生化分离技术3.1 固相析出技术电子课件 .pptx

生化分离技术3.1固相析出技术电子课件项目一 固相析出技术延时符2生化分离技术学习目标【知识要求】（1）了解固相析出分离技术的应用。（2）熟悉盐析法的概念、原理、特点及影响因素。（3）掌握盐析法的具体操作方法及其注意事项。（4）熟悉有机溶剂沉淀法的概念、原理、特点及影响因素。（5）掌握有机溶剂沉淀法的具体操作方法及其注意事项。（6）熟悉结晶的基本原理，结晶的工艺过程。（7）掌握结晶的一般方法，影响晶体析出的主要因素及提高晶体质量的方法。34【技能要求】（1）能够进行盐析操作，并能对盐析效果进行评价。（2）能熟练进行有机溶剂沉淀操作，并能对有机溶剂沉淀效果进行评价。（3）能够进行等电点沉淀操作，并能对沉淀效果进行评价。（4）能够进行结晶操作，并能控制相应条件提高晶体的质量。（5）能够根据实际情况选择合适的沉淀或结晶方法，并进行相关数据运算。学习目标延时符5主 要内 容任务一盐析沉淀法任务二 有机溶剂沉淀任务三 其他沉淀法任务四 结晶技术项目介绍固相析出分离技术：过加入某种试剂或改变溶液条件，使溶质以固体形式从溶液中分离出来的操作技术。析出物为晶体时称为结晶法。析出物为无定形固体时称为沉淀法。味精蔗糖食盐晶体胃蛋白酶粉末活性炭无定形 晶体项 目 简 介晶体和无定形沉淀形成的区别：（1）、构成单位（原子、离子或分子）的排列方式不同。晶体是三维有序规则排列的固体，无定形物质是无规则排列的物质。（2）、固体析出速度不同。晶体析出速度慢，溶质分子具有足够时间进行排列。无定形沉淀析出速度快，溶质分子来不及进行有序排列。（3）、应用不同。结晶过程：应用于物质的纯化过程。只有同类分子和离子才能形成晶体。沉淀过程：应用于物质的粗提和除杂过程；在沉淀析出时常常夹杂杂质。8本项目主要介绍盐析沉淀、有机溶剂沉淀、等电点沉淀及结晶等方法从溶液中分离和提纯生物物质的方法。9任务一盐析沉淀法延时符10主 要内 容1.盐析法的基本原理盐析法的基本原理2.盐析用盐的选择盐析用盐的选择3.盐析操作过程及注意事项盐析操作过程及注意事项4.4.影响盐析的因素影响盐析的因素基本概念盐析：向蛋白质溶液中加入高浓度的中性盐（如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等），以破坏蛋白质的胶体性质，使蛋白质溶解度降低，从而从溶液中析出的现象称为盐析。盐溶：指在生物大分子溶液中加入中性盐的浓度较低时，生物大分子溶解度会增加的现象。12优点：盐析法具有经济、安全、操作简便的特点，常用于蛋白质、酶、多肤、多糖和核酸等物质的分离和纯化。缺点：盐析法存在共沉淀现象，分辨率不高，需和其他方法交替使用，一般用于生物分离的粗提纯阶段。此外，盐析完成后还需要对沉淀进行除盐操作。优 点 与 缺 点一.盐析法的基本原理1.生物大分子溶液是稳定的胶体溶液胶体稳定存在的原因：水化膜的存在同种电荷的存在2、盐析机理中性盐离子破坏蛋白质表面水化膜；中性盐离子中和大分子的表面电荷。二.盐析用盐的选择1、常用的无机盐种类：硫酸铵、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠、磷酸钾。（1）硫酸铵最常用的盐类，具有盐析作用强、廉价易得、分段效果好，不易引起变性失活等特点。