后新用胰蛋白酶等处理，然后分瓶分瓶继续培养，让细胞增继续培养，让细胞增殖。这样培养过程为传代培养。殖。这样培养过程为传代培养。l分类：分类：1010代内的细胞；代内的细胞；10-5010-50代；代；5050代以后。代以后。P P4 45 5有关概念：有关概念：目前使用的或冷冻保存的目前使用的或冷冻保存的正常细胞通常在正常细胞通常在1010代以内代以内的原因？的原因？10-5010-50代：部分细胞代：部分细胞二倍体核型改变二倍体核型改变，遗传物质一般不会发生改变遗传物质一般不会发生改变。5050代以后：少部分细胞的代以后：少部分细胞的遗传物质发生改变遗传物质发生改变，能继续传代，获得不死，能继续传代，获得不死性，这些细胞已经发生了突变，正在朝着等同于癌细胞的方向发展。性，这些细胞已经发生了突变，正在朝着等同于癌细胞的方向发展。1010代以内的细胞：代以内的细胞：能保持能保持正常的二倍体核型正常的二倍体核型，遗传物质不改变遗传物质不改变。1 1、用胰蛋白酶分散细胞，由此可说明细胞间的物质主要是什么成分、用胰蛋白酶分散细胞，由此可说明细胞间的物质主要是什么成分？2 2、胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗？为什么？、胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗？为什么？3 3、能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？、能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？4 4、动物培养能否最终培养成新个体？、动物培养能否最终培养成新个体？说明细胞间的物质主要是说明细胞间的物质主要是蛋白质蛋白质。胰蛋白酶除了消化细胞间的蛋白质外，长时间的作用也会消化胰蛋白酶除了消化细胞间的蛋白质外，长时间的作用也会消化细胞膜上的蛋白质，因此必须细胞膜上的蛋白质，因此必须控制好控制好胰蛋白酶的胰蛋白酶的消化时间消化时间。不能，因为动物细胞培养适宜的不能，因为动物细胞培养适宜的PHPH为为7.27.47.27.4，此环境下胃蛋，此环境下胃蛋白酶（白酶（2.02.0）没有活性，而）没有活性，而胰蛋白酶胰蛋白酶(7.2-8.4)(7.2-8.4)的活性较高。的活性较高。P P4444 思考思考不能，只能使不能，只能使细胞数目增多细胞数目增多，不能发育成新的动物个体。，不能发育成新的动物个体。5 5、动物细胞培养的条件、动物细胞培养的条件无菌、无毒的环境无菌、无毒的环境 温度和温度和pHpH：36.50.536.50.5；pHpH 7.2-7.47.2-7.4气体环境气体环境：COCO2 2培养箱培养箱（95%95%空气空气 +5%CO5%CO2 2 ）营养营养：培养液和培养用具培养液和培养用具无菌处理无菌处理添加一定量的抗生素添加一定量的抗生素定期更换培养液定期更换培养液O O2 2 细胞代谢所必需细胞代谢所必需COCO2 2 维持维持培养液的培养液的pHpH葡萄糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等葡萄糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等动物血清、血浆动物血清、血浆为什么对动物细胞进行培养时通常要添加血清？为什么对动物细胞进行培养时通常要添加血清？