山楂多糖提取.doc

本科毕业论文山楂多糖的提取EXTRACTION OF HAWTHORN POLYSACCHARIDE 学院（部）： 化学工程学院 专业班级： 制药07-1班 学生姓名： 丁作为 指导教师： 安胜欣讲师 2011 年 月 日山楂多糖的提取摘要山楂是一种重要的药食两用植物资源，在我国种植栽培面积广阔，产量可观。药理研究表明，山楂具有降压、降血脂、强心、利尿、抗氧化、抗癌、抗过敏、抗菌消炎等作用。山楂中的黄酮、酚酸以及三萜酸都有了较多研究，但是迄今为止有关山楂多糖的研究还很少。本文以山楂为原料，对山楂多糖的提取进行了较为系统的研究，采用水提醇沉法从山楂果肉中提取出水溶性粗多糖,提取过程应用微波协助提取。在单因素试验的基础上，通过正交试验确定了微波提取的最佳工艺参数为：功率为520W，微波提取时间为40s，液固比为20:1(mL/g),溶剂pH值为7，也确定了各因素对多糖提取率影响大小的顺序，依次是功率、液固比、微波提取时间和溶剂pH值。关键词：山楂多糖，微波提取，提取率，正交试验EXTRACTION OF HAWTHORN POLYSACCHARIDE ABSTRACTHawthorn is an important medicinal and edible plants, cultivated in the vast area of cultivation, yield considerable. Pharmacological studies have shown that hawthorn has many important physiological activities. Hawthorn flavonoids, phenolic acids and triterpene acids have a more research, but so far the research on hawthorn, little polysaccharide. Therefore, we hawthorn as raw material, Hawthorn polysaccharides a more systematic study of water extraction and alcohol precipitation method using hawthorn fruit pulp from the water-soluble polysaccharide extracted, the extraction process of microwave assisted extraction. Single factor test, I determined the optimum microwave extraction parameters were: power is 520W, microwave extraction time is 40s, liquid to solid ratio of 20 (mL / mg), solvent pH 7. Orthogonal test, I'm sure the various factors affect the size of the extraction rate of polysaccharides in the order, followed by power, liquid to solid ratio, microwave extraction time and solvent pH.