生化分离技术3.5 电泳技术电子课件 .ppt

生化分离技术3.5电泳技术电子课件 电泳技术电泳技术【项目简介】l浓缩是从溶液中除去部分溶剂的单元操作。浓缩和干燥都是采用一定的生产技术去除料液中的溶剂，但是有所不同。浓缩过程中，水分在物料内部是借对流扩散作用从液相内部达到液相表面而后除去，最低水分含量约30%（质量），一般为稳定状态的过程。而干燥过程中，水分在物料内部最终必将借分子扩散作用从固相中除去，且一般为不稳定状态的过程。l生化物质制备中，物质提取后、结晶前和制成高浓度原液时，一般要进行浓缩操作；分离纯化过程中及纯化所得物质溶液制成固态原料或成品时，需要进行干燥操作。浓缩和干燥技术是生化物质分离纯化工艺中不可或缺的技术。【知识要求】l（1）了解浓缩技术和干燥技术的各种方法。l（2）理解蒸发浓缩和冷冻浓缩的原理。l（3）理解热干燥和冷冻干燥的原理。l（4）理解红外干燥和微波干燥的原理。【技能要求】l（1）能够根据原料特征选择适宜的浓缩方法。l（2）能够根据原料特征选择适宜的干燥方法。l（3）能够认识和操作浓缩设备。l（4）能够认识和操作干燥设备。任务一电泳技术l一、电泳技术发展史l l18091809年俄国物理学家年俄国物理学家ReussReuss进行了世进行了世界上第一次电泳实验界上第一次电泳实验l l19371937年，瑞典科学家年，瑞典科学家TiseliusTiselius设计了设计了世界上第一台电泳仪，建立了移界电世界上第一台电泳仪，建立了移界电泳法，并于泳法，并于19481948年荣获诺贝尔奖。年荣获诺贝尔奖。7070年以来，电泳技术围绕制胶、电泳、年以来，电泳技术围绕制胶、电泳、染色三个技术环节，不断改进，以实染色三个技术环节，不断改进，以实现下列目标：现下列目标：1 1、提高分辨率及灵敏度。、提高分辨率及灵敏度。2 2、简化操作，缩短电泳时间。、简化操作，缩短电泳时间。3 3、扩大应用范围。、扩大应用范围。l l各类电泳技术已广泛应用于生命科学各类电泳技术已广泛应用于生命科学各个领域。各个领域。二、电泳的基本原理l电泳技术是使用电泳仪，利用带电微粒在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象把物质分离的技术。在一定在一定pHpH条件下，每一种分子都具有条件下，每一种分子都具有特定的电荷（种类和数量）、大小和形特定的电荷（种类和数量）、大小和形状，状，在一定时间内它们在相同电场中泳在一定时间内它们在相同电场中泳动速度不同，各自集中到特定的位置上动速度不同，各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。这就是带电粒子而形成紧密的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技术进行分离、分析和鉴定可以用电泳技术进行分离、分析和鉴定的基本原理。的基本原理。l 在电场中，推动带电质点在电场中，推动带电质点运动的力（运动的力（F F）等于质点等于质点所带净电荷量（所带净电荷量（Q Q）与电场强度（）与电场强度（E E）的乘积。）的乘积。l F FQ EQ El质点的前移同样要受到质点的前移同样要受到阻力（阻力（F F）的影响的影响,即：即：FF6 r6 r 式中式中:r r粒子半径，粒子半径，介质黏度，介质黏度，v v泳动速率泳动速率l当质点在电场中作稳定运动时：当质点在电场中作稳定运动时：QEQE6r6rl上式交换后可写成上式交换后可写成 /E/EQ/6rQ/6rl/E/E的含意为单位电场强度下的移动速度，这里的含意为单位电场强度下的移动速度，这里可用迁移率可用迁移率表示，即表示，即 /E/EQ/6rQ/6rl从上式可见，球形质点的迁移率，首先取决于自从上式可见，球形质点的迁移率，首先取决于自身状态，即与身状态，即与所带电量成正比所带电量成正比，与其半径及介质与其半径及介质粘度成反比粘度成反比。