血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等多种营血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等多种营养，血清还含有多种未知的促细胞生长因子、促贴附因子养，血清还含有多种未知的促细胞生长因子、促贴附因子及其他活性物质，能及其他活性物质，能促进细胞的生长、增殖和贴附。因此，促进细胞的生长、增殖和贴附。因此，细胞培养时，要保证细胞能够顺利生长和增殖，一般需添细胞培养时，要保证细胞能够顺利生长和增殖，一般需添加加10%10%20%20%的血清。的血清。P46 思考：思考：6 6、动物细胞培养技术的应用、动物细胞培养技术的应用:（1 1）生产生物制品）生产生物制品如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体（2 2）应用于基因工程）应用于基因工程 提供基因工程受体细胞提供基因工程受体细胞（3 3）检测有毒物质，判断某种物质的毒性）检测有毒物质，判断某种物质的毒性 （4 4）细胞的生理、药理、病理研究）细胞的生理、药理、病理研究 用于筛选抗癌药物用于筛选抗癌药物 植物组织培养和动物细胞培养的比较植物组织培养和动物细胞培养的比较比较项目比较项目植物组织培养植物组织培养动物细胞培养动物细胞培养原理原理培养基性质培养基性质培养基特有成分培养基特有成分培养结果培养结果用途用途植物细胞的全能性植物细胞的全能性细胞增殖细胞增殖固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基蔗糖蔗糖、植物激素植物激素葡萄糖葡萄糖、动物血清动物血清快速繁殖名贵花卉和果树；快速繁殖名贵花卉和果树；培养无病毒植株、转基因培养无病毒植株、转基因植物；植物；大规模生产细胞产品，如大规模生产细胞产品，如药物、食品添加剂、香料、药物、食品添加剂、香料、色素等色素等大量产生大量产生细胞细胞或或细胞产物细胞产物获得获得新个体新个体或或细胞产品细胞产品生产蛋白质制品，如病生产蛋白质制品，如病毒疫苗、干扰素、单克隆毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等；抗体等；检测有毒物质；检测有毒物质；研究生理、药理、病理研究生理、药理、病理二、二、动物体细胞核移植技术和克隆动物动物体细胞核移植技术和克隆动物1 1、概念：、概念：将动物的一个细胞的将动物的一个细胞的细胞核细胞核，移入一个已经，移入一个已经去掉细胞核去掉细胞核的卵母细胞的卵母细胞中，使其重组并发育成一个中，使其重组并发育成一个新的胚胎新的胚胎，这个新的，这个新的胚胎最终发育为动物胚胎最终发育为动物个体个体。用核移植的方法得到的动物称为用核移植的方法得到的动物称为克隆动物克隆动物。3 3、分类：、分类：胚胎细胞核移植胚胎细胞核移植（细胞分化程度低，恢复全能性容（细胞分化程度低，恢复全能性容易易）体细胞核移植体细胞核移植（细胞分化程度高，恢复全能性困（细胞分化程度高，恢复全能性困难难）2 2、原理：、原理：动物动物细胞核细胞核具有全能性具有全能性 美国威斯康星洲的奶牛场有一头高美国威斯康星洲的奶牛场有一头高产奶牛叫产奶牛叫“卢辛达卢辛达”,年产奶量为年产奶量为30.830.8吨吨,而我国奶牛年平均产奶量仅为而我国奶牛年平均产奶量仅为3-43-4吨。如吨。如何通过体细胞核移植技术克隆高产奶牛何通过体细胞核移植技术克隆高产奶牛“卢辛达卢辛达”?