朗读显示对应的拉丁字符的拼音字典KEYWORDS：hawthorn polysaccharide，microwave extraction，extraction rate，orthogonal目录摘要IABSTRACTII1文献综述1前言1山楂的营养成分和功能成分1山楂的营养成分1山楂的功能成分1山楂的药理作用2多糖研究概述3多糖的结构分类和分析3多糖的生物活性4多糖的研究难题5多糖的应用前景5山楂多糖提取研究概述7山楂多糖提取研究现状7本论文研究内容与意义72提取工艺研究探讨8实验材料8实验原料8实验试剂8实验仪器和设备8实验方法9山楂多糖提取方法9多糖含量测定方法9单因素试验设计10正交试验设计113结果和分析12葡萄糖标准曲线12单因素试验结果和分析12微波功率12微波提取时间13液固比14溶剂pH值15正交试验结果和分析16结论18参考文献19谢辞221文献综述前言山楂为蔷薇科山楂属植物，原产于我国北方广大地区，适应环境性强，在我国被广泛栽培。山楂味甘、酸，性微温，归脾、胃、肝经，是卫生部批准的“药食两用”的中药，被广泛用于普通的食品和保健食品中。山楂的果实营养丰富，综合利用价值很高1。全面深入系统地分析山楂的营养成分、功能性成分及其药理作用等，对开发山楂类保健食品具有重大的理论和现实意义。 山楂的营养成分和功能成分山楂的营养成分山楂含有丰富的营养成分和生物活性物质，每100g山楂果实中的可食部分占76 g。新鲜的山楂果实中含水量一般为70%76%，山楂果实含水量与其它水果相比较低。山楂果实中的无机盐占山楂总量的%，山楂的矿物质含量约为%，其中Ca、Fe、P的含量较高。山楂果实中含有多种人体必需的维生素，山楂含酸量约为%左右，含有柠檬酸、苹果酸和山楂酸等有机酸，其中以柠檬酸为主。在采收时，山楂果实的淀粉含量降到1%左右，在贮藏期间，淀粉则完全被分解为糖。山楂中的糖主要为醛糖和果糖等，含量为%，这部分糖不仅容易被人体吸收，而且其甜昧与有机酸相结合，使山楂具有独特的风味2。山楂果实的含糖量一般为10%，其含糖量随着贮藏期的延长而逐渐减少。氨基酸含量占山楂总量的%3，含有天门冬氨酸、甘氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、谷氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、酪氨酸、赖氨酸、精氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、脯氨酸和-氨基丁酸等17种氨基酸，其中7种人体必需氨基酸含量相当丰富。山楂的功能成分黄酮类山楂属植物中主要含黄酮及其苷类化合物，山楂中黄酮主要是以木犀草素和洋芹素为苷元的一系列苷类，如槲皮素、儿茶酚、栎皮酮和金丝桃苷等，其中儿茶素和多酚类缩合黄烷聚合物含量很高。近年来，随着对黄酮药理的深入研究，人们发现山楂中黄酮类化合物具有抗衰老、抗氧化、降血脂、清热和治疗心脑血管疾病等药理保健功能，是一类极具开发潜力的天然抗氧化剂5。黄酮类提取一般采用乙醇回流法和超声波辅助提取的方法。有机酸山楂果实中的有机酸主要有柠檬酸及甲酸、草酸、绿原酸、齐墩果酸、酒石酸、山植酸、苹果酸、棕搁酸、枸橼酸、熊果酸、油酸、亚油酸、亚麻酸和琥珀酸等，总酸含量为%，其中主要是不饱和脂肪酸。山楂富含有多种有机酸，能保持山楂中的维生素C在加热条件下也不会被破坏，它们在调节血脂、预防肿瘤和改善记忆力等方面有重要作用。果胶果胶是由半乳糖醛酸为基本构成单位的高分子多糖6，山楂果实中含有大量的果胶，大部分的果胶为水溶性果胶。果胶凭借其独特的胶凝和乳化作用，在食品工业中主要被用作增稠剂、胶凝剂及稳定剂，广泛被应用于糖果、果汁、果冻、罐头及各种饮料中。同时，由于果胶还具有良好的抗癌、抗腹泻、抗溃疡、降血脂和治疗糖尿病等多种作用，在医药和日化工业中具有广泛的用途7。山楂果实中果胶可采用盐析法和醇析法等沉淀方法进行提取8。多糖多糖是天然有机化合物中的大分子物质，某些活性多糖有抗肿瘤和增强免疫功能的作用，一些多糖则具有复杂的控制细胞分裂和分化、调节细胞生长与衰老等多方面的功能，一些重要的生理过程如受体识别、炎症反应和免疫反应等都与多糖分子密切相关。山楂果实中多糖可采用水浴浸提、微波溶剂萃取和超声提取的方法提取9。山楂的药理作用对消化系统的作用山楂中含维生素B、维生素C、胡萝卜素和多种有机酸，能增加胃蛋白酶的分泌，具有消食化滞及增进食欲的功能。