高三生物一轮复习课件：第37讲 基因工程.pptx

现代生物科技专题现代生物科技专题概述概述基因工程基因工程蛋白质工程蛋白质工程细胞工程细胞工程胚胎工程胚胎工程生态工程生态工程五五大大工工程程相关：相关：安全问题安全问题伦理问题伦理问题 专题专题1 1 基因工程基因工程概念：按照人们的意愿，进行严格的设计，把概念：按照人们的意愿，进行严格的设计，把一种生物的某种基因一种生物的某种基因提取出提取出来，加以修饰改造，然后来，加以修饰改造，然后放到另一种生物放到另一种生物的细胞里，的细胞里，定向定向地改造生物的遗地改造生物的遗传性状。传性状。原理原理操作环境操作环境操作对象操作对象操作水平操作水平操作过程操作过程操作目的操作目的基因重组基因重组生物体外生物体外基因基因分子水平分子水平剪切剪切拼接拼接导入导入表达表达定向改造生物的遗传性状定向改造生物的遗传性状 基因工程基因工程(DNA(DNA重组技术重组技术)（1)1)不同生物的基因为什么能拼接？不同生物的基因为什么能拼接？（2)2)外源基因为什么能在受体细胞中正常外源基因为什么能在受体细胞中正常表达表达？不同生物的不同生物的DNADNA分子都是由分子都是由4 4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸组成，都是组成，都是双螺旋结构双螺旋结构。所有生物共用一套密码子（所有生物共用一套密码子（密码子的通用性密码子的通用性）基因工程培育抗虫棉的简要过程：基因工程培育抗虫棉的简要过程：苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌提取提取抗虫基因抗虫基因普通棉花普通棉花(无抗虫特性无抗虫特性)棉花细胞棉花细胞(含抗虫基因含抗虫基因)与载体与载体DNADNA拼接，导入拼接，导入棉花植株棉花植株(有抗虫特性有抗虫特性)表达表达普通棉花普通棉花 抗虫棉抗虫棉如何将苏云金芽孢杆菌细胞内的抗虫基因从它的如何将苏云金芽孢杆菌细胞内的抗虫基因从它的DNADNA分子中切割下来分子中切割下来？如何将切下来的抗虫基因与运载体如何将切下来的抗虫基因与运载体DNADNA连接起来？连接起来？如何将重组的如何将重组的DNADNA运送到棉花细胞？运送到棉花细胞？需要切割需要切割DNADNA的工具（分子手术刀）的工具（分子手术刀）需要连接需要连接DNADNA片段片段的工具的工具 （分子缝合针）（分子缝合针）需要基因转移的工具（分子运输车）需要基因转移的工具（分子运输车）限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶DNADNA连接酶连接酶运载体运载体思思 考考具有具有专一性专一性 主要来自于主要来自于原核生物原核生物 1 1 1 1、来源来源：3 3 3 3、特点特点：4 4 4 4、结果结果：形成两种切割末端形成两种切割末端形成两种切割末端形成两种切割末端一、一、限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶（限制酶）（限制酶）黏性黏性末端末端平末端平末端识别双链识别双链DNADNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键磷酸二酯键断开。断开。2 2 2 2、作用：、作用：、作用：、作用：1.11.1 DNA DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具表现：每种酶只能识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点上表现：每种酶只能识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点上切割切割DNADNA分子。分子。平末端：平末端：限制酶在识别序列的限制酶在识别序列的中心轴线处将中心轴线处将DNADNA切开切开时形成的切口。时形成的切口。如图：如图：G A A T T C C T T A A G 中轴线中轴线GC T T A A A A T T C G C C C G G G G G G C C CC C C G G G G G G C C C 黏性末端黏性末端平末端平末端EcoRSma黏性末端：黏性末端：限制酶在识别序列的中心轴线两侧将限制酶在识别序列的中心轴线两侧将DNADNA的两条链分别切开的两条链分别切开时时形成的切口。如图：形成的切口。如图：中轴线中轴线限制酶的识别序列限制酶的识别序列 中轴线两侧的双链中轴线两侧的双链DNADNA上的碱基是反上的碱基是反向对称、重复排列的，向对称、重复排列的，称为称为回文序列回文序列。【思考【思考 】如果把两种来源不同的如果把两种来源不同的DNADNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？