（M中期的卵母细胞中期的卵母细胞）减数第二次分裂中期减数第二次分裂中期去核的卵母细胞去核的卵母细胞供体细胞注入供体细胞注入去核卵母细胞去核卵母细胞用物理方法或化学方法用物理方法或化学方法（如电脉冲、钙离子载体、（如电脉冲、钙离子载体、乙醇、蛋白酶合成抑制剂乙醇、蛋白酶合成抑制剂等）激活受体细胞使其完等）激活受体细胞使其完成细胞分裂和发育过程成细胞分裂和发育过程胚胎移植胚胎移植代孕牛子宫代孕牛子宫克隆牛克隆牛4 4、过程：、过程：显微操作法显微操作法,用微型吸管析用微型吸管析出细胞核和第一极体出细胞核和第一极体电刺激使细胞融合电刺激使细胞融合体细胞核移植过程体细胞核移植过程供体细胞供体细胞（供核）（供核）细胞培养细胞培养体细胞体细胞卵母细胞卵母细胞 （M期：供质）期：供质）去核去核去去核卵母细胞核卵母细胞注注 入入细胞融合细胞融合重组细胞重组细胞重组重组胚胎胚胎胚胎移植胚胎移植代孕母体代孕母体与供体奶牛遗传与供体奶牛遗传基础相同的犊牛基础相同的犊牛激激活活共分成两大阶段：共分成两大阶段：核移植核移植和和胚胎移植胚胎移植 发育到桑椹胚发育到桑椹胚或者囊胚阶段或者囊胚阶段时可以进行胚时可以进行胚胎移植胎移植应用的技术：应用的技术：动物细胞培养技术动物细胞培养技术、细胞核移植技术细胞核移植技术、早期胚胎培养技术早期胚胎培养技术、胚胎移植技术胚胎移植技术 10 10代以内的细胞能保持正常的二倍体核型代以内的细胞能保持正常的二倍体核型,保证了供体细胞保证了供体细胞正常的遗传基础。正常的遗传基础。思考：思考：（1 1）供体细胞为什么一般选用传代）供体细胞为什么一般选用传代1010代以内的细胞？代以内的细胞？（2 2）选择）选择卵母细胞做受体细胞的原因是什么？卵母细胞做受体细胞的原因是什么？a a卵母细胞体积大，便于操作；卵母细胞体积大，便于操作；b b卵黄多，营养物质丰富；卵黄多，营养物质丰富；c c细胞质中含有促使细胞核全能性表达的物质。细胞质中含有促使细胞核全能性表达的物质。减减中期的卵母细胞中期的卵母细胞 不是，克隆动物绝大部分不是，克隆动物绝大部分DNADNA来自供体细胞核，但核外还有少部来自供体细胞核，但核外还有少部分分DNADNA（如（如线粒体线粒体DNADNA）来自受体卵母细胞；在发育过程中可能发生）来自受体卵母细胞；在发育过程中可能发生基因突变基因突变导致性状改变；此外，还会受到不同导致性状改变；此外，还会受到不同环境环境的影响。的影响。（3 3）你认为用上述体细胞核移植方法生产的克隆动物，是对体细你认为用上述体细胞核移植方法生产的克隆动物，是对体细胞供体动物进行了胞供体动物进行了100%100%的复制吗？为什么？的复制吗？为什么？克隆动物的性别取决于？克隆动物的性别取决于？供核个体供核个体 19961996年年7 7月月5 5日诞生的克隆羊日诞生的克隆羊“多莉多莉”标志着一种新的生物技术标志着一种新的生物技术的面世，它是世界上第一例经体细胞核移植出生的动物，是克隆技的面世，它是世界上第一例经体细胞核移植出生的动物，是克隆技术领域研究的巨大突破。这一巨大进展意味着：在理论上证明了，术领域研究的巨大突破。这一巨大进展意味着：在理论上证明了，同植物细胞一样，分化了的动物细胞核也具有全能性，同植物细胞一样，分化了的动物细胞核也具有全能性，“多莉多莉”的的培育过程是怎样的？培育过程是怎样的？(1)(1)以上过程的原理是以上过程的原理是_。(2)(2)由由于于控控制制毛毛色色的的基基因因位位于于细细胞胞核核中中，因因此此“多多利利”的的面面部部毛毛色色应应与与_相同，即为相同，即为_色。色。(3)(3)克隆羊克隆羊“多利多利”的性别为的性别为_。动物细胞核具有全能性动物细胞核具有全能性核供体甲核供体甲白白雌雌性性（1 1）加速家畜遗传改良的进程）加速家畜遗传改良的进程（2 2）保护濒危物种）保护濒危物种（3 3）生产医用蛋白质）生产医用蛋白质（4 4）转基因克隆动物作为异种移植的供体）转基因克隆动物作为异种移植的供体（5 5）人核移植胚胎干细胞诱导分化后提供）人核移植胚胎干细胞诱导分化后提供组织、器官用于移植。组织、器官用于移植。