对内分泌系统的作用黄酮类物质通过对供血系统的改善和对产胰岛素细胞的调节，增加胰岛素的量来降低血糖和血清胆固醇，因而可以用于预防糖尿病及其并发症，治疗骨病和骨质疏松等症。降压作用山楂中的总黄酮类通过促使心血管扩张，从而产生降血压的作用。降血脂作用山楂黄酮类中的儿茶素、多酚类缩合黄烷聚合物及有机酸中的总三萜酸等不饱和酸是降血脂的活性成分，它们通过调节机体肝脏低密度脂蛋白rRNA转录，提高抗氧化能力抑制脂质过氧化物，预防脂质代谢降低血脂水平。强心作用山楂中的三萜类和黄酮类成分具有加强和调节心肌、增强心室和心房运动和冠血流量、减慢心率的作用。利尿作用山楂浸膏具有利尿作用，山楂制剂改善心肌代谢和利尿的作用，可能与其强心作用有关。抗氧化作用山楂果实中抗氧化作用的物质主要有黄酮类化合物、原花青素和山楂提取物等。栎皮酮，属于黄酮类化合物，是天然植物抗氧化物10；原花青素具有较强的清除自由基和抑制脂质氧化的能力；山楂提取物也具有较强的抗氧化能力，山楂提取物分别与维生素C和槲皮素复配，均具有一定的抗氧化协同作用，而且山楂提取物与维生素C的抗氧化协同作用强于山楂提取物与槲皮素。抗癌防癌作用山楂所含黄酮类药效成分中的牡荆素具有抗癌作用，山楂中某些活性多糖也有抗肿瘤和增强免疫功能的作用。抗过敏作用山楂果实中的栎皮酮等黄酮类化合物具有抗炎、抗过敏作用。抗炎机制在于其抑制了前列腺素生物合成过程中的脂氧化酶，抗过敏机制在于其抑制抗原的结合或在抑制介质释放等环节上产生效应。抗菌消炎作用山楂果中所含有的果胶、黄酮类化合物和不饱和脂肪酸等多种化学成分具有一定的抗菌消炎作用。多糖的结构分类和分析多糖的结构分类沿用了对蛋白质和核酸的分类方法11，可以分为一级、二级、三级和四级结构。多糖的结构形态是各个单糖残基在空间相对定位的综合，解析这些定位，对于理解多糖的生物学功能有极深刻的意义。多糖的一级结构包括糖基的组成、糖基排列顺序、相邻糖基的连接方式、异头碳构型以及糖链有无分支、分支的位置与长短等。与蛋白质和核酸相比，糖的一级结构非常复杂。例如，两种氨基酸只能构成一种二肽，而两种相同单糖能结合形成11种不同的二糖；另外，通过硫酸化、乙酞化、磷酸化、甲基化等衍生形式还可形成糖衍生物，这就更加剧了糖一级结构的复杂性。不同植物提取的多糖，一级结构有很大的差异。多糖的二级结构指多糖骨架链问以氢键结合所形成的各种聚合体，只关系到多糖分子中主链的构象，不涉及侧链的空间排布。在多糖链中，糖环的几何形状几乎是硬性的，各个单糖残基绕糖苷键旋转而相对定位，可决定多糖的整体构象。多糖的二级结构形式主要依赖一级结构的排布。多糖的三级结构指由多糖糖残基中的羟基、羧基、氨基以及其他官能团之间通过非共价作用而导致的有序、规则而粗大的空间构象12。多糖的四级结构指多聚链间非共价键结合形成的聚集体。多糖的结构形态是各个单糖残基在空间相对定位的综合13。多糖链的聚集作用可在相同的分子间进行，如纤维素链间的氢键相互作用；也可在不同的多糖链间进行，如黄杆菌聚糖多糖链与半乳甘露聚糖骨架中未取代区域之间的相互作用。综上所述，深入剖析多糖的结构特点对研究其生物活性有非常深远的意义。完整的多糖结构分析包括对多糖的一级结构和高级结构的分析。目前能有效分析多糖的一级结构的方法有化学方法、物理方法和生物方法。化学方法是最古老且最经典的，有甲基化分析、高碘酸氧化、Smith降解、三氧化铬氧化法、部分酸水解等；物理方法主要有高效凝胶色谱、红外光谱、核磁共振波谱、气相色谱、质谱、气质联用、快原子轰击质谱、毛细管电泳等；生物学方法主要是利用特异性糖苷酶进行的酶法分析14。而目前用于多糖高级结构分析的方法主要是物理方法，诸如X射线纤维衍射、核磁共振、电子衍射等15。1.3.2多糖的生物活性现已确认，多糖具有抗肿瘤和免疫促进、抗炎、抗病毒、抗凝血、降血糖等广泛的生物学活性。调节免疫功能Suzuki等认为，多糖的特殊结构可能有利于宿主免疫系统的识别16；Adachi等发现多糖的分支结构是宿主补体系统识别的位点17，而且是一类新的巨噬细胞激活剂18；戴玲等人的研究发现19。