用同一种限制酶来切割，会怎样呢？会产生会产生相同的黏性相同的黏性(平平)末端，然后让两者的黏性末端，然后让两者的黏性(平平)末端黏合起末端黏合起来，就可以合成重组的来，就可以合成重组的DNADNA分子。分子。用同种限制酶切割用同种限制酶切割 DNADNA连接酶连接酶1 1、种类：、种类：Ecoli DNAEcoli DNA连接酶连接酶（来自于大肠杆菌），只能（来自于大肠杆菌），只能连接连接黏性黏性末端末端T T4 4 DNA DNA连接酶连接酶（来自于（来自于T T4 4 噬菌体），连接噬菌体），连接黏性末端黏性末端和和平末端平末端（效率较低）（效率较低）磷酸二酯键磷酸二酯键 将双链将双链DNADNA片段片段“缝合缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的的磷酸二酯键磷酸二酯键。二、二、DNADNA连接酶连接酶2 2、作用、作用DNADNA连接酶连接酶DNADNA聚合酶聚合酶相相同同点点作用实质作用实质化学本质化学本质不不同同点点模板模板作用对象作用对象作用结果作用结果用途用途都能催化形成磷酸二酯键都能催化形成磷酸二酯键都是蛋白质都是蛋白质不需要不需要需要需要形成形成重组重组DNADNA分子分子形成形成DNADNA的一条链的一条链基因工程基因工程DNADNA复制复制只能将只能将单个核苷酸单个核苷酸连接到已有连接到已有的的DNADNA片段上形成磷酸二酯键片段上形成磷酸二酯键在在两个两个DNADNA片段之间片段之间形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键DNADNA连接酶与连接酶与DNADNA聚合酶比较聚合酶比较1 1下列关于下列关于DNADNA连接酶作用的叙述，正确的是连接酶作用的叙述，正确的是()A A将单个核苷酸加到某个将单个核苷酸加到某个DNADNA片段的末端，形成磷酸二酯键片段的末端，形成磷酸二酯键 B B将断开的将断开的2 2个个DNADNA片段的骨架连接起来，重新形成磷酸二酯键片段的骨架连接起来，重新形成磷酸二酯键 C C连接连接2 2条条DNADNA链上碱基之间的氢键链上碱基之间的氢键 D D只能将双链只能将双链DNADNA片段互补的黏性末端连接起来，而不能将两者之间片段互补的黏性末端连接起来，而不能将两者之间的平末端进行连接的平末端进行连接B DNADNA连接酶连接酶无专一性无专一性，对于相同或互补的黏性末端以及平末端，对于相同或互补的黏性末端以及平末端都能连接。都能连接。质粒质粒拟核拟核细菌细胞细菌细胞质粒、动植物病毒、质粒、动植物病毒、噬菌体的衍生物噬菌体的衍生物2 2、种类：、种类：三、三、运载体运载体 作为运载工具，将目的基因导入宿主细胞，利用它在宿主细胞内作为运载工具，将目的基因导入宿主细胞，利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量复制。对目的基因进行大量复制。1 1、作用作用：质粒质粒主要存在于细菌和酵母菌细胞中主要存在于细菌和酵母菌细胞中,是是独立于拟核或细胞核之外，裸露的、结构独立于拟核或细胞核之外，裸露的、结构简单，能自主复制的小型环状简单，能自主复制的小型环状DNADNA分子。分子。3 3、本质：、本质：DNADNA分子分子4 4、作为运载体的条件：、作为运载体的条件：大小适中，便于操作。大小适中，便于操作。目的基因插入位点目的基因插入位点氨苄青霉素抗性基因氨苄青霉素抗性基因复制原点复制原点能在宿主细胞内稳定存在并大量复制，或能整合到宿主细胞的染色体能在宿主细胞内稳定存在并大量复制，或能整合到宿主细胞的染色体DNADNA上，随染色体上，随染色体DNADNA复制；复制；有有一个或多个限制酶切割位点，供外源一个或多个限制酶切割位点，供外源DNADNA插入；插入；有特殊的标记基因（一般是抗生素抗性基因），供重组有特殊的标记基因（一般是抗生素抗性基因），供重组DNADNA的鉴定和选择；的鉴定和选择；表达产物无毒，对宿主细胞无害；表达产物无毒，对宿主细胞无害；2 2、质粒是基因工程中最常用的载体，它存在于许多细菌体内。某细菌质粒上有标质粒是基因工程中最常用的载体，它存在于许多细菌体内。某细菌质粒上有标记基因如右图所示，通过标记基因可以推知外源基因记基因如右图所示，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因目的基因)是否转入成功。