（2）硫酸钠30度以下时溶解度较低，30度以上易造成大分子的变性，因此限制了硫酸钠的使用。（3）氯化钠氯化钠溶解度较硫酸铵低，因此应用也不及硫酸铵广泛。（4）磷酸钠磷酸钠溶解度也较低，受温度影响大，此外价格也比较高，故应用不广泛。2、选择盐种类的依据要有较强的盐析效果；一般多价阴离子的盐析效果比阳离子显著。要有足够大的溶解度，且受温度影响尽可能的小；这样便于获得高浓度的盐溶液。尤其是在低温的温度下操作，不至于造成盐结晶析出，影响盐析较高。盐析用盐在生物学上是惰性的，并且最好不引入给分离或测定带来干扰的杂质。来源丰富，价格低廉。173、盐离子的盐析作用规律半径小而带电荷量高的离子的盐析作用较强；而半径大、带电、荷量低的离子的盐析作用较弱。以下将各种盐离子的盐析作用按由强到弱的顺序排列:阴离子：IO3-PO43-SO42-CH3COO-Cl-ClO3-Br-NO3-ClO4-I-SCN-阳离子：Al3+H+Ca2+NH4+K+Na+1.确定盐析时硫酸铵的饱和度制作曲线的目的是：确定沉淀该物质所需硫酸铵饱和度三、盐析操作过程及注意事项（1）.加硫酸铵饱和溶液（实验室或小试采用此法）加入饱和硫酸铵溶液的体积计算。S2所需达到的硫酸铵饱和度，%；S1,原液中已有的硫酸铵饱和度，%；V0待盐析溶液的体积，L；V需要加人的饱和硫酸铵溶液的体积，L。（五）硫酸铵盐析操作2.盐析操作方式配制硫酸铵饱和溶液配制时，加入过量硫酸铵，加热至5060，用浓氨水调整pH至7.0左右，在025条件下平衡两天，有固体析出即达到100%饱和。使用时向待处理的溶液中加入饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌。（2）直接加固体硫酸铵（工业上采用直接加入法）计算固体硫酸铵的加入量。公式法：查表法：为达到所需饱和度，加入固体硫酸铵的数量可查阅在0和25下硫酸铵溶液饱和度计算表格。(2)使用时直接将硫酸铵固体加入溶液中，并不断搅拌，要求少量多次加入，适用于要求饱和度较高，而不增大溶液体积的情况。（五）硫酸铵盐析操作（五）硫酸铵盐析操作233.脱盐操作脱盐就是指将小分子的盐与目的物分离开。最常用的脱盐方法有两种，即透析和凝胶过滤。凝胶过滤脱盐不仅能除去小分子的盐，也能除去其他小分子的物质。与透析法相比，凝胶过滤脱盐速度比较快，对不稳定的蛋白质影响较小。但样品的黏度不能太高，不能超过洗脱液的23倍。4.盐析操作时注意事项加固体硫酸铵时，必须注意表中规定的温度，一般有0和室温两种。分段盐析时，要考虑到每次分段后蛋白质浓度的变化。为了获得实验的重复性，盐析的条件都必须严格控制。盐析后数要放置一段时间，待沉淀完全后再进行沉淀分离，过早的分离将影响产品收率。盐析过程中，搅拌必须是有规则和温和的，搅拌太快将引起蛋白质变性，产生泡沫。为了平衡硫酸铵溶解时产生的轻微酸化作用，沉淀反应最好在缓冲溶液中进行。四、影响盐析的因素1.盐离子强度和种类的影响一般来说，盐离子强度越大，蛋白质等生物分子的溶解度就越低。能够影响盐析沉淀效应的盐类很多，每种盐的作用大小不同。在进行分离时，一般从低离子强度到高离子强度顺次进行。即每一组分被盐析出来，经过过滤等操作后，再在溶液中逐渐提高盐的浓度，使另一种组分也被盐析出来。262.