从中药丹皮中提取的丹皮多糖有效成分PSM2b在体外能直接促进小鼠脾细胞增殖，并能协同ConA诱导脾细胞的增殖作用。抗肿瘤活性多糖能在多条途径、多个层面对免疫系统发挥凋节作用20，如促进网状内皮系统的吞噬功能、增强天然杀伤性细胞(NK)的活性、活化巨噬细胞、诱导免疫调节因子的表达等。如口蘑(Tricholoma lobayense)多糖及香菇多糖(1entinan)在小鼠PEC和脾细胞中均可诱导并提高IL-1B，TNF-a，LFN-7，M-CSF和mRNAs的表达21。抗病毒活性某些多糖或衍生物对病毒有抑制作用，如艾滋病毒(HIV)、单纯疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒(HC-MV)、流感病毒、囊状胃炎病毒、劳斯肉瘤病毒和鸟肉瘤病毒等22，这些多糖大都含有硫酸基。其作用机制除了从整体上调节机体免疫能力外，还可以在两方面产生抗病毒作用：竞争抑制病毒对靶细胞的黏附和穿透。抑制病毒增殖23,24。抗凝血活性目前，报道具有抗凝血作用的多糖多为硫酸化多糖，如肝磷脂(heparin)、硫酸软骨素(dermatansulphate)、海藻糖化的硫酸软骨素(fucosylated，CS)、茶叶多糖、猴头子实体多糖等。抗凝血的机制可能有：同抗凝血酶结合，诱导其改变构型；对一种血清蛋白酶抑制因子(肝素辅因子)的激活。降血糖活性随着对多糖生物活性的广泛研究，人们在药理实验中发现，多种多糖对正常小鼠或药物致高血糖的小鼠有降血糖作用。如从金耳(Tremella aurantia)的果肉中提取出的一种水溶性酸性多糖(TAP)，在正常小鼠和两种糖尿病小鼠链佐星(SIZ)诱导的糖尿病和遗传性糖尿病模型中，表现出显著的降血糖作用。1.3.3多糖的研究难题无论是国内还是国外，对多糖的研究与对蛋白质和核酸的研究相比，还有一定的差距，这主要反映在以下几个方面：多糖结构与生理功能的关系，至今尚不十分清楚；多糖的结构测定方法虽然有多种，但还未达到像核酸和蛋白质结构测定那样自动化、微量化和标准化；多糖的合成(目前实际上只是寡糖的合成)也远比多肽和多聚核苷酸的合成复杂和困难；多糖在体内的作用机制还未十分明了；多糖研究还没有形成一个相对完整的学科研究体系。我国多糖资源十分丰富，具有巨大的开发潜力。然而，国内许多对多糖的研究只是追求多糖种类的开发，而对每一种新开发的多糖本身没有进行进一步深入研究，从而造成了人力、物力和财力的浪费。1.3.4多糖的应用前景多糖作为药物始于1943年。此后，多糖在药物和保健食品方面的产品越来越多。目前全球至少有12个以上的多糖正在进行临床试验，分别作为肿瘤、糖尿病的治疗药物，或促进伤口愈合的药物，1997年全球从植物中提取的糖类药物的销售额达73亿美元25。总的说来，多糖的应用可分为2类：一类是在医药领域，利用多糖的独特理化性质，如易形成凝胶、高渗透压、高粘度和吸水性，制备医药材料、药物缓释剂、血浆代用品等；或利用多糖的抗原性、抗肿瘤等生物功能或活性制备疫苗或新药26。另一类是在保健食品领域，活性多糖作为功能性因子调节或增强人体免疫功能或起到抗肿瘤、抗突变、抗病毒、抗凝血、抗溃疡、抗氧化、降血糖、降血脂等保健作用。近年来，多糖的发现有成倍增加的趋势，多糖的生物效应与其立体构象有关，当它与受体作用时只有分子中几个寡聚糖片段与其受体结合。因此可以推测，象蛋白质和酶生物大分子一样，可能在多糖分子中存在一个或几个寡聚糖片段“活性中心”，但这点尚需进一步证明。相信不久会取得突破性进展。多糖作为药物的最大优点是毒副作用少，但有些问题尚待解决，如天然含量低，分离提取困难：质量标准不易控制；分子结构难以测定等。不过，通过人们的努力，必将使多糖类药物造福于人类。多糖作为免疫调节剂已应用或逐渐会应用于临床上，多糖类化合物由于它们的独特功能和很低的毒性在肿瘤的治疗和预防上优于其它化合物，因此多糖作为药品或保健食品的应用将有广阔前景。另一方面，随着对多糖生物活性的研究，多糖的生物活性机理、功效因子会更加明确，它的应用领域将会更加拓宽。