外是否转入成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，如图所示是外源基因源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，如图所示是外源基因插入位置插入位置(插入点有插入点有a a、b b、c)c)，请根据表中提供的细菌生长情况，推测，请根据表中提供的细菌生长情况，推测三种重三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是()A A是是c c；是是b b；是是a Ba B是是a a和和b b；是是a a；是是b bC C是是a a和和b b；是是b b；是是a Da D是是c c；是是a a；是是b b A3 3、下列所示的黏性末端是由几种限制性核酸内切酶作用产生的、下列所示的黏性末端是由几种限制性核酸内切酶作用产生的()A A1 1种种 B B2 2种种 C C3 3种种 D D4 4种种DGAATTC CAATTG GTTAAC CTTAAG1.2 1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 目的目的基因的获取基因的获取基因表达基因表达载体的构建载体的构建将将目的基因导入受体细胞目的基因导入受体细胞目的目的基因的检测与鉴定基因的检测与鉴定 核心核心一、目的基因的获取一、目的基因的获取获取目的基因的常用方法获取目的基因的常用方法1 1、从、从基因文库基因文库中获取目的基因中获取目的基因3 3、人工人工合成合成目的基因目的基因2 2、利用、利用PCRPCR技术技术扩增目的基因扩增目的基因目的基因：能目的基因：能编码蛋白质的基因编码蛋白质的基因或是或是具有调控作用的因子。具有调控作用的因子。（1 1）基因文库：基因文库：将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNADNA片段，导入受体菌的片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。1 1、从基因文库中获取目的基因、从基因文库中获取目的基因基因组文库：基因组文库：含有一种生物的含有一种生物的全部全部基因。基因。部分基因文库：部分基因文库：只包含一种生物的只包含一种生物的部分部分基因。基因。（cDNAcDNA文库：文库：某种生物发育的某个时期的某种生物发育的某个时期的mRNAmRNA反转录反转录产生的多种产生的多种互补互补DNADNA片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中）片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中）（2 2）种类）种类 提取某种生物的提取某种生物的全部全部DNADNA用适当的限制酶切用适当的限制酶切一定大小的一定大小的DNADNA片段片段将将DNADNA片段与载体连接片段与载体连接基因组文库基因组文库某种生物的某种生物的mRNAmRNA单链单链DNADNA双链双链cDNAcDNA片段片段与载与载 体连接体连接cDNAcDNA文库文库逆转逆转 录酶录酶构建基因组文库构建基因组文库构建构建cDNAcDNA文库文库导入导入受体菌受体菌中储存中储存重组重组DNADNADNADNA聚聚 合酶合酶重组重组DNADNA导入导入受体菌受体菌中储存中储存编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区原核原核DNADNA启动子启动子真核真核DNADNA基因基因编码区：编码区：能转录为能转录为mRNAmRNA,能能编码蛋白质编码蛋白质 非编码区非编码区：不能转录为不能转录为mRNAmRNA ，但能调控遗传信息的表达。，但能调控遗传信息的表达。启动子启动子：RNARNA聚合酶聚合酶识别和结合的部位，识别和结合的部位，驱动驱动基因基因转录转录出出mRNAmRNA。终止子终止子：终止转录。终止转录。外显子外显子：能转录为：能转录为mRNAmRNA，能能编码蛋白质的序列。编码蛋白质的序列。内含子内含子：能转录为：能转录为mRNAmRNA，不能不能编码蛋白质的序列。编码蛋白质的序列。外显子外显子内含子内含子 真核真核生物生物终止子终止子（3 3）基因的结构）基因的结构 转转 录录加加 工工mRNAmRNA前体前体成熟成熟mRNAmRNA真核真核DNADNA编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区内含子相应的转内含子相应的转录区段被剪切掉录区段被剪切掉逆转录逆转录cDNAcDNA由由mRNAmRNA逆转录形成，不包含非编码区（启动子、终止子）及内含子等序列逆转录形成，不包含非编码区（启动子、终止子）及内含子等序列基因组文库和部分基因文库的比较基因组文库和部分基因文库的比较文库类型文库类型cDNAcDNA文库文库基因组文库基因组文库文库大小文库大小基因中启动子基因中启动子基因中内含子基因中内含子基因多少基因多少物种间基因交流物种间基因交流有有某种生物的部分基因某种生物的部分基因某种生物的全部基因某种生物的全部基因可以可以部分基因可以部分基因可以小小大大无无有有无无依据依据基因基因的脱氧核苷酸序列的脱氧核苷酸序列依据基因的功能依据基因的功能依据基因在染色体上的位置依据基因在染色体上的位置依据基因的转录产物依据基因的转录产物mRNAmRNA依据基因的表达产物蛋白质依据基因的表达产物蛋白质 （4 4）从基因文库中获取目的基因的依据）从基因文库中获取目的基因的依据 为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物中为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物中提取不行吗？提取不行吗？当然行。构建基因文库只是获取目的基因的方法之一。当然行。构建基因文库只是获取目的基因的方法之一。但是，有时我们完全但是，有时我们完全不知道目的基因序列不知道目的基因序列，或者想从一种生，或者想从一种生物体内获得物体内获得许多基因许多基因，或者想知道几种生物之间有哪些基因，或者想知道几种生物之间有哪些基因不同，或者想知道一种生物在不同，或者想知道一种生物在不同的发育阶段不同的发育阶段都表达哪些基都表达哪些基因，或者想得到一种生物的因，或者想得到一种生物的全部基因序列全部基因序列，往往就需要构建，往往就需要构建基因文库。基因文库。1 1)概念：概念：PCRPCR全称为多聚酶链式反应，是一项在生物全称为多聚酶链式反应，是一项在生物体外体外复制复制特定特定DNADNA片段片段的核酸合成技术。的核酸合成技术。5)5)原料：原料：2 2)原理：原理：DNADNA双链双链复制复制目的基因目的基因、引物（一对）引物（一对）、热热稳定稳定DNADNA聚合酶（聚合酶（TaqTaq酶）酶）、四四种游离的脱氧核苷酸种游离的脱氧核苷酸（dNTPdNTP：dATPdATP、dTTPdTTP、dGTP dGTP、dCTP dCTP）2 2、利用、利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因3 3)过程：过程：变性（变性（90-9590-95）氢键断裂，双链）氢键断裂，双链DNADNA解链解链成为单链成为单链DNADNA复性（复性（55-6055-60）引物结合到互补的）引物结合到互补的DNADNA链上链上延伸（延伸（70-7570-75）TaqTaq酶从酶从引物引物起始起始进行进行互补链的合成互补链的合成4)4)前提：前提：必须要有一段已知目的基因的核苷酸序列必须要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列来，以便根据这一序列来合成引物合成引物什么是什么是“引物引物”，为什么需要，为什么需要“引物引物”？DNADNA聚合酶不能从头合成聚合酶不能从头合成DNADNA，只能从，只能从DNADNA的的33端延伸端延伸DNADNA链链，因此，因此，DNADNA的复制需要引物。当引物与的复制需要引物。当引物与DNADNA母链通过碱基互补配母链通过碱基互补配对结合后，对结合后，DNADNA聚合酶就能从引物的聚合酶就能从引物的33端开始延伸端开始延伸DNADNA链，因此链，因此DNADNA的合成方向总是从子链的的合成方向总是从子链的55端向端向33端延伸端延伸。引物：能和引物：能和DNADNA单链互补结合的核苷酸短链单链互补结合的核苷酸短链PCRPCR扩增仪扩增仪6)6)扩增结果扩增结果在短时间内大量扩增目的基因在短时间内大量扩增目的基因 以以2 2n n形式，指数增长形式，指数增长体内体内DNADNA复制与复制与PCRPCR的技术区别：的技术区别：体内复制体内复制PCRPCR技术技术解旋解旋在在解旋酶解旋酶作用下，细胞提供作用下，细胞提供ATPATP，边解旋边复制边解旋边复制加热加热到到9090以上，双链全部解开以上，双链全部解开 引物引物一小段一小段RNARNA一般是单链一般是单链DNADNA片段片段DNADNA聚合酶聚合酶细胞自身的细胞自身的DNADNA聚合酶聚合酶（不耐高温）（不耐高温）Taq Taq 酶酶（热稳定（热稳定DNADNA聚合酶）聚合酶）复制特点复制特点半保留复制半保留复制边解旋边复制边解旋边复制多起点复制多起点复制半保留复制半保留复制完全解旋后复制完全解旋后复制从模板链的一端开始复制从模板链的一端开始复制复制的方向复制的方向子链的子链的5 5端向端向3 3端延伸端延伸子链的子链的5 5端向端向3 3端延伸端延伸DNADNA合成仪合成仪3 3、人工、人工合成目的基因合成目的基因通过通过DNADNA合成仪用化学合成仪用化学方法方法人工人工合成：合成：蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列 基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列推测推测推测推测目的基因目的基因化学合成化学合成适用于适用于基因比较小基因比较小、核苷酸序列核苷酸序列已知已知（多种）（多种）（多种）（多种）有多种有多种mRNAmRNA和多种目的基因的原因？