除了自身状态的因素外，电泳体系。除了自身状态的因素外，电泳体系中其它因素也影响质点的电泳迁移率。中其它因素也影响质点的电泳迁移率。三、影响电泳迁移速率的因素三、影响电泳迁移速率的因素l样品本身：带电量，分子大小，形状样品本身：带电量，分子大小，形状l电场强度：电压电场强度：电压l缓冲液：成分，缓冲液：成分，pH pH，离子强度，离子强度l温度温度l支持介质：电渗作用，吸附作用支持介质：电渗作用，吸附作用（1 1）样品本身：）样品本身：带电量、分子大小、形状。带电量、分子大小、形状。Q Q越多，越多，V V越越大；大；r r越小，越小，V V越大；球形分子越大；球形分子 纤维状纤维状（2 2）电场强度：）电场强度：X X越大，越大，V V越大越大 常压电泳：电场强度在常压电泳：电场强度在2 210 V/cm10 V/cm。高压电泳：电场强度在高压电泳：电场强度在2020200 V/cm200 V/cm。（3 3）缓冲液：）缓冲液：pH pH 决定决定Q Q，(pH-PI)(pH-PI)越大，越大，Q Q越多，越多，V V 越大；成分：性质稳定，不易电解。越大；成分：性质稳定，不易电解。离子强度：离子强度：0.02-0.2M0.02-0.2M。I I越大，样品电流减小，越大，样品电流减小，V V 变小；变小；I I越小，样品电流越大，越小，样品电流越大，V V越大，但样品易扩越大，但样品易扩 散。散。（5 5）支持介质：）支持介质：惰性材料，有一定坚韧度，以保存；惰性材料，有一定坚韧度，以保存；吸附力要小；无电渗作用吸附力要小；无电渗作用 电渗现象：电渗现象：液体对固体的相对移动，由缓冲液的液体对固体的相对移动，由缓冲液的水分子和支持介质的表面之间所产生的一种相关电荷水分子和支持介质的表面之间所产生的一种相关电荷所引起。电渗与电泳方向相同，所引起。电渗与电泳方向相同，V V变大；反之变小。变大；反之变小。吸附现象吸附现象 +-液相固相电渗流电渗示意图分子筛效应：分子筛效应：分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。分子量小，阻力小，移动快；分子量大，阻力大，移动慢。应。分子量小，阻力小，移动快；分子量大，阻力大，移动慢。图中图中图中图中A A A A，B B B B，C C C C均为阳离子，在直流电场作用下电泳情况示意图均为阳离子，在直流电场作用下电泳情况示意图均为阳离子，在直流电场作用下电泳情况示意图均为阳离子，在直流电场作用下电泳情况示意图分子量大小依次为分子量大小依次为分子量大小依次为分子量大小依次为MA=MBMCMA=MBMCMA=MBMCMA=MBMC，所带电荷量相同，所带电荷量相同，所带电荷量相同，所带电荷量相同Q Q Q QA A A A=Q=Q=Q=QB B B B=Q=Q=Q=QC C C C。ABC+-l四、电泳设备l电泳仪主要包括两个部分：电源和电泳槽。电源提供直流电，在电泳槽中产生电场，驱动带电分子的迁移。l电泳槽主要有水平式和垂直式两类（二）电泳仪的使用方法l1.首先用导线将电泳槽的两个电极与电泳仪的直流输出端联接，注意极性不要接反。l2.电泳仪电源开关调至关的位置，电压旋钮转到最小，根据工作需要选择稳压稳流方式及电压电流范围。l3.接通电源，缓缓旋转电压调节钮直到达到的所需电压为止，设定电泳终止时间，此时电泳即开始进行。l4.工作完毕后，应将各旋钮、开关旋至零位或关闭状态，并拨出电泳插头。（三）电泳仪使用注意事项l1.电泳仪通电进入工作状态后，禁止人体接触电极、电泳物及其它可能带电部分，也不能到电泳槽内取放东西，如有需要时，应先断电，以免触电。良好接地端，以防漏电l2.仪器通电后，不要临时增加或拨除输出导线插头，以防短路现象发生。l3.不同介质支持物的电泳不要同时在同一电泳仪上进行。