生物分子浓度的影响高浓度的生物分子溶液可以节约盐的用量，但生物分子的浓度过高时，溶液中的其他成分就会随着沉淀成分一起析出，发生严重的共沉淀现象；如果将溶液中生物分子稀释到过低浓度，则会造成反应体积的增大，进而导致反应容器容量的增大，需要更多的盐类沉淀剂和配备更大的分离设备，加大人力、财力的投入，并且回收率会下降。273.pH值对盐析的影响在生物分子的等电点位置，净电荷为零，其溶解度最小。一般情况下，蛋白质等生物分子带的净电荷越多，其溶解度就越大；相反，净电荷越少，溶解度就越小；对于特定的生物分子，有盐存在时的等电点与其在纯水溶液中的等电点是有偏差的。因此，在盐析时，要沉淀某一成分，应该将溶液的pH值调整到该成分的等电点；若要保留某一成分在溶液中不析出，则应该使溶液的pH值偏离该成分的等电点。284.温度对盐析的影响在低离子强度的溶液或纯水中，蛋白质等生物分子的溶解度在一定范围内随温度的升高而增加；但在高离子强度的溶液中，蛋白质或酶等生物分子的溶解度会随温度的升高而降低。一般情况下，盐析对温度无特殊要求，在室温下就可以完成。但有些生物分子（如某些酶类)对温度很敏感，需要盐析的温度为04，以防止其活性的改变。295.操作方式对盐析的影响操作方式的不同会影响沉淀物颗粒的大小。采用饱和硫酸铵溶液的连续方式，得到的颗粒比用固体盐的间歇方式的大；相反，采用饱和盐溶液的间歇方式进行操作，得到的沉淀颗粒就小些。在加盐过程中，适当的搅拌能防止局部浓度过大，在蛋白质等生物分子沉淀期间，温和的搅拌有利于生产大颗粒沉淀物质，但剧烈的搅拌则会对粒子产生较大的剪切作用，得到较小的颗粒。30五、盐析的应用盐析广泛应用于各类蛋白质的初级纯化和浓缩。例如，人干扰素的培养液经硫酸铵盐析沉淀，可使人干扰素纯化1.7倍，回收率为99%；白细胞介素2的细胞培养液经硫酸铵沉淀后，沉淀中白细胞介素2的回收率为73.5%，纯化倍数达到7。盐析沉淀法在某些情况下也可用于蛋白质的高度纯化。例如，利用无血清培养基培养的融合细胞培养液浓缩10倍后，加入等量的饱和硫酸铵溶液，在室温下放置1h后离心除去上清液，得到的沉淀物中单克隆抗体回收率达100%。对于杂质含量较高的料液，例如，从胰脏中提取胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，可利用反复盐析沉淀并结合其他沉淀法，制备纯度较高的酶制剂。31任务二有机溶剂沉淀法延时符32主 要内 容1.有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀的基本原理的基本原理2.有机溶剂有机溶剂的选择的选择3.有机溶剂沉淀法的操作方法有机溶剂沉淀法的操作方法4.4.影响影响有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀的因素的因素案例1：乙醇分级沉淀右旋糖苷 右旋糖酐系蔗糖发酵合成的一种高分子葡萄糖聚合物，是目前最佳的血浆代用品之一。临床上常用的有中分子右旋糖苷，主要用作血浆代用品，用于出血性休克、创伤性及烧伤性休克等。