和多种目的基因的原因？密码子的密码子的简并性简并性二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的构建 1 1、构建基因表达载体的目的、构建基因表达载体的目的a a、使目的基因在、使目的基因在受体细胞中稳定存在，并遗传给下一代；受体细胞中稳定存在，并遗传给下一代；b b、使目的基因、使目的基因能表达和发挥作用。能表达和发挥作用。为什么要有为什么要有“表达载体的构建表达载体的构建”这一步？这一步？单独的单独的DNADNA片段（目的基因）是不能稳定遗传片段（目的基因）是不能稳定遗传的。的。2 2、过程过程质粒质粒DNADNA分子分子两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶 基因表达载体基因表达载体（重组（重组DNADNA分子或重组质粒分子或重组质粒）同种同种限制酶限制酶一一个或两个切口个或两个切口3 3、基因表达载体的组成、基因表达载体的组成 鉴别受体细胞中是否含目的基因，鉴别受体细胞中是否含目的基因，将含目的基因的受体细胞筛选出来。将含目的基因的受体细胞筛选出来。两子启动和终止；目的基因在中间；标记基因来筛选。两子启动和终止；目的基因在中间；标记基因来筛选。目的目的基因基因启动子启动子终止子终止子标记基因标记基因:此外，质粒上还具有此外，质粒上还具有 ，它是质粒，它是质粒自我自我复制复制的的起点。起点。真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础基础上进行过上进行过 的。的。3 3、基因表达载体的组成、基因表达载体的组成 复制原点复制原点人工改造人工改造1 1、图图1 1表示表示DNADNA的基本结构，图的基本结构，图2 2表示染色体表示染色体DNADNA的片段，箭头是某种限制的片段，箭头是某种限制酶的识别序列和作用位点，下列相关说法正确的是酶的识别序列和作用位点，下列相关说法正确的是()A A、基因工程基因工程的载体必须具有图的载体必须具有图2 2所示的碱基序所示的碱基序列列B B、图图2 2所示的所示的DNADNA片段被限制酶切割后获得的末端形式与图片段被限制酶切割后获得的末端形式与图1 1下端相同下端相同C C、E Ecoli DNAcoli DNA连接酶可以将两个图连接酶可以将两个图1 1所示结构连接成为一个所示结构连接成为一个DNADNA片段片段D D、图图1 1中中a a所示部位即图所示部位即图2 2中箭头所示中箭头所示部位部位D D2 2、对下图所示黏性末端的相关说法错误的是对下图所示黏性末端的相关说法错误的是()CA A甲、乙、丙黏性末端是由各自不同的限制性核酸内切酶催化产生的甲、乙、丙黏性末端是由各自不同的限制性核酸内切酶催化产生的B B甲、乙具相同的黏性末端，可形成重组甲、乙具相同的黏性末端，可形成重组DNADNA分子，但甲、丙之间不能分子，但甲、丙之间不能C CDNADNA连接酶作用位点在连接酶作用位点在b b处，催化磷酸基团和脱氧核糖之间形成化学键处，催化磷酸基团和脱氧核糖之间形成化学键D D切割甲的限制性核酸内切酶不能识别由甲、乙片段形成的重组切割甲的限制性核酸内切酶不能识别由甲、乙片段形成的重组DNADNA分子分子 3 3、如图表示的是构建表达载体时的某种质粒与目的基因。已知限制酶如图表示的是构建表达载体时的某种质粒与目的基因。已知限制酶的识别序列和切点是的识别序列和切点是GGATCCGGATCC，限制酶，限制酶的识别序列和切点是的识别序列和切点是GATCGATC。最好选择限制酶最好选择限制酶_切割质粒，限制酶切割质粒，限制酶_切割目的基因所在的切割目的基因所在的DNADNA，这，这样做的好处分别是样做的好处分别是 、。酶酶切割质粒不会把两个标记基因都破坏切割质粒不会把两个标记基因都破坏目的基因两端均有酶目的基因两端均有酶的识别序列的识别序列4 4（20212021全国）用全国）用DNADNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需重组技术可以赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶，其中4 4种限制性核酸内切酶的切割位种限制性核酸内切酶的切割位点如图所示。点如图所示。