l4.在总电流不超过仪器额定电流时（最大电流范围），可以多槽关联使用，但要注意不能超载。l5.某些特殊情况下需检查仪器电泳输入情况时，允许在稳压状态下空载开机，但在稳流状态下必须先接好负载再开机，否则电压表指针将大幅度跳动，容易造成不必要的人为机器损坏。l6.使用过程中发现异常现象，如较大噪音、放电或异常气味，须立即切断电源，进行检修，以免发生意外事故。五、常用的电泳技术及其应用（一）聚丙烯酰氨凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel,PAGEpolyacrylamide gel,PAGE）聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（简称：Acr）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（简称：Bis）在加速剂和催化剂的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）。CHCH2 2=CH=CHC=OC=ONHNH2 2CH2=CHCH2=CH C=O C=O NH NH CH CH2 2 NH NH C=O C=O CH CH2 2=CH=CH-CH-CH2 2-CH-CH-CHCH2 2-CH-CH-n nCHCH2 2-CH-CH-C=O C=O C=O C=O NH NH2 2 NH NH CH CH2 2 NH NH C=O C=O-CH-CH2 2-CH-CH-CHCH2 2-CH-CH-n nCHCH2 2-CH-CH-C=O C=O C=O C=O NH NH NH NH2 2丙烯酰胺丙烯酰胺N,N-N,N-亚甲基双丙烯酰胺亚甲基双丙烯酰胺聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺二、琼脂糖凝胶 从琼脂中精制分离出的胶状多糖，其分子结构大部从琼脂中精制分离出的胶状多糖，其分子结构大部分是由分是由1,31,3连接的连接的-D-D吡喃半乳糖和吡喃半乳糖和1,41,4连接的连接的3,63,6脱水脱水-D-D吡喃半乳糖交替形成的；吡喃半乳糖交替形成的；对于分子量较大的样品对于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。琼脂糖凝胶约可区分相差琼脂糖凝胶约可区分相差100bp100bp的的DNADNA片段，其分辨片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。广。琼脂糖凝胶的性能、结构与特点其优点如下其优点如下其优点如下其优点如下：l l琼脂糖凝胶孔径较大琼脂糖凝胶孔径较大琼脂糖凝胶孔径较大琼脂糖凝胶孔径较大，0.075%0.075%0.075%0.075%琼脂糖的孔径为琼脂糖的孔径为琼脂糖的孔径为琼脂糖的孔径为800nm800nm800nm800nm，可以分析百万道尔顿分子量的大分子，但分辨率较凝胶可以分析百万道尔顿分子量的大分子，但分辨率较凝胶可以分析百万道尔顿分子量的大分子，但分辨率较凝胶可以分析百万道尔顿分子量的大分子，但分辨率较凝胶电泳低。电泳低。电泳低。电泳低。l l机械强度高：可以在浓度机械强度高：可以在浓度机械强度高：可以在浓度机械强度高：可以在浓度1%1%1%1%以下使用；以下使用；以下使用；以下使用；l l无毒；无毒；无毒；无毒；l l染色、脱色程序简单，背景色较低；染色、脱色程序简单，背景色较低；染色、脱色程序简单，背景色较低；染色、脱色程序简单，背景色较低；l l热可逆性热可逆性热可逆性热可逆性；l l生物中性生物中性生物中性生物中性：一般不与生物材料结合；：一般不与生物材料结合；：一般不与生物材料结合；：一般不与生物材料结合；电泳系统的基本组成l