目前，多糖作为保健食品的主要成分己悄然兴起，通过对多糖构效关系和量效关系的研究，人们将会利用我国丰富的多糖资源，生产出高附加值的以多糖为主要成分的(或复方多糖)的保健食品，以提高人民身体素质，增进健康，减少疾病。越来越多的研究证明，多糖具有复杂的多方面的生物活性和功能。对多糖的研究虽然较生命中其它三类物质蛋白质、核酸和脂类起步为晚，但已引起人们的很大兴趣，已成为天然药物及保健品研发的重要组成部分。2002年全球糖类药物及保健品的销售额超过193亿美元。据不完全统计，全球有关多糖的临床试验己由三年前的27个增加至现在的34个，这些目前正处于抗肿瘤、抗艾滋病及糖尿病治疗等疾病的一二三期临床试验阶段。特别是针对晚期乳腺癌及前列腺癌的灰树花多糖已由美国FDA批准进行二期临床试验。目前各国一方面利用先进的生物技术从中草药、微生物及海洋生物中寻找对肿瘤、艾滋病等疾病更有效的多糖及其衍生物，另一方面着重进行多糖构效关系和作用机制的研究。研究较为深入的有高等真菌(特别是蘑菇类)产生的-葡聚糖和某些植物产生的果胶类多糖，以及海洋藻类产生的硫酸酯多糖。目前，多糖作为保健食品的主要成分己悄然兴起，通过对多糖构效关系和量效关系的研究，人们将会利用丰富的多糖资源，生产出高附加值的以多糖为主要成分的(或复方多糖)的保健食品，以提高人民身体素质，增进健康，减少疾病。疗效好、毒副作用小、安全性高是多糖类化合物作为一种新药物的优点，凭借这些优点在临床应用中显示出越来越广阔的前景。抗衰老药多糖不仅能从整体上增强机体的免疫力，还可作为自由基清除剂，也可作为延缓衰老药用于临床医学。抗病毒药许多多糖对病毒有抑制作用，可应用于临床治疗艾滋病。AZT、DDC、天花粉蛋白等是现有的抗艾滋病药物，它们毒性均较大，存在严重的毒副作用，难以推广应用。多糖类药物，如硫酸化多糖，对人类免疫缺陷病毒(HIV)有抑制作用，同时具有较低毒性。卡拉胶有抑制疱疹病毒复制的作用，岩藻衣聚糖是T2淋细胞病毒三型的抑制剂。抗肿瘤药在对肿瘤的治疗上，多糖类免疫调节剂与一些抗癌药物合用时，可恢复由化疗所导致的免疫功能低下，增强抗肿瘤作用。综合疗效药物果实多糖对引起病毒性心肌炎的柯萨奇病毒具有明显的抑制作用；附子多糖具有强心、抗癌、抗衰老和增强免疫机能的作用；当归多糖不仅具有抗肿瘤作用，还能抗辐射，改善造血系统。目前，这几种植物多糖正被开发成多种临床药物和保健品，效果较好。山楂多糖提取研究现状从植物中提取多糖，主要是根据其不同的溶解度选择一种合适的溶剂进行，最常用的为水(冷或热)、稀盐、稀酸、稀碱以及其它一些溶剂。在对多糖类生物活性物质进行提取时，通常是用水提醇沉27,28进行的。近几年来，随着多糖类物质研究的深入，新的多糖提取分离手段也在不断地被引进和尝试，如利用超临界萃取藏药雪灵芝中的总皂苷和多糖30、以及利用双水相分配技术和逆流色谱联用进行牛膝多糖的纯化研究31对于超声提取32-34、微波萃取方法36-38更是进行了广泛的研究，为多糖的提取做出了一定的贡献。本论文研究内容与意义本论文主要对山楂多糖的提取进行了较为系统的研究，采用水提醇沉法从山楂果肉中提取出水溶性粗多糖，提取过程应用微波萃取法，并测定多糖提取率，确定最佳工艺条件。本论文结合我国传统的食疗和现代保健食品的发展，以山楂作为研究对象，对其提取工艺进行优化，提高山楂多糖提取率。通过采取先进的微波提取技术提高了山楂多糖的提取率，比传统的水浴加热提取率高。对山楂的开发研究会增加市场对山楂量的需求让种植山楂的农民得到实惠，增加收入，同时也会使山楂发挥出更大的经济效益、生态效益和社会效益，还会带动传统食疗食物的深加工并使其形成产业化，加速现代保健食品的创新和发展。