低、小分子右旋糖酐，能改善微循环，预防或消除血管内红细胞聚集和血栓等，亦有扩充血容量作用，但作用较中分子右旋糖酐短暂；用于各种休克所致的微循环障碍、心绞痛、急性心肌梗塞及其他周围血管疾病等案例1：乙醇分级沉淀右旋糖苷 12%右旋糖酐混合液 上清液 上清液 上清液 上清液38.5%乙醇 沉淀 相对分子质量在18万以上的右旋糖酐 60%乙醇 沉淀 相对分子质量在1万-2.5万的右旋糖酐 42.5%乙醇 沉淀 相对分子质量在4.5万-7万的右旋糖酐45%乙醇 沉淀 相对分子质量在2.5万-4.5万的右旋糖酐案例2：乙醇分级沉淀血清制备白蛋白。人血白蛋白，一直有“生命制品”、“救命药”之称。是临床急救的一种特殊药品。本品具有增加循环血容量和维持血浆渗透压的作用。用于失血、创伤及烧伤等引起的休克，脑水肿及大脑损伤所致的脑压增高，防治低蛋白血症及肝硬变或肾病引起的水肿和腹水。国内大型生物制药公司在低温下用不同浓度的乙醇沉淀分离人血清中各蛋白质，从而制得人血白蛋白。应用范围：有机溶剂沉淀法应用于蛋白质、酶、多糖、核酸、树脂、果胶、粘液质等生物大分子的分离纯化。有机溶剂沉淀法：通过往生物分子溶液中加入与水互溶的有机溶剂,生物分子在一定浓度的有机溶剂中溶解度具有差异而达到分离的方法。分步沉淀：不同生物产品沉淀时所需有机溶剂的浓度不同，因此调节有机溶剂的浓度，可以使混合物中的生物物质分段析出，达到分离纯化的目的。基 本 概 念优点：l分辨能力较高，一种溶质只在一个比较窄的浓度范围内沉淀；l有机溶剂沸点低，容易除去与回收，产品更纯净；有机溶剂密度低，与沉淀物密度差大，易固液分离；缺点：易引起蛋白变性；易燃、易爆。优 缺 点一、有机溶剂沉淀法的基本原理降低系统的介电常数，增加溶质分子间静电引力，互相吸引聚集，形成沉淀。溶剂介电常数越小，溶质间越容易聚集沉淀。H2O(水)78.5；HCOOH(甲酸)58.5；CH3OH(甲醇)32.7；C2H5OH(乙醇)24.5；CH3COCH3(丙酮)20.7；加入有机溶剂后，会使系统（水和有机溶剂的混合液）的介电常数减小，而使溶质分子（如蛋白质分子）之间的静电引力增加，从而促使它们互相聚集，并沉淀出来。破坏溶质表面的水化层。水溶性有机溶剂的亲水性强，它会抢夺本来与溶质结合的自由水，使其表面的水化层破坏。二、有机溶剂的选择常用于生物物质沉淀的有机溶剂有甲醇、乙醇、异丙醇和丙酮，还有二甲基甲视胶酰胺、二甲基亚砜、乙腈和2-甲基2,4-戊二醇等。1.乙醇乙醇是最常用的有机沉淀剂。乙醇具有极易溶于水、沉淀作用强、沸点适中、无毒等优点,广泛应用于沉淀蛋白质,核酸、多糖等生物高分子及氨基酸等。工业上常用95%96%（体积分数)的乙醇按照实际需要而稀释后加入蛋白质等生物分子溶液中进行沉淀,达到分离蛋白质等生物分子的目的。（一）常用有机溶剂的种类422.甲醇甲醇的沉淀作用与乙醇相当，但对蛋白质等生物分子的变性作用比乙醇、丙酮都小，由于其口服具有强毒性，限制了它的使用。3.异丙醇异丙醇是一种无色、有强烈气味的可燃液体，代替乙醇进行沉淀作用，但因易与空气混合后发生爆炸,易形成环境的烟雾现象，对人体具有潜在的危害作用，限制了它的使用。434.丙酮丙酮的沉淀作用大于乙醇，用丙酮代替乙醇作沉淀剂一般可以减少1/41/3的用量。但因其具有沸点较低.挥发损失大、对肝脏具有一定的毒性、着火点低等缺点，它的应用不如乙醇广泛。5.其它有机溶剂其它有机溶剂，如二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙腈和2-甲基-2,4-戊二醇等也可作为沉淀剂使用,但远不如乙醇、甲醇和丙酮使用普遍。