备课素材：PCR技术的应用-高二下学期生物人教版选择性必修3.docx

PCR技术的应用2019版高中生物学选择性必修三提到，PCR技术用于目的基因的扩增：那么，除此之外，PCR技术还有哪些应用呢？PCR是众所周知的分子生物学技术之一。20世纪70年代，研究人员首次报道了使用合成引物和DNA聚合酶从模板复制单链DNA。然而直到1983年，Kary Mullis才发明出用于扩增目标DNA的研究工具，就是我们今天所熟知的PCR方法。从此以后，PCR成为分子生物学研究必不可少的一部分，被广泛应用于基础研究、疾病诊断、农业检测和法医调查等领域。1. 基因表达通常可通过PCR来检测不同细胞类型、组织和生物体在特定时间点的基因表达差异。首先，从目标样品中分离出RNA并将mRNA逆转录成cDNA。随后，通过由PCR扩增的cDNA数量，确定mRNA的初始水平。这一过程也被称为逆转录PCR， RT-PCR终点PCR 可通过凝胶里的扩增产物条带强度对RNA的表达进行定量（一种半定量方法）。例如，对起始cDNA进行连续稀释并扩增。通过凝胶电泳使不同起始量的终点PCR得率可视化，然后对条带强度进行定量，并以管家基因为参照进行标准化，预估扩增靶点的相对表达水平1 2。如今，终点PCR已基本被实时PCR 或qPCR 取代了，因为它们可获得更可靠和更准确的基因表达定量结果。2. 基因分型PCR可用于检测特定细胞或生物体中等位基因的序列差异。例如，基因敲除和敲入小鼠等转基因生物的基因分型3。引物对经设计位于目标区域侧翼，可根据是否存在扩增子及扩增子长度来检测遗传变异但是如果为了检测特定核苷酸突变，则必须对扩增的序列进行进一步分析。例如， PCR扩增子测序就是研究单核苷酸变异（SNVs）和单核苷酸多态性（SNP）的方法之一。强烈推荐使用高保真DNA聚合酶，以防止在PCR过程中引入多余的突变。通过PCR进行基因分型也是对癌症和遗传病中的 突变进行遗传分析的一个基本方式。3. 分子克隆PCR被广泛应用于目标DNA片段的克隆，该技术被称为 PCR 克隆。在直接PCR克隆中，DNA（如，gDNA、cDNA、质粒DNA）的目标区域被扩增并插入到特殊设计的兼容载体中。PCR克隆：通过PCR制备的插入片段被克隆到兼容载体中。(A) 直接PCR克隆技术包括TA和平端克隆。(B) 间接PCR克隆，扩增子可在插入到兼容载体之前被修饰，如进行限制性酶切除了制备插入片段，PCR也是一种在在克隆后筛选克隆是否携带目标插入片段的有效方法。引物经过设计，可以用于确定载体中插入片段是否存在和插入方向。4. 突变PCR克隆的一大优点是能够通过克隆将所需突变引入目的基因中，以便进行突变研究。在 定点突变中，经过设计的PCR引物可将碱基置换、删除或插入整合到特定序列中。引物定位到已克隆至质粒中的序列上。随后，含有引入突变的PCR产物通过自我连接，重新生成环状质粒，并用于转化感受态细胞。5. 甲基化PCR可用于研究位点特异性甲基化。在 甲基化特异性PCR（MSP）方法中，设计了两个引物对，以区分目标位点的甲基化状态78。首先使用重亚硫酸盐处理DNA样品，将未甲基化的胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U）。重亚硫酸盐处理不会影响甲基化的胞嘧啶(m5C) 。为了检测甲基化位点，一对引物经设计 带有 鸟嘌呤（G），可与目标序列中的 m5C 配对；为了检测未甲基化位点，另一对引物带有腺嘌呤（A），可与重亚硫酸盐转化分子中的U配对（随后，与后续PCR循环中的胸腺嘧啶（T）配对）。通过引物配对得到的阳性PCR扩增结果可用于确定位点的甲基化状态。甲基化研究中所使用的DNA聚合酶除了能够扩增富含AT的序列，还必须能够读取识别重亚硫酸盐处理后DNA中的U残基。而高保真DNA聚合酶含有来自于古细菌起源的尿嘧啶结合域，所以不适用于MSP（除非经过特殊修饰）。实时PCR 可代替终点PCR，为MSP提供更准确的甲基化定量分析。利用实时PCR，对PCR扩增子的熔解曲线分析是检测目标位点甲基化状态的一种替代性PCR方法。6. 测序PCR是为测序富集模板DNA的一种相对简单的方法。为保证DNA序列准确性，强烈建议使用高保真PCR来制备测序模板。在 Sanger测序中，PCR扩增片段经纯化并用于测序反应。使用常用的测序引物结合位点（如M13或T7“通用引物”结合位点）对PCR引物的 5末端进行标记，以简化测序工作流程。二代测序 （NGS）中，PCR被广泛用于构建DNA测序文库。在NGS文库制备中，DNA样品通过PCR反应富集（在起始量有限的情况下）并使用adaptor（以及用于多重检测的index）标记。除了具有高保真度，DNA聚合酶还应具有最小的扩增偏好性，从而使测序文库具有高覆盖度。7. 医学、法医学和应用科学PCR技术不仅可用于基础研究，还适用于日常的临床诊断、法医学调查和农业生物技术研究。这些应用要求可靠的性能、卓越的灵敏度和严格的标准。因此，所使用的PCR仪和PCR试剂必须符合这些要求和目的。分子诊断应用包括基因检测、致癌突变检测以及感染性疾病检测。