2提取工艺研究探讨实验材料实验原料山楂：产自山西绛县 由维之王食品公司提供实验试剂表2-1实验试剂表Table Table 2-1 Reagents试剂名称规格生产厂家盐酸分析纯扬州沪宝化学试剂 苯酚分析纯汕头市西陇化工 丙酮分析纯扬州沪宝化学试剂 浓硫酸分析纯汕头市西陇化工 95%乙醇分析纯扬州沪宝化学试剂 无水乙醇分析纯扬州沪宝化学试剂 葡萄糖标准品汕头市西陇化工 实验仪器和设备表2-2实验仪器和设备表Table 2-2 Experimental Apparatus And Equipment List仪器和设备名称型号生产厂家pH计pHB-4上海雷磁仪器厂离心机TDL-40B上海安亭仪器总厂旋转蒸发仪RE-52D上海亚荣生化仪器厂电子分析天平FA1104N苏州江东精密仪器 电热恒温水浴锅HH·SY21-Ni北京市长风仪器仪表公司循环水式多用真空泵SHB-III郑州长城科工贸 数控超声波清洗器KQ-3000B昆山市超声仪器 微电脑微波化学反应器LWMC-201南京陵江科技开发有限责任公司紫外-可见分光光度计UV-1700杭州康迪仪器设备 实验方法山楂多糖提取方法水提醇沉法（水醇法）系指在中药水提浓缩液中，加入乙醇使达不同含醇量，某些药物成分在醇溶液中溶解度降低析出沉淀，固液分离后使水提液得以精制的方法15。一般操作过程是：将中药水提液浓缩至1112（mLg），药液放冷后，边搅拌边缓慢加入乙醇使达规定含醇量，密闭冷藏2448h，滤过，滤液回收乙醇，得到精制液。操作时应注意以下问题：药液应适当浓缩，以减少乙醇用量。但应控制浓缩程度，若过浓，有效成分易包裹于沉淀中而造成损失。浓缩的药液冷却后方可加入乙醇，以免乙醇受热挥发损失。选择适宜的醇沉浓度。一般药液中含醇量达5060可除去淀粉等杂质，含醇量达75以上大部分杂质均可沉淀除去。慢加快搅。应快速搅动药液，缓缓加入乙醇，以避免局部醇浓度过高造成有效成分被包裹损失。密闭冷藏。可防止乙醇挥发，促进析出沉淀的沉降，便于滤过操作。洗涤沉淀。沉淀采用乙醇（浓度与药液中的乙醇浓度相同）洗涤可减少有效成分在沉淀中的包裹损失。称取切碎后的山楂1g，置于微波炉专用器内，加入适量水，在选定的微波功率、液固比、溶剂pH值和提取时间条件下，微波协助萃取，趁热过滤，得滤液，然后在真空旋转蒸发浓缩为原体积的l/4后，缓缓加入浓缩液五倍体积的95乙醇，离心，收集多糖沉淀，沉淀复溶于水中，再次用五倍体积的95乙醇沉淀，离心，沉淀用无水乙醇、丙酮反复洗涤，水浴加热干燥，得到山楂多糖粗品。多糖含量测定方法苯酚硫酸法测定多糖含量苯酚-硫酸法原理糖类在强无机酸条件下经脱水反应生成醛类，反应生成的醛类与各种酚类缩合产生特有的有色物质，不同的多糖和单糖经显色反应后具有不同的最大吸收峰，己糖在490nm处有最大吸收峰，戊糖和糖醛酸在480nm处有最大吸收峰，吸收值与糖含量呈线性关系16。山楂多糖在浓硫酸脱水作用下反应生成的醛类与苯酚缩合产生特有的有色物质，在490nm处有最大吸收峰。5苯酚溶液的配制 称取苯酚50g，加铝片，NaHCO3，蒸馏，收集180182的馏分，快速称取馏分g，置250mL深色容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，避光，冷藏，备用。标准溶液的配制称取105烘干至恒质mg，置于100mL容量瓶中，加入适量的蒸馏水使其溶解，定容。静置10min后，精密移取上述溶液10mL置于100mLmL的葡萄糖标准溶液。标准曲线的制作按表3-1配置溶液，各试管加入5%重蒸苯酚试液1mL充分振荡摇匀后，迅速加入浓硫酸5mL，混匀，摇匀后放置5 min，置沸水浴中加热15 min，取出后迅速冷却至室温，于490nm波长处测定吸光度。以质量浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线。换算因数的测定：精密称取60干燥至恒重的山楂多糖20mg，加蒸馏水溶解，并定容至100mL的容量瓶中，摇匀。准确吸取上述溶液L，加水至L，用制作标准曲线同样的方法测其吸光度值。按f=W/CD计算换算因素，其中W为山楂多糖质量（mg），C为多糖液中葡萄糖的质量（mg/mL），D为多糖的稀释倍数。测得。山楂多糖的计算多糖提取率（%）=粗多糖质量/山楂质量×100%多糖提取率（%）=C×D×f/M×100%式中：C为粗多糖中的葡萄糖浓度（mg/mL） D为稀释倍数 f为换算因数 M为山楂质量（mg）单因素试验设计分别考察影响微波萃取过程主要因素微波功率、液固比、微波提取时间和溶剂pH值，为探索适宜工艺参数依次做单因素实验。