l电泳槽：电泳槽：电泳槽：电泳槽：是凝胶电泳系统的核心部分，管式电泳槽、垂直是凝胶电泳系统的核心部分，管式电泳槽、垂直是凝胶电泳系统的核心部分，管式电泳槽、垂直是凝胶电泳系统的核心部分，管式电泳槽、垂直板电泳槽、水平板电泳槽板电泳槽、水平板电泳槽板电泳槽、水平板电泳槽板电泳槽、水平板电泳槽l l电源电源电源电源:聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳200-600V200-600V200-600V200-600V，载体两性电解质等，载体两性电解质等，载体两性电解质等，载体两性电解质等电聚焦电泳电聚焦电泳电聚焦电泳电聚焦电泳1000-2000V1000-2000V1000-2000V1000-2000V，固相梯度等电聚焦，固相梯度等电聚焦，固相梯度等电聚焦，固相梯度等电聚焦3000-8000V3000-8000V3000-8000V3000-8000Vl l外循环恒温系统外循环恒温系统外循环恒温系统外循环恒温系统:高电压会产生高热，需冷却；高电压会产生高热，需冷却；高电压会产生高热，需冷却；高电压会产生高热，需冷却；l l凝胶干燥器凝胶干燥器凝胶干燥器凝胶干燥器:用于电泳和染色后的干燥；用于电泳和染色后的干燥；用于电泳和染色后的干燥；用于电泳和染色后的干燥；l l灌胶模具：灌胶模具：灌胶模具：灌胶模具：制胶，玻璃板和梳子；制胶，玻璃板和梳子；制胶，玻璃板和梳子；制胶，玻璃板和梳子；l l电泳转移装置：电泳转移装置：电泳转移装置：电泳转移装置：利用低电压，大电流的直流电场，使凝胶利用低电压，大电流的直流电场，使凝胶利用低电压，大电流的直流电场，使凝胶利用低电压，大电流的直流电场，使凝胶电泳的分离区带或电泳斑点转移到特定的膜上，如电泳的分离区带或电泳斑点转移到特定的膜上，如电泳的分离区带或电泳斑点转移到特定的膜上，如电泳的分离区带或电泳斑点转移到特定的膜上，如PVDFPVDFPVDFPVDF膜膜膜膜l l电泳洗脱仪：电泳洗脱仪：电泳洗脱仪：电泳洗脱仪：回收样品回收样品回收样品回收样品l l凝胶扫描和摄录装置：凝胶扫描和摄录装置：凝胶扫描和摄录装置：凝胶扫描和摄录装置：对电泳区带进行扫描，从而给出定对电泳区带进行扫描，从而给出定对电泳区带进行扫描，从而给出定对电泳区带进行扫描，从而给出定量的结果。量的结果。量的结果。量的结果。电泳的一般过程水平板式电泳槽水平板式电泳槽垂直板式电泳槽垂直板式电泳槽垂直电泳槽及灌胶模具垂直电泳槽及灌胶模具 垂直板垂直板电泳装置电泳装置加样加样样品迁样品迁移方向移方向电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。混合样品混合样品带孔胶带孔胶 按分子按分子大小分离大小分离电泳方向电泳方向 电泳电泳 小分子小分子大分子大分子夹在两块玻璃夹在两块玻璃板之间的凝胶板之间的凝胶 电泳电泳缓冲液缓冲液 电泳电泳缓冲液缓冲液 加在槽中的经加在槽中的经SDS处理的样品处理的样品分子量小分子量小分子量大分子量大电源电源电泳后的凝胶径考马斯亮篮染色、脱色后的凝胶照片电泳后的凝胶径考马斯亮篮染色、脱色后的凝胶照片电泳前的准备工作l l缓冲系统的选择：缓冲系统的选择：缓冲系统的选择：缓冲系统的选择：保证蛋白质的溶解性能、稳定性以及生物活保证蛋白质的溶解性能、稳定性以及生物活保证蛋白质的溶解性能、稳定性以及生物活保证蛋白质的溶解性能、稳定性以及生物活性的保持；性的保持；性的保持；性的保持；电泳时间和分辨率：从理论上讲电泳时间和分辨率：从理论上讲电泳时间和分辨率：从理论上讲电泳时间和分辨率：从理论上讲PAGEPAGEPAGEPAGE可以在可以在可以在可以在任何任何任何任何pHpHpHpH进行，但实际上过酸或过碱的条件下进行，但实际上过酸或过碱的条件下进行，但实际上过酸或过碱的条件下进行，但实际上过酸或过碱的条件下将发生某种水解（脱酰胺）。