（6 6）研究克隆动物和克隆细胞，可使人类）研究克隆动物和克隆细胞，可使人类更深入了解胚胎发育及衰老过程。更深入了解胚胎发育及衰老过程。（7 7）用克隆动物做疾病模型。）用克隆动物做疾病模型。5 5、体细胞核移植技术的应用前景、体细胞核移植技术的应用前景 （2 2）绝大多数克隆动物存在健康问题并表现出遗传和生理缺陷绝大多数克隆动物存在健康问题并表现出遗传和生理缺陷（3 3）对克隆动物食品安全问题存有争议对克隆动物食品安全问题存有争议 克隆羊克隆羊“多莉多莉”生存了生存了6 6年后，因为出现了很多健康的问题比如关节年后，因为出现了很多健康的问题比如关节炎、心脏病，后来甚至患癌症，最后不得不安乐死。炎、心脏病，后来甚至患癌症，最后不得不安乐死。克隆动物我们主要获取得是肉和奶，虽然目前没有证据证明克隆动克隆动物我们主要获取得是肉和奶，虽然目前没有证据证明克隆动物食品对人体产生危害，但要端上餐桌还是应该持谨慎的态度。物食品对人体产生危害，但要端上餐桌还是应该持谨慎的态度。6 6、体细胞核移植技术存在的问题、体细胞核移植技术存在的问题（1 1）成功率比较）成功率比较低低 2.2.2 2.2.2 动物细胞融合与单克隆抗体动物细胞融合与单克隆抗体重点内容：单克隆抗体的制备过程重点内容：单克隆抗体的制备过程细胞工程细胞工程植物细胞工程植物细胞工程动物细胞工程动物细胞工程1.1.植物组织培养植物组织培养2.2.植物体细胞杂交植物体细胞杂交1.1.动物细胞培养动物细胞培养2.2.动物体细胞核移植动物体细胞核移植3.3.动物细胞融合动物细胞融合（两技术）（两技术）（三技术）（三技术）原理：原理：植物细胞的全能性植物细胞的全能性原理：原理：细胞膜的流动性细胞膜的流动性 植物细胞的全能性植物细胞的全能性原理：原理：细胞增殖细胞增殖原理：原理：动物细胞核的全能性动物细胞核的全能性原理：原理：细胞膜的流动性细胞膜的流动性比较比较比较比较应用：应用：单克隆抗体的制备单克隆抗体的制备实例实例1 1：自然条件：自然条件受精作用受精作用19701970年人工条件下的人年人工条件下的人-鼠细胞融合实验鼠细胞融合实验 实例实例2 2：人工诱导：人工诱导 结论：结论：细胞膜具有流动性细胞膜具有流动性一、动物细胞融合（细胞杂交）一、动物细胞融合（细胞杂交）一、动物细胞融合（细胞杂交）一、动物细胞融合（细胞杂交）2.2.概念概念:指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。1.1.原理原理:细胞膜的流动性细胞膜的流动性融合后形成的具有原来两个或多个融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的细胞遗传信息的单核细胞单核细胞3.3.结果结果:形成形成杂交细胞杂交细胞细胞膜融合细胞膜融合细胞质融合细胞质融合细胞核融合细胞核融合（融合成功的标志）（融合成功的标志）4.4.4.4.诱导动物细胞融合的方法诱导动物细胞融合的方法诱导动物细胞融合的方法诱导动物细胞融合的方法物理法物理法:化学法化学法:生物法生物法:离心、振动、电激离心、振动、电激等等聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）灭活的病毒灭活的病毒 （P52P52左框）灭活：用物理或化学方法左框）灭活：用物理或化学方法使之失去感染能力，但不破坏抗原结构。使之失去感染能力，但不破坏抗原结构。原理：病毒表面的糖蛋白和一些酶能够与原理：病毒表面的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。灭活的病毒黏灭活的病毒黏附于细胞表面附于细胞表面细胞膜被病毒细胞膜被病毒穿通并连接穿通并连接细胞核融合，细胞核融合，形成杂交细胞形成杂交细胞5.5.