微波功率在固定液固比为15:1(mL/g) 、微波提取时间为40s、溶剂pH值为5的不变条件下，功率依次为130W、260 W、390W、520W、650W做微波功率试验。微波提取时间在固定液固比为15:1(mL/g)、溶剂pH值为5和微波功率(由上述实验得到的最佳功率)不变条件下，微波提取时间依次为20s、40s、60s、80s、100s做微波提取时间试验。液固比在固定溶剂pH值为5、微波功率和微波提取时间(由上述实验得到的最佳功率和最佳微波提取时间)不变条件下，液固比依次为10:1、15:1、20:1、25:1、30:1(mL/g)做液固比试验。溶剂pH值在固定微波功率、微波提取时间和液固比(由上述实验得到的最佳功率、最佳提取时间和最佳液固比)不变条件下，溶剂pH值依次为3、5、7、9、11做溶剂pH值实验。正交试验设计从山楂中提取多糖，影响多糖提取率的主要因素为：微波功率(A)，溶剂pH值 (B)，微波提取时间(C)，液固比(D)。为优化提取条件，采用正交法设计实验，选用四因素三水平正交实验表L9(3)4。3结果和分析葡萄糖标准曲线根据的多糖提取方法得出表3-1的具体数据表3-1葡萄糖标准溶液浓度与吸光度的关系Table 3-1 The Relationship of Concentration and Absorbance on Glucose Standard Solution试管编号1234567葡萄糖标准溶液（mL）蒸馏水（mL）5%重蒸苯酚溶液（mL）1111111浓硫酸（mL）5555555吸光度A0根据表3-1做出图3-2，得出葡萄糖标准曲线方程，R2，线性回归方程可以用。图3-1葡萄糖标准溶液浓度与吸光度的关系Figure 3-1 The Relationship of Concentration and Absorbance on Glucose Standard Solution单因素试验结果和分析微波功率表3-2微波功率对山楂多糖提取率的影响Table 3-2 Microwave Power Effection on Extraction Yield of Hawthorn Polysaccharides微波功率（W）130260390520650多糖提取率（%）图3-2微波功率对山楂多糖提取率的影响Figure 3-2 Microwave Power Effection on Extraction Yield of Hawthorn Polysaccharides 由表3-2可以知道及图3-2可以看出，微波功率在130520W范围内山楂多糖的提取率随着微波功率的增加而逐渐提高，而在520W以后，山楂多糖提取率反而随着微波功率的增加而减少，在520W时山楂多糖提取率为最大。由理论可以得到以下分析，当微波提取时间、溶剂pH值和液固比一定时，功率越高，提取率就越高，提取就越完全；但是如果超过一定限度，则会使提取体系压力升高到冲开容器安全阀的程度，使溶液溶液溅出，造成损失，产生误差19。因此，微波提取山楂多糖最佳功率为520W。微波提取时间表3-3微波提取时间对山楂多糖提取率的影响Table 3-3 Microwave Extraction Time Effection on Extraction Yield of Hawthorn Polysaccharides提取时间（s）20406080100多糖提取率（%）图3-3微波提取时间对山楂多糖提取率的影响Figure 3-3 Microwave Extraction Time Effection on Extraction Rate of Hawthorn Polysaccharides从表3-3可以知道及图3-3可以看出，在开始时，随着微波提取时间的增加，山楂多糖提取率迅速增加，40s时达到最大；在40s之后随着微波提取时间的延长，山楂多糖提取率呈现减少的趋势。