因此，将发生某种水解（脱酰胺）。因此，将发生某种水解（脱酰胺）。因此，将发生某种水解（脱酰胺）。因此，pHpHpHpH应限应限应限应限制在制在制在制在3-103-103-103-10之间。之间。之间。之间。缓冲系统的选择原则l l是两种标准的对立权衡是两种标准的对立权衡是两种标准的对立权衡是两种标准的对立权衡如果缓冲液的如果缓冲液的如果缓冲液的如果缓冲液的pHpHpHpH选择在远离样品中各种蛋白的等选择在远离样品中各种蛋白的等选择在远离样品中各种蛋白的等选择在远离样品中各种蛋白的等电点，电点，电点，电点，蛋白质分子所带电荷的密度大，电泳时间蛋白质分子所带电荷的密度大，电泳时间蛋白质分子所带电荷的密度大，电泳时间蛋白质分子所带电荷的密度大，电泳时间短，区带细而窄；短，区带细而窄；短，区带细而窄；短，区带细而窄；如果缓冲如果缓冲如果缓冲如果缓冲pHpHpHpH选择在靠近被分离样品的一种或几种选择在靠近被分离样品的一种或几种选择在靠近被分离样品的一种或几种选择在靠近被分离样品的一种或几种蛋白质的等电点，蛋白质的等电点，蛋白质的等电点，蛋白质的等电点，则蛋白质分子之间的电荷密度则蛋白质分子之间的电荷密度则蛋白质分子之间的电荷密度则蛋白质分子之间的电荷密度差别大，分辨率就高；差别大，分辨率就高；差别大，分辨率就高；差别大，分辨率就高；常选择常选择常选择常选择pH 8.0-9.5pH 8.0-9.5pH 8.0-9.5pH 8.0-9.5的缓冲，常用的缓冲液有的缓冲，常用的缓冲液有的缓冲，常用的缓冲液有的缓冲，常用的缓冲液有Tris-Tris-Tris-Tris-甘氨酸（甘氨酸（甘氨酸（甘氨酸（pH 8.3-9.5pH 8.3-9.5pH 8.3-9.5pH 8.3-9.5），），），），Tris-Tris-Tris-Tris-硼酸硼酸硼酸硼酸(pH 8.3-(pH 8.3-(pH 8.3-(pH 8.3-9.3)9.3)9.3)9.3)和和和和Tris-Tris-Tris-Tris-醋酸（醋酸（醋酸（醋酸（pH 7.2-8.5pH 7.2-8.5pH 7.2-8.5pH 7.2-8.5）离子强度的选择l l离子强度不宜过高，此时电导率低，产热少，电泳离子强度不宜过高，此时电导率低，产热少，电泳离子强度不宜过高，此时电导率低，产热少，电泳离子强度不宜过高，此时电导率低，产热少，电泳速度快；但也不可过低，必须具有一定的缓冲能力，速度快；但也不可过低，必须具有一定的缓冲能力，速度快；但也不可过低，必须具有一定的缓冲能力，速度快；但也不可过低，必须具有一定的缓冲能力，过低的离子强度容易导致蛋白质絮凝。过低的离子强度容易导致蛋白质絮凝。过低的离子强度容易导致蛋白质絮凝。过低的离子强度容易导致蛋白质絮凝。l l一般选择缓冲液的离子强度为一般选择缓冲液的离子强度为一般选择缓冲液的离子强度为一般选择缓冲液的离子强度为0.01-0.1 mol/L0.01-0.1 mol/L0.01-0.1 mol/L0.01-0.1 mol/L之间之间之间之间凝胶浓度的选择l l由于由于由于由于PAGEPAGEPAGEPAGE电泳分离不仅取决于蛋白质的电荷密度，电泳分离不仅取决于蛋白质的电荷密度，电泳分离不仅取决于蛋白质的电荷密度，电泳分离不仅取决于蛋白质的电荷密度，而且取决于分子的大小、形状。因此，与凝胶的而且取决于分子的大小、形状。因此，与凝胶的而且取决于分子的大小、形状。因此，与凝胶的而且取决于分子的大小、形状。因此，与凝胶的分子筛效应（即凝胶的孔径与电泳的分辨率、电分子筛效应（即凝胶的孔径与电泳的分辨率、电分子筛效应（即凝胶的孔径与电泳的分辨率、电分子筛效应（即凝胶的孔径与电泳的分辨率、电泳速度）密切相关。泳速度）密切相关。泳速度）密切相关。泳速度）密切相关。