动物动物细胞融合技术的意义细胞融合技术的意义意义：意义：突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能。目前还不能定向改造生物的性状！不能培育出新物种！目前还不能定向改造生物的性状！不能培育出新物种！已成功的动物细胞融合实例有很多，如人已成功的动物细胞融合实例有很多，如人小鼠、人小鼠、人兔、人兔、人鸡、鼠鸡、鼠兔、鸡兔、鸡鼠等上百种鼠等上百种融合细胞。甚至融合细胞。甚至已成功完成了酵母菌已成功完成了酵母菌鸡、人鸡、人胡萝卜等细胞的融合。胡萝卜等细胞的融合。应用：应用：研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。特别是利用杂交瘤技术制造特别是利用杂交瘤技术制造单克隆抗体单克隆抗体。6.6.动物动物细胞融合技术的应用细胞融合技术的应用 植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较比较项目比较项目植物体细胞杂交植物体细胞杂交动物细胞融合动物细胞融合原理原理细胞融合前的处细胞融合前的处理方法理方法诱导方法诱导方法用途用途克服远缘杂交的障碍，获得克服远缘杂交的障碍，获得杂种植株杂种植株细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞膜的流动性植物细胞的全能性植物细胞的全能性去除细胞壁去除细胞壁后诱导原生质体融合后诱导原生质体融合使使细胞分散细胞分散后诱导后诱导细胞融合细胞融合物理（离心、振荡、电刺激）物理（离心、振荡、电刺激）化学（聚乙二醇）化学（聚乙二醇）物理、化学方法（同左）物理、化学方法（同左）制备单克隆抗体制备单克隆抗体灭活的病毒灭活的病毒1.1.抗体抗体：2 2.获得抗体的传统方法：获得抗体的传统方法：机体受抗原刺激后产生的、机体受抗原刺激后产生的、能与能与抗原抗原特异性结合特异性结合的的免疫球蛋白免疫球蛋白。从动物的从动物的血清血清中分离抗体中分离抗体抗原抗原吞噬细胞吞噬细胞T T细胞细胞B B细胞细胞浆细胞浆细胞抗体抗体记忆细胞记忆细胞二、二、单克隆抗体单克隆抗体温故知新温故知新（效应（效应B B细胞）细胞）从从血清血清中中分离抗体分离抗体动物动物体内体内多种多种抗体抗体抗抗原原 动物在生活中会接触多种天然抗原，虽然反动物在生活中会接触多种天然抗原，虽然反复给免疫动物注射某种抗原加强免疫，但是复给免疫动物注射某种抗原加强免疫，但是动物在免疫反应过程中，体内产生的特异性动物在免疫反应过程中，体内产生的特异性抗体种类可多达百万种以上抗体种类可多达百万种以上。因此在免疫动。因此在免疫动物血清中会有多种抗体混杂在一起。物血清中会有多种抗体混杂在一起。2 2.获得抗体的传统方法：获得抗体的传统方法：多种多种浆细胞浆细胞1.1.抗体抗体：2 2.获得抗体的传统方法：获得抗体的传统方法：机体受抗原刺激后产生的、机体受抗原刺激后产生的、能与能与抗原抗原特异性结合特异性结合的的免疫球蛋白免疫球蛋白。从动物的从动物的血清血清中分离抗体中分离抗体抗原抗原吞噬细胞吞噬细胞T T细胞细胞B B细胞细胞浆细胞浆细胞抗体抗体记忆细胞记忆细胞二、二、单克隆抗体单克隆抗体温故知新温故知新（效应（效应B B细胞）细胞）产量低产量低、纯度低纯度低、特异性差特异性差 3 3.传统方法的缺点：传统方法的缺点：克隆克隆（无性繁殖）（无性繁殖）单一的（已免单一的（已免疫的）疫的）B B淋巴细胞淋巴细胞，形成，形成细胞群细胞群，所分，所分泌的泌的特异性抗体特异性抗体。4 4.