由理论可以得到以下分析，微波提取时间可明显提高提取率，起初随着微波提取时间增加，提取率增加。一方面，微波同时提高了山楂内部的温度和压力，推动力增加，扩散速率加快；另一方面，细胞壁受到破碎而孔径增大，传质阻力减小。但随着微波提取时间延长，山楂多糖提取率呈现下降态势，原因可能是由于微波作用时间过长，降低某些反应的活化能，使原来不能自发进行的反应变得易于发生，使多糖分子之间、多糖分子与其它分子之间形成新的作用力，增加了分子之间碰撞机会，阻止了多糖分子加入溶液，也可能是蛋白质变性沉淀后包裹在果肉颗粒表面，导致了山楂多糖提取率下降20。因此，微波提取山楂多糖最佳提取时间为40s。液固比表3-4液固比对山楂多糖提取率的影响Table 3-4 Solid Ratio Effection on Extraction Rate of Hawthorn Polysaccharides液固比（mL/g）10:115:120:125:130:1多糖提取率（%）图3-4液固比对山楂多糖提取率的影响Figure 3-4 Solid Ratio Effection on Extraction Rate of Hawthorn Polysaccharides 由表3-4可以知道及图3-4可以看出，当液固比增大时，山楂多糖提取率随着增加，增加幅度很大，但是液固比超过20：1mL/g后，山楂多糖产率随着减小，减小的幅度不小。由理论可以得到以下分析，液固比(提取剂用量即水的用量)对于多糖的提取率有很大影响，在一定范围内水量越大，多糖提取越完全，但水量的多少对后续的浓缩、醇沉和离心步骤效率影响很大，所以控制适当的水量是十分重要的。当液固比大于20：1(mL/g)时，离心后并不是所有多糖都以沉淀形式沉淀到离心管底部，而是有些多糖还以絮状形式漂浮在乙醇水溶液的最上层，所以收集多糖沉淀时，絮状多糖不可避免地被损失。因此，微波提取山楂多糖最佳液固比为20：1（mL/g）。溶剂pH值表3-5溶剂pH值对山楂多糖提取率的影响Table 3-5 Solvent pH Effection on Extraction Rate of Hawthorn Polysaccharides溶剂pH值357911多糖提取率（%） 3-5溶剂pH值对山楂多糖提取率的影响3-5 Solvent pH Effection on Extraction Rate of Hawthorn Polysaccharides由表3-5可以知道及图3-5可以看出，在溶剂pH值在37范时，随着溶剂pH值的增加山楂多糖提取率会相应增加，增加幅度很大，但是当溶剂pH值在79时，随着溶剂PH值增加山楂多糖提取率会相应减少，减小幅度很大，溶剂pH值在911范围时，随着溶剂pH值增加山楂多糖提取率会相应减少，减少幅度很小。由理论可以得到以下分析，溶剂的酸碱性可能会影响山楂细胞壁的通透性或者会使细胞壁的物质变性，影响溶出。表3-6微波提取实验方案的因素水平表Table 3-6 Microwave Extraction Experimental Program Factor Level Table因素 水平微波功率(W)溶剂pH值提取时间(s)液固比(mL/g)139054015:1226096025:1352078020:1表3-7微波提取实验方案设计的正交试验及结果Table 3-7 Design Of Microwave Extraction Experiments And Results Of Orthogonal Test试验号微波功率(W)溶剂pH值提取时间(s)液固比(mL/g)多糖提取率（%）111112122231333421235223162312731328321393321K1K2K3k1k2k3R由表3-7的数据分析可知A3B3C1D3为最佳条件，即功率为520W，溶剂pH值为7，提取时间为40s,液固比为20:1(mL/g)。而由极差分析可知微波功率的影响最大，其次是液固比、提取时间和溶剂pH值。由于正