回答下列问题：回答下列问题：（1 1）常用的）常用的DNADNA连接酶有连接酶有E.coliE.coliDNADNA连接酶和连接酶和T T4 4DNADNA连接酶。上图中连接酶。上图中_酶切割后酶切割后的的DNADNA片段可以用片段可以用E.coliE.coliDNADNA连接酶连接。上图中连接酶连接。上图中_ 酶切割后的酶切割后的DNADNA片段可以用片段可以用T T4 4DNADNA连接酶连接。连接酶连接。（2 2）DNADNA连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是连接酶催化目的基因片段与质粒载体片段之间形成的化学键是_。（3 3）DNADNA重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒重组技术中所用的质粒载体具有一些特征，如质粒DNADNA分子上有复制原点，可以分子上有复制原点，可以保证质粒在受体细胞中能保证质粒在受体细胞中能_；质粒；质粒DNADNA分子上有分子上有_ ，便于外，便于外源源DNADNA插入；质粒插入；质粒DNADNA分子上有标记基因（如某种抗生素抗性基因），利用抗生素可筛选分子上有标记基因（如某种抗生素抗性基因），利用抗生素可筛选出含质粒载体的宿主细胞，方法是出含质粒载体的宿主细胞，方法是_。（4 4）表达载体含有启动子，启动子是指）表达载体含有启动子，启动子是指_。EcoRI、PstI EcoRI、PstI、SmaI和和EcoRV 磷酸二酯键磷酸二酯键 自我复制自我复制 一至多个限制酶切位点一至多个限制酶切位点 用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞用含有该抗生素的培养基培养宿主细胞，能够存活的即为含有质粒载体的宿主细胞位于基因首端的一段特殊位于基因首端的一段特殊DNADNA序列，是序列，是RNARNA聚合酶识别及结合的部位，能驱动转录过程聚合酶识别及结合的部位，能驱动转录过程 5 5、pBR322pBR322质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如下图所示。质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如下图所示。(1 1)pBR322)pBR322分子中有单个分子中有单个EcoREcoR限制酶作用位点，限制酶作用位点，EcoREcoR只能识别序列只能识别序列GAATTCGAATTC，并只能在并只能在G G和和A A之间切割。若在某目的基因的两侧各有之间切割。若在某目的基因的两侧各有1 1个个EcoREcoR的切点，请画出目的的切点，请画出目的基因两侧被限制酶基因两侧被限制酶EcoREcoR切割后所形成的黏性末端：切割后所形成的黏性末端：目的目的基因基因GAATTC GAATTCCTTAAG CTTAAG5 5、pBR322pBR322质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如下图所示。质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如下图所示。(2 2)pBR322)pBR322分子中另有单个的分子中另有单个的BamHBamH限制酶作用位点，现将经限制酶作用位点，现将经BamHBamH处理后的质粒与用处理后的质粒与用另一种限制酶另一种限制酶BglBgl处理得到的目的基因，通过处理得到的目的基因，通过DNADNA连接酶作用恢复连接酶作用恢复_键，成功获键，成功获得了得了重组质粒重组质粒，说明，说明_。磷酸二酯磷酸二酯两种限制酶切割得到的黏性末端相同两种限制酶切割得到的黏性末端相同5 5、pBR322pBR322质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如下图所示。质粒是较早构建的质粒载体，其主要结构如下图所示。(3 3)为了检测上述为了检测上述重组质粒重组质粒是否导入原本无是否导入原本无AmprAmpr和和TetrTetr的大肠杆菌，将大肠杆菌在含氨的大肠杆菌，将大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落。再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落。再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果(空圈表示空圈表示与图二对照无菌落的位置与图二对照无菌落的位置)。与图三空圈相对应的图二中的菌落表现型是。与图三空圈相对应的图二中的菌落表现型是_ ，图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是图三结果显示，多数大肠杆菌导入的是_。