单克隆抗体的概念单克隆抗体的概念：二、单克隆抗体二、单克隆抗体动物在免疫反应的过程中，体内产生动物在免疫反应的过程中，体内产生的特异性抗体种类多达百万种以上，的特异性抗体种类多达百万种以上，但是但是每一个（已免疫的）每一个（已免疫的）B B淋巴细胞淋巴细胞只分泌一种特异性抗体只分泌一种特异性抗体。（已免疫的）（已免疫的）B B淋巴细胞淋巴细胞抗体抗体【思考思考】怎样才能获得单克隆抗体怎样才能获得单克隆抗体？体外培养的体外培养的B B淋巴细胞不可无限增殖淋巴细胞不可无限增殖哪种细胞可以无限增殖呢？哪种细胞可以无限增殖呢？骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞怎样让细胞既能大量繁殖，又能产生专一抗体？怎样让细胞既能大量繁殖，又能产生专一抗体？将将B B淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合只用动物细胞培养技术可行吗？只用动物细胞培养技术可行吗？B B细胞细胞浆细胞浆细胞（已免疫的）（已免疫的）B B淋巴细胞淋巴细胞受抗原刺激后受抗原刺激后癌细胞：具有转移能力的肿瘤细胞癌细胞：具有转移能力的肿瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞能无限增殖能无限增殖19751975年英国科学家年英国科学家米尔斯坦米尔斯坦和德国科学家和德国科学家柯勒柯勒的实验的实验一种一种B B淋巴细胞淋巴细胞只分只分泌一种特异性抗体泌一种特异性抗体杂交瘤细胞杂交瘤细胞动物细胞融合技术动物细胞融合技术动物细胞培养技术动物细胞培养技术 能大量增殖，产生大量的能大量增殖，产生大量的特异性抗体（单克隆抗体）特异性抗体（单克隆抗体）实实验验方方案案19841984年获诺贝尔奖年获诺贝尔奖多种细胞多种细胞5.5.单克隆抗体的制备过程单克隆抗体的制备过程注射特定的抗原注射特定的抗原（已免疫的）（已免疫的）B B淋巴细胞淋巴细胞 （多种）（多种）培养骨髓瘤细胞培养骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞未融合的未融合的B B细胞（多种）细胞（多种）未融合的骨髓瘤细胞未融合的骨髓瘤细胞B B细胞相互融合（多种）细胞相互融合（多种）骨髓瘤细胞相互融合骨髓瘤细胞相互融合杂交瘤细胞（多种）杂交瘤细胞（多种）注意：细胞融合是注意：细胞融合是随机的，且融合率随机的，且融合率达不到达不到100%100%6 6类细胞类细胞多个细胞融合多个细胞融合（不稳定，几乎不能成活）（不稳定，几乎不能成活）其中杂交细胞有其中杂交细胞有3 3大类：大类：融合融合脾脏（或血液）脾脏（或血液）【资料资料】细胞合成细胞合成DNA有有D和和S两种途径，其中两种途径，其中D途径能被途径能被氨基蝶呤氨基蝶呤阻断。阻断。B淋巴细胞的淋巴细胞的DNA合成途径有两种：合成途径有两种：D途径和途径和S途径。途径。骨髓瘤细胞的骨髓瘤细胞的DNA合成途径只有一种：合成途径只有一种：D途径。途径。B淋巴细胞一般不分裂增殖；骨髓瘤细胞能不断分裂增殖。淋巴细胞一般不分裂增殖；骨髓瘤细胞能不断分裂增殖。B B淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞合成合成DNADNAD途径途径S途径途径D途径途径B-瘤瘤B瘤瘤B-B瘤瘤-瘤瘤多个细胞融合（多个细胞融合（不稳定，几乎不能成活不稳定，几乎不能成活）：能合成：能合成DNA，能分裂，能分裂：能合成能合成DNA，但不能分裂，但不能分裂：不能合成不能合成DNA，不能分裂，不能分裂：能合成能合成DNA，但不能分裂，但不能分裂：不能合成不能合成DNA，不能分裂，不能分裂选择性培养基选择性培养基筛选杂交瘤细胞的机制筛选杂交瘤细胞的机制在选择