l l根据凝胶孔径与被分离分子的大小和形状，可以根据凝胶孔径与被分离分子的大小和形状，可以根据凝胶孔径与被分离分子的大小和形状，可以根据凝胶孔径与被分离分子的大小和形状，可以将凝胶分为：将凝胶分为：将凝胶分为：将凝胶分为：非排阻性凝胶（非排阻性凝胶（非排阻性凝胶（非排阻性凝胶（unrestrictive gelunrestrictive gelunrestrictive gelunrestrictive gel）:浓度浓度浓度浓度0.7 0.7 0.7 0.7-1.0%-1.0%-1.0%-1.0%的琼脂糖凝胶；的琼脂糖凝胶；的琼脂糖凝胶；的琼脂糖凝胶；排阻性凝胶（排阻性凝胶（排阻性凝胶（排阻性凝胶（restrictive gelrestrictive gelrestrictive gelrestrictive gel）：浓度大于：浓度大于：浓度大于：浓度大于1%1%1%1%的琼脂糖凝胶和常规的琼脂糖凝胶和常规的琼脂糖凝胶和常规的琼脂糖凝胶和常规PAGEPAGEPAGEPAGE浓缩效应浓缩效应电荷效应电荷效应分子筛效应分子筛效应三大效应：三大效应：成分成分pH值值孔径孔径电泳缓冲液电泳缓冲液甘氨酸甘氨酸(慢离子慢离子)8.3样品样品蛋白质蛋白质6.7浓缩胶浓缩胶Cl-(快离子快离子)6.7大大分离胶分离胶Cl-(快离子快离子)8.9小小有效迁移率有效迁移率=迁移率迁移率 解离度解离度（1 1）缓冲液离子成分、缓冲液离子成分、PHPH的不连续性：的不连续性：电极缓冲液的电极缓冲液的pH=8.3pH=8.3，甘氨酸的电离小，有效迁移率小，称为慢离子；浓缩胶中的氯甘氨酸的电离小，有效迁移率小，称为慢离子；浓缩胶中的氯离子完全电离，有效迁移率大，称为快离子；蛋白质在浓缩胶离子完全电离，有效迁移率大，称为快离子；蛋白质在浓缩胶中介于二者之间。电泳开始后，氯离子跑得最快，留下一段低中介于二者之间。电泳开始后，氯离子跑得最快，留下一段低电导区，产生高电位梯度（电位与电导率成反比），使甘氨酸电导区，产生高电位梯度（电位与电导率成反比），使甘氨酸离子追赶氯离子，当二者速度相等时，形成一个不断向正极移离子追赶氯离子，当二者速度相等时，形成一个不断向正极移动的界面，动的界面，蛋白质夹在中间而被压缩蛋白质夹在中间而被压缩。（2 2）凝胶孔径的不连续性：凝胶孔径的不连续性：在电场作用下，蛋白质颗粒在大孔在电场作用下，蛋白质颗粒在大孔胶中阻力小，速度快，进小孔胶时，阻力大，速度慢，在两胶胶中阻力小，速度快，进小孔胶时，阻力大，速度慢，在两胶交界处，因迁移受阻而被压缩。交界处，因迁移受阻而被压缩。浓缩效应浓缩效应操作步骤：操作步骤：1.1.制备制备PAGEPAGE胶柱胶柱封口封口灌分离胶，封水灌分离胶，封水灌浓缩胶，封水灌浓缩胶，封水2.2.上样，电泳上样，电泳3 3.染色，观察结果染色，观察结果SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳l十二烷基磺酸钠十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳l主要用于测定蛋白质主要用于测定蛋白质主要用于测定蛋白质主要用于测定蛋白质亚基分子量亚基分子量亚基分子量亚基分子量以及未知蛋白质以及未知蛋白质以及未知蛋白质以及未知蛋白质分子量的测定；分子量的测定；分子量的测定；分子量的测定；l特点：特点：特点：特点：设备简单、操作简便、测定快速、重复性设备简单、操作简便、测定快速、重复性设备简单、操作简便、测定快速、重复性设备简单、操作简便、测定快速、重复性高、样品无需纯化。高、样品无需纯化。高、样品无需纯化。高、样品无需纯化。