能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素能抗氨苄青霉素，但不能抗四环素pBR322pBR322质粒质粒影印培养法影印培养法 影印培养法，是指确保在一系列平板培养基的相同位置上接种并培养出相同菌落影印培养法，是指确保在一系列平板培养基的相同位置上接种并培养出相同菌落的一种微生物培养方法。的一种微生物培养方法。主要操作方法是主要操作方法是:用灭菌的丝绒覆盖在一块与培养皿同样大小用灭菌的丝绒覆盖在一块与培养皿同样大小(或略小或略小)的木制圆柱体的木制圆柱体上，轻轻地在母种培养皿的菌苔上印一下，把细菌菌落全部转移到丝绒面上，然后将上，轻轻地在母种培养皿的菌苔上印一下，把细菌菌落全部转移到丝绒面上，然后将这一丝绒面再印在另外的选择性培养基平板上，获得与原始平板完全相同的接种平板。这一丝绒面再印在另外的选择性培养基平板上，获得与原始平板完全相同的接种平板。待培养后，比对各培养皿在相同位置出现相同的菌落，从而筛选出适当的菌株。待培养后，比对各培养皿在相同位置出现相同的菌落，从而筛选出适当的菌株。转化转化：方法方法将目的基因导入将目的基因导入植物细胞植物细胞将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态法感受态法（CaCa2+2+处理法）处理法）目的基因进入目的基因进入受体细胞受体细胞内，并且在受体细胞内维持内，并且在受体细胞内维持稳定稳定和和表达表达的过程。的过程。三、将目的基因导入受体细胞三、将目的基因导入受体细胞1、将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞（1 1）农杆菌转化法农杆菌转化法农杆菌农杆菌的特点的特点 易感染易感染双子叶植物双子叶植物和和祼子植物祼子植物,对单子叶植物无感染能力；对单子叶植物无感染能力；Ti质粒的质粒的T-DNA可转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体可转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的的DNA上。上。伤口处的细胞分泌伤口处的细胞分泌酚类化合物酚类化合物吸引农杆菌移向这些细胞吸引农杆菌移向这些细胞T-DNA(可转移的可转移的DNA）思考：利用思考：利用Ti质粒质粒构建基因表达构建基因表达载体时，应把目的基因拼接到载体时，应把目的基因拼接到哪个部位？哪个部位？T-DNA 1、将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞（1 1）农杆菌转化法农杆菌转化法转化过程转化过程:Ti质粒质粒目的基因目的基因构建构建表表达达载载体体导入导入植植物物细细胞胞插入插入植物细胞植物细胞染色体染色体DNADNA表达表达新新性性状状转入转入农农杆杆菌菌CaCa2+2+处理处理伤口细伤口细胞感染胞感染T-DNAT-DNA转移转移植物组织培养植物组织培养：单子叶植物（成本较高）：单子叶植物（成本较高）又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。的方法。（2 2）基因枪法基因枪法1、将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞（1 1）农杆菌转化法农杆菌转化法：双子叶植物、裸子植物：双子叶植物、裸子植物 植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加滴加DNA（含目的基因），使目的基因（含目的基因），使目的基因借助借助花粉管通道花粉管通道进入受体细胞。进入受体细胞。（我国独创我国独创、转基因转基因抗虫棉抗虫棉）（3 3）花粉通道法）花粉通道法：单子叶植物（成本较高）：单子叶植物（成本较高）（2 2）基因枪法）基因枪法1、将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞（1 1）农杆菌转化法：双子叶植物、裸子植物）农杆菌转化法：双子叶植物、裸子植物提纯含目的基因的表达载体提纯含目的基因的表达载体取卵细胞（体内或体外受精取卵细胞（体内或体外受精受精卵受精卵）显微注射显微注射 含目的基因的受精卵含目的基因的受精卵经胚胎早期经胚胎早期培养后移植到子宫发育培养后移植到子宫发育具有新性状的动物具有新性状的动物 2 2、将目的基因导入动物细胞、将目的基因导入动物细胞 显微注射法显微注射法受精卵？受精卵？