性培养基中加入氨基蝶呤，在选择性培养基中加入氨基蝶呤，作用是：作用是：抑制骨髓瘤细胞的抑制骨髓瘤细胞的DNA复制复制多孔细胞培养板多孔细胞培养板1个孔/0.1ml杂交瘤细胞杂交瘤细胞（多种）（多种）多种细胞多种细胞用用“有限稀释法有限稀释法”进行筛选进行筛选用特定的用特定的选择性培养基选择性培养基进行筛选进行筛选能产生单一抗体能产生单一抗体的杂交瘤细胞的杂交瘤细胞（1种）种）特定的抗原特定的抗原（克隆化培养克隆化培养和和抗体检测抗体检测）使每个孔使每个孔不多于一个不多于一个细胞细胞，通过单一细胞，通过单一细胞培养（单克隆培养），培养（单克隆培养），保证抗体纯度保证抗体纯度多克隆抗体多克隆抗体动物细胞培养动物细胞培养抗原抗原-抗体杂交抗体杂交能产生专一抗体能产生专一抗体的杂交瘤细胞的杂交瘤细胞注射到小鼠体内注射到小鼠体内（体内培养）（体内培养）从从小鼠腹水小鼠腹水中提取中提取大量的单克隆抗体大量的单克隆抗体体外培养体外培养从从细胞培养液细胞培养液中提取中提取大量的单克隆抗体大量的单克隆抗体扩大培养扩大培养注意：注意：提取得到的单克隆抗体不能直接用于人体，因为提取得到的单克隆抗体不能直接用于人体，因为小鼠形成的抗体对人体来说是抗原，会存在排斥反应。小鼠形成的抗体对人体来说是抗原，会存在排斥反应。优点：优点：降低免疫的排斥反应降低免疫的排斥反应对鼠源抗体的改造对鼠源抗体的改造人人-鼠嵌合抗体鼠嵌合抗体鼠源抗体鼠源抗体人源抗体人源抗体人人-鼠嵌合抗体鼠嵌合抗体可变区可变区恒定区恒定区可变区：与抗原特异性结合可变区：与抗原特异性结合恒定区：同种生物的恒定区比较稳定恒定区：同种生物的恒定区比较稳定第第1 1次筛选：用次筛选：用选择性培选择性培养基养基，选出，选出杂交瘤细胞杂交瘤细胞（已免疫的）（已免疫的）第第2 2次筛选：选出次筛选：选出能产生能产生所需专一抗体的杂交瘤所需专一抗体的杂交瘤细胞细胞5.5.单克隆抗体的制备过程单克隆抗体的制备过程（解读课本（解读课本P53P53的图）的图）两次筛选的目的两次筛选的目的？多种细胞多种细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞（多种）（多种）能产生单一抗体能产生单一抗体的杂交瘤细胞的杂交瘤细胞（1 1种）种）（克隆化培养（克隆化培养和和抗体检测）抗体检测）7.7.单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用（P54P54）作为诊断试剂作为诊断试剂最广泛的用途最广泛的用途 优点：准确、高效、简易、快速优点：准确、高效、简易、快速特异性强特异性强；灵敏度高灵敏度高；能大量制备能大量制备（产量高）；（产量高）；6.6.单克隆抗体的优点（单克隆抗体的优点（P54P54）人绒毛膜促性腺激素（人绒毛膜促性腺激素（H HCGCG）由胎盘产生的糖蛋白由胎盘产生的糖蛋白,妇女尿妇女尿或血清中的或血清中的HCGHCG是妊娠的最早指标是妊娠的最早指标抗抗H HCGCG的的单克隆抗体单克隆抗体抗原抗原：优点：灵敏度高，在妊娠第优点：灵敏度高，在妊娠第8 8天可以做出诊断，准确率高天可以做出诊断，准确率高治疗疾病（癌症）和运载药物治疗疾病（癌症）和运载药物传统方法：放疗和化疗（缺点：损伤正常细胞）传统方法：放疗和化疗（缺点：损伤正常细胞）传统方法：传统方法：CTCT和核磁共振（缺点：需要肿瘤细胞长到一定大小才能诊断）和核磁共振（缺点：需要肿瘤细胞长到一定大小才能诊断）单克隆抗体诊断：用肿瘤细胞表面的蛋白质做单克隆抗体诊断：用肿瘤细胞表面的蛋白质做抗原抗原，用放射性同位素标记，用放射性同位素标记单克隆抗体单克隆抗体，抗原，抗原-抗体特异性结合，检测肿瘤细胞是否出现转移。