蛋白质样品用蛋白质样品用SDSSDS处理后亚基的解聚和分子形状的改变处理后亚基的解聚和分子形状的改变未知蛋白质分子量的测定未知蛋白质分子量的测定l基于上述基于上述基于上述基于上述SDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGE的原理介绍，我们可以利用的原理介绍，我们可以利用的原理介绍，我们可以利用的原理介绍，我们可以利用SDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGE电泳进行未知蛋白质的分子量测定；电泳进行未知蛋白质的分子量测定；电泳进行未知蛋白质的分子量测定；电泳进行未知蛋白质的分子量测定；以不同分子量的标准蛋白进行以不同分子量的标准蛋白进行以不同分子量的标准蛋白进行以不同分子量的标准蛋白进行SDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGE电泳得到不同电泳得到不同电泳得到不同电泳得到不同标准蛋白的电泳迁移率，标准蛋白的电泳迁移率，标准蛋白的电泳迁移率，标准蛋白的电泳迁移率，制作标准校正曲线制作标准校正曲线制作标准校正曲线制作标准校正曲线，然后对，然后对，然后对，然后对未知蛋白在相同条件下进行未知蛋白在相同条件下进行未知蛋白在相同条件下进行未知蛋白在相同条件下进行SDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGESDS-PAGE电泳，电泳，电泳，电泳，测定迁移测定迁移测定迁移测定迁移率，从标准曲线得到相应的分子量；率，从标准曲线得到相应的分子量；率，从标准曲线得到相应的分子量；率，从标准曲线得到相应的分子量；标准蛋白分子量标准蛋白分子量未未知知蛋蛋白白在一定的凝胶浓度下，在一定的凝胶浓度下，多肽链分子量的对数与多肽链分子量的对数与多肽链的相对迁移率成多肽链的相对迁移率成线性关系，所以可以通线性关系，所以可以通过标准曲线求未知多肽过标准曲线求未知多肽链分子量。链分子量。相对迁移率相对迁移率水平式电泳装置水平式电泳装置电泳缓冲液电泳缓冲液凝胶凝胶任任务务二二 新型新型辅辅助提取技助提取技术术一、超声辅助提取技术超超声声波波（supersonicwave或或ultrasonicwave）：频率高于率高于20kHz，人的听，人的听觉阈以外的声波。以外的声波。是中是中药提取新技提取新技术近年用于中近年用于中药制制剂质量控制如量控制如:1995年年版版中中国国药典典：收收载超超声声提提取取的的中中药品品种种117种种 2000年年版版中中国国药典典：收收载超超声声提提取取的的中中药品品种种232种种 2005年版年版中国中国药典典：404种种,用于含量用于含量测定定304种种超声波提取（超声波提取（supersonicwaveextractionSWE）：利利用用超超声声波波具具有有的的机机械械效效应、空空化化效效应及及热效效应，通通过增增大大溶溶剂（介介质）分分子子的的运运动速速度度，增增大大溶溶剂的的穿透力，提取中穿透力，提取中药中有效成分的方法。中有效成分的方法。声波：能使正常人听觉器官产生声音声波：能使正常人听觉器官产生声音感觉的机械波。感觉的机械波。频率范围：频率范围：10-20kHz。频率频率20kHz超声波超声波1.不需高温，不需高温，节省能源，省能源，热敏成分不破坏。敏成分不破坏。2.提取效率提高，提取效率提高，药材材资源不浪源不浪费 3.省溶省溶剂。4.物理物理变化，成分活性不受影响。化，成分活性不受影响。5.时间短，省短，省时，杂质少，成分含量高少，成分含量高（一）超声提取（一）超声提取（SWE）的特点）的特点（二）超声提取分离技术的原理1机械效应：SW在溶剂中的传播使介质质点沿着一定方向振动，强化介质的扩散、传质。SW产生的辐射压强使物料细胞变形、破裂、蛋白变性。SW给予溶剂、悬浮体的加速度，使得两者产生摩擦力，使分子解聚，有效成分溶解。2.化学效应：超声波的作用可促使发生或加速某些化学反应。各种氨基酸和其他有机物质的水溶液经超声处理后，特征吸收光谱带消失而呈均匀的一般吸收，这表明空化作用使分子结构发生了改变。