在法医学中，利用 PCR进行人类身份鉴定是通过对独特的短串联重复序列（STR）进行扩增而区分个体的。在农业学中，PCR在食物病原体检测、育种植物基因分型和 GMO测试中具有重要作用。例1、随着2019nCoV新型冠状病毒（RNA病毒）的全球蔓延，全世界人民的人身安全受到了极大的威胁，经济发展也遭遇了前所未有的挑战。为了尽快打赢这场防疫阻击战，如何快速、准确地检测出病毒是关键。目前，采用RTPCR（逆转录聚合酶链式反应）技术检测新冠病毒核酸是最为主流的方法。检测步骤如下：患者的生物样本病毒灭活提取核酸RTPCR扩增。(1)PCR技术是指_。采用RTPCR技术检测2019nCoV病毒时，先要将病毒灭活，其目的是_，其次还会利用_把病毒RNA_成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。(2)PCR扩增目的基因时，需要在反应体系中加入_和cDNA模板、游离的dNTP，其特异性决定因素是_。(3)PCR反应中每次扩增大体分为变性、复性和延伸三个过程，复性时引物通过_和模板链结合。(4)PCR扩增仪工作关键是控制温度，扩增目的基因时所用酶的酶促反应最适温度是_。 答案：(1)     PCR技术是模拟体内DNA的复制过程，在体外扩增DNA分子的一种生物学技术     使病毒蛋白的高级结构受到破坏，蛋白不再有生理活性，失去感染、致病和繁殖能力     反转录酶     反转录(2)     引物#Taq酶     引物(3)碱基互补配对(4)7075#或72左右例2、通过咽拭子取样进行RT-PCR技术检测是目前临床上诊断新型冠状病毒感染疑似患者的常用方法，用于核酸检测的RT-PCR试剂盒的部分工作原理简图如下。回答下列问题： (1)RT-PCR是指以病毒的RNA 为模板通过_过程合成cDNA，并对cDNA进行PCR扩增的过程。PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏_与_的碱基配对。(2)利用RT-PCR试剂盒对新型冠状病毒进行检测时，除借助上述RT-PCR技术外，还需要有特异性探针，利用该探针对新型冠状病毒进行检测的原理是_。(3)除核酸检测外，研究人员还研发了基于病毒蛋白的检测技术，该项技术的关键是生产出能与新冠病毒结合的特异性抗体。生产该种抗体的大致方案如下：向小鼠体内注射新冠病毒的抗原蛋白；分离免疫小鼠的B淋巴细胞，并与小鼠的骨髓瘤细胞融合，多次筛选、检测，最终获得所需杂交瘤细胞；将获得的杂交瘤细胞在体外条件下做大规模培养，获得大量的特异性抗体。其中步骤中经多次筛选、检测后遭淘汰的细胞有_；步骤大规模培养时要注意定期更换培养液，其目的是_。 答案：(1)     逆转录     引物     模板(2)分子杂交 (3)     BB型、瘤瘤型融合细胞     防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害例3、 某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P。P是缺失特定氨基酸序列的P，FLAG是一种短肽，连接在P或P的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，但不影响P或P的功能。（1）为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物需满足的条件是_、为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的_（填“3'端”或“5'端”）。（2）PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是_。修改扩增P基因时使用的带有EcoR识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是_。（3）融合蛋白表达成功后，将FLAG-P、FLAG-P、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P不能降解UBC，由组结果的差异推测，药物A的作用是_；由组或组的差异推测，P中缺失的特定序列的作用是_。（4）根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是_。答案：（1）    . 两种引物分别与两条模板链3'端的碱基序列互补配对    . 5'端（2）    . 在转录出的mRNA中，限制酶识别序列对应的最后两个碱基与P基因对应的第一个碱基构成一个密码子，导致读码框改变，翻译出的氨基酸序列改变。   . 在EcoR识别序列前后增加碱基，使其碱基数目加上FLAG的碱基数目为3的倍数（3）    . 促进UBC与FLAG-P的结合    . P中缺失的特定序列是与UBC结合的关键序列（4）药物A促进UBC与FLAG-P的结合，从而促进蛋白P被蛋白酶识别并降解，达到治疗的目的。学科网（北京）股份有限公司