抗体特异性结合，检测肿瘤细胞是否出现转移。诊断疾病（如肿瘤诊断疾病（如肿瘤)7.7.单克隆抗体的应用单克隆抗体的应用（P54P54）“生物导弹生物导弹”导导单克隆抗体单克隆抗体的导向作用的导向作用弹弹药物药物：杀伤癌细胞：杀伤癌细胞优势：既不损伤正常细胞，又减少了用药剂量。优势：既不损伤正常细胞，又减少了用药剂量。制成制成生物导弹生物导弹，将药物定向带到癌细胞所在的位置，在，将药物定向带到癌细胞所在的位置，在原位杀死癌细胞原位杀死癌细胞。1 1如图是制备抗体的两个途径的模式图，下列叙述正确的是如图是制备抗体的两个途径的模式图，下列叙述正确的是()()A图中获得的抗体图中获得的抗体1 1和抗体和抗体2 2结构完全相同结构完全相同B B抗体抗体1 1和抗体和抗体2 2的制备过程均涉及细胞筛选的制备过程均涉及细胞筛选C C过程所需的气体过程所需的气体O O2 2的作用是维持培养液的的作用是维持培养液的pHpHD D和和过程的原理分别是细胞增殖和碱基互补配对原则过程的原理分别是细胞增殖和碱基互补配对原则B没有内质网和高尔基体没有内质网和高尔基体经过内质网和高尔基体加工经过内质网和高尔基体加工动物细胞培养动物细胞培养COCO2 2动物细胞融合动物细胞融合转录转录逆转录逆转录cDNAcDNA构建基因表达载体构建基因表达载体导入受体细胞导入受体细胞细胞膜的流动性细胞膜的流动性2 2、利用、利用B B淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体的流程如下图所示。淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体的流程如下图所示。请据图回答问题：请据图回答问题：(1)(1)通过过程通过过程得到的得到的B B淋巴细胞在从小鼠体内分离出之前，需对淋巴细胞在从小鼠体内分离出之前，需对小鼠小鼠_。(2)(2)过程过程诱导融合运用的原理是诱导融合运用的原理是_，该过程中区，该过程中区别于原生质体融合的方法是用别于原生质体融合的方法是用_处理。处理。注射特异性抗原注射特异性抗原细胞膜具有流动性细胞膜具有流动性灭活病毒灭活病毒3 3、利用、利用B B淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体的流程如下图所示。淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体的流程如下图所示。请据图回答问题：请据图回答问题：(3)(3)过程过程至少需要通过两次筛选和克隆培养，其中第一次筛选的目的是获得至少需要通过两次筛选和克隆培养，其中第一次筛选的目的是获得_。图中。图中X X细胞具有细胞具有_的特点。单克隆抗的特点。单克隆抗体的特点是体的特点是_。(4)(4)经过筛选和克隆化培养得到杂交瘤细胞后，一般采用体内培养和体外培养两种方式经过筛选和克隆化培养得到杂交瘤细胞后，一般采用体内培养和体外培养两种方式进行培养，动物细胞的体外培养对环境条件的要求比较高，如培养液需适宜的温度、进行培养，动物细胞的体外培养对环境条件的要求比较高，如培养液需适宜的温度、_等。等。(答出两项即可答出两项即可)(5)(5)由上述过程生产出的单克隆抗体不能直接用于人体，理由是由上述过程生产出的单克隆抗体不能直接用于人体，理由是_。杂交瘤细胞杂交瘤细胞既能产生特异性抗体，又能无限增殖既能产生特异性抗体，又能无限增殖特异性强、灵敏度高、可大量制备特异性强、灵敏度高、可大量制备pHpH、动物血浆、气体环境、无菌、无毒的环境、动物血浆、气体环境、无菌、无毒的环境小鼠形成的抗体对人体来说是抗原，存在免疫排异反应小鼠形成的抗体对人体来说是抗原，存在免疫排异反应