3空化效应：溶剂中溶解的气泡在SW振动气泡定向扩散变大产生共振腔突然闭合，湮灭，即空化效应。产生很高压力细胞壁瞬间破裂，利于成分溶出。在湮灭过程中有放电、发光现象，可用于清洗、乳化、促进化学反应等。4热效应：SW在溶剂中传播是能量传递过程，声能被介质吸收转化成热能，导致介质和药材组织升温，加快成分溶解速度。（三）影响超声提取（三）影响超声提取（SWE）的因）的因素素1.提取提取时间的影响的影响一般一般10-100分分钟,时间,提取效果提取效果。例外：益母草碱例外：益母草碱 40mins含量最高。含量最高。书图3-82.频率率对提取效果的影响提取效果的影响频率越低提取效果越好，有例外的情况率越低提取效果越好，有例外的情况益母草益母草 频率频率/kHz 总蒽醌总蒽醌/大黄大黄 黄连素黄连素/黄连黄连 黄芩苷黄芩苷/黄芩黄芩 20 0.95 8.12 3.49 800 0.67 7.39 3.04 1100 0.64 6.39 2.503.温度对提取效果的影响温度对提取效果的影响 杜仲叶的水溶性成分的提取参数比较杜仲叶的水溶性成分的提取参数比较温度温度/频率频率/kHz 时间时间/mim 固溶物含量固溶物含量%得率得率%2030 26 45 0.81 17.0 4050 26 45 1.10 18.6 5060 26 45 1.11 19.1 8090 26 45 1.02 18.3 原因：原因：T，水中小气泡（空化核增多），对产生空化作用有利。，水中小气泡（空化核增多），对产生空化作用有利。T，水泡中蒸汽压，水泡中蒸汽压P，使气泡闭合时缓冲了空化，使气泡闭合时缓冲了空化 作用。对水而言，最佳温度是作用。对水而言，最佳温度是60。二、微波辅助提取技术l微波是一种波长在10.001m，频率在0.3300GHz的电磁波，具有很强的穿透性和很高的加热效率。微波提取技术是指在有效成分提取过程中（或提取的前处理）引入微波场，利用微波场的特性和特点来强化有效成分浸出的新型提取技术。三、酶辅助提取技术l酶是由生物体活细胞产生的，绝大多数以蛋白质形式存在的一类特殊的生物催化剂。酶辅助提取技术利用酶活性高及专一性高等特点，可以提高原料中有效成分的提取和分离效率，有较好的应用前景。四、高速逆流色四、高速逆流色谱技技术l逆流色逆流色谱（CCC）是以液相物）是以液相物质为固定相的液一液固定相的液一液色色谱，是一种特殊的，是一种特殊的连续萃取装置。萃取装置。l最早的逆流色最早的逆流色谱是液滴逆流色是液滴逆流色谱（DCCC），后来），后来发展了离心逆流色展了离心逆流色谱（CCCC）和高速逆流色）和高速逆流色谱（HSCCC）。）。l特征是互不相溶的两相在分离特征是互不相溶的两相在分离过程中做逆流运程中做逆流运动，溶溶质组分由于在两相中分配系数不同而得到分离。分由于在两相中分配系数不同而得到分离。l已被应用于生化、生物工程、医药、天已被应用于生化、生物工程、医药、天然产物化学、有机合成、环境分析、食然产物化学、有机合成、环境分析、食品、地质、材料等领域。品、地质、材料等领域。高速逆流色高速逆流色谱（HSCCC）l高速逆流色高速逆流色谱（HSCCC）利用了一种特殊）利用了一种特殊的流体的流体动力学（力学（单向流体向流体动力学平衡）力学平衡）现象，使两个互不相溶的溶象，使两个互不相溶的溶剂相在高速旋相在高速旋转的螺旋管中的螺旋管中单向分布。其中一相作固定相，向分布。其中一相作固定相，由恒流由恒流泵输送送载着着样品的流品的流动相穿相穿过固定固定相，利用相，利用样品在两相中分配系数的不同品在两相中分配系数的不同实现分离。分离。高速逆流色谱示意图l高速逆流色谱是在旋转运动中完成的，两相溶剂都被剧烈振动的离心力场，依其界面特征甩成极微小的颗粒，样品、各组分会在两相微粒的极大表面上分配，并且能在颗粒振荡与对流的环境中有效地传递。所以，它就象是把通常的溶剂萃取过程成千上万次地、高效地、自动连续地完成。