体积大体积大，易操作，易操作受精卵受精卵全能性高全能性高，易培养成完整个体易培养成完整个体用用Ca+处理细胞处理细胞，使细胞处于一种能，使细胞处于一种能吸收周围环境中吸收周围环境中DNA分子分子的生理状态，这种细胞称为的生理状态，这种细胞称为感受态细胞感受态细胞。感受态细胞吸收重组表达载体感受态细胞吸收重组表达载体DNA分子。分子。3 3、将目的基因导入微生物细胞、将目的基因导入微生物细胞(1)(1)方法方法(2)(2)受体细胞：原核细胞受体细胞：原核细胞(使用最广泛的是大肠杆菌细胞使用最广泛的是大肠杆菌细胞)(3)(3)原核生物的特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。原核生物的特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。感受态法感受态法（CaCa2+2+处理法）处理法）小结：将目的基因导入受体细胞的三种方法小结：将目的基因导入受体细胞的三种方法生物种生物种类类植物细胞植物细胞动物细胞动物细胞微生物细胞微生物细胞常用方常用方法法农杆菌转化法农杆菌转化法显微注射技术显微注射技术Ca2处理法处理法受体细受体细胞胞体细胞体细胞受精卵受精卵原核细胞原核细胞转化过转化过程程将目的基因插入到将目的基因插入到Ti质质粒的粒的T-DNA上上农杆菌农杆菌导入植物细胞导入植物细胞整合整合到受体细胞的到受体细胞的DNA表表达达将含有目的基因的表达将含有目的基因的表达载体提纯载体提纯取卵取卵(受精卵受精卵)显微注射显微注射受精卵发受精卵发育育获得具有新性状的获得具有新性状的动物动物Ca2处理细胞处理细胞感受态感受态细胞细胞重组表达载体与重组表达载体与感受态细胞混合感受态细胞混合感受感受态细胞吸收态细胞吸收DNA分子分子分子水平的检测分子水平的检测:是否插入目的基因是否插入目的基因是否转录出是否转录出mRNA是否翻译成蛋白质是否翻译成蛋白质个体水平的鉴定个体水平的鉴定:抗虫、抗病的接种实验抗虫、抗病的接种实验DNA分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术分子杂交技术抗原抗原-抗体杂交抗体杂交四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性（检查基因工程是否成功的一步）（检查基因工程是否成功的一步）方法方法转基因生转基因生物的物的DNADNA探针探针1515N N N N1515N N N N（1 1）检测转基因生物的）检测转基因生物的DNADNA上上是否插入了目的基因是否插入了目的基因基因探针：基因探针：指用指用放射性同位素标记的放射性同位素标记的含有目的基因的含有目的基因的DNADNA片段片段方法方法DNADNA分子杂交技术分子杂交技术变性变性变性变性1 1、分子水平的检测、分子水平的检测待测：转基因生物的基因组待测：转基因生物的基因组DNADNA复复性性结果：若出现结果：若出现杂交带杂交带，则说明目的基因已插入受体细胞，则说明目的基因已插入受体细胞变性变性方法方法分子杂交技术分子杂交技术（2 2）检测目的基因）检测目的基因是否转录出了是否转录出了mRNAmRNA探针探针1515N N N N1515N N N N转基因生物的转基因生物的mRNAmRNA1 1、分子水平的检测、分子水平的检测基因探针：基因探针：指用指用放射性同位素标记的放射性同位素标记的含有目的基因的含有目的基因的DNADNA片段片段待测：转基因生物的待测：转基因生物的mRNAmRNA结果：若出现结果：若出现杂交带杂交带，则说明目的基因已转录，则说明目的基因已转录复复性性（3 3）检测目的基因）检测目的基因是否翻译成蛋白质是否翻译成蛋白质方法方法抗原抗原-抗体杂交抗体杂交1 1、分子水平的检测、分子水平的检测待测：转基因生物的待测：转基因生物的蛋白质蛋白质（抗原）（抗原）结果：与相应抗体杂交，若出现结果：与相应抗体杂交，若出现杂交带杂交带，说明目的基因已经翻译，说明目的基因已经翻译苏云金杆菌苏云金杆菌BtBt毒蛋白毒蛋白将将BtBt毒蛋白注射小鼠体内毒蛋白注射小鼠体内抗体抗体抗虫棉的蛋白质（抗虫棉的蛋白质（抗原抗原）出现杂交带出现杂交带为什么为什么BtBt毒蛋白对哺乳动毒蛋白对哺乳动物无毒害作用？物无毒害作用？哺乳动物无特异性受体哺乳动物无特异性受体怎样从个体水平鉴定：抗虫基因在棉细胞内是否表达呢怎样从个体水平鉴定：抗虫基因在棉细胞内是否表达呢？待测棉植株待测棉植株接种接种棉铃虫棉铃虫虫没有死虫没有死虫被杀死虫被杀死没有表达没有表达目的基因表达目的基因表达2 2、个体水平的鉴定、个体水平的鉴定（1 1）抗虫、抗病的）抗虫、抗病的接种实验接种实验，以确定是否有抗性以及抗，以确定是否有抗性以及抗性的程度；性的程度；（2 2）基因工程产品与天然产品的）基因工程产品与天然产品的活性比较活性比较，以确定功能，以确定功能是否相同。是否相同。7 7、DNADN