44（二）有机溶剂的选择选择有沉淀作用的有机溶剂时，主要应考虑以下几个方面的因素。（1）介电常数小，沉淀作用强。（2）对生物分子的变性作用小。（3）毒性小.挥发性适中。（4）沉淀用溶剂一般要能与水无限混溶，一些与水部分混溶或微溶的溶剂，如氯仿、乙醚等也有使用,但使用对象和方法不尽相同。45（三）有机溶剂用量进行有机溶剂沉淀时，欲使原溶液达到一定的有机溶剂浓度，需加入的有机溶剂的体积可按以下公式计算:查表 P66表4-347三、有机溶剂沉淀的操作注意事项1.一般情况下，有机溶剂对身体具有一定的损害作用，在使用时采取好防护指施。2.高浓度有机溶剂易引起蛋白质变性失活，操作必须在低温下进行，并在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以避免局部浓度过大。3.操作时的pH值大多数控制在得沉淀出物分子的pI（等电点）附近。4.沉淀的条件一经确定，就必须严格控制，这样才能得到可重复的结果。用有机溶剂沉淀生物分子后，有机溶剂易除去，缺点是易使酶和具有活性的蛋白质变性。故操作时要求条件比盐析严格。对于某些敏感的酶和蛋白质等生物分子,使用有机溶剂沉淀尤其要小心。四、影响有机溶剂沉淀效果的因素1.温度一般来讲，低温有利于提高有机溶剂沉淀的效果。加入的有机溶剂都必须预先冷却至较低温度，并且操作要在冰浴中进行。加入有机溶剂必须缓慢并不断搅拌，避免局部过浓。2.有机溶剂的种类及用量一般情况下，有机溶剂介电常数越低，其沉淀能力就越强。不同溶质分子的溶解度发生急剧变化时所需的有机溶剂用量是不同的沉沉反应的操作过程中应该严格控制有机溶剂的用量493.样品浓度在相同的有机溶剂条件下，样品浓度越大，越容易沉淀，所需的有机溶剂浓度越低。优点是低浓度样品沉淀时，共沉淀作用小，有利于提高分离效果。对于高浓度的样品，可以节省有机溶剂，减少变性的危险，但与杂蛋白的共沉淀作用大，分离效果下降。通常使用520mg/mL的蛋白质初浓度为宜，可以得到较好的沉淀分离效果。4.溶液pH值为了达到良好的沉淀效果，常常把溶液的pH值调整到与生物分子的pI（等电点)相同或相近。因此,在控制溶液pH值时必须使溶液中人多数生物分子带有相同的电荷，而不要让目的物与主要杂质分子带相反的电荷，以避免出现严重的共沉淀现象。505.离子强度在溶液中加入低浓度的氯化钠、乙酸钠等物质，常常有利于生物分子的沉淀,甚至还具有保护蛋白质等生物分子，防止变性，减少水和有机溶剂互溶及稳定介质pH值的作用。介质中离子强度很高时,沉淀物中会夹杂较多的盐，因此若要用有机溶剂对盐析后的上清液进行沉淀.则必须先除去盐。6.样品浓度样品浓度较稀时,将增加有机溶剂的投入量和损耗，降低溶质的回收率,且易产生稀释变性，但稀的样品的共沉淀现象小，分离效果相对较好。样品浓度大时，会增加共沉淀现象发生的概率，降低分辨率，但这减少了有机溶剂的用量，提高了回收率，使变性的危险性也小于稀溶液。一般认为,蛋白质等生物分子的初浓度以0.5%2%为好，黏多糖则以1%2%较为合适。51任务二有机溶剂沉淀法延时符52主 要内 容1.等电点沉淀法2.水溶性非离子型聚合物沉淀法3.成盐沉淀法53一、等电点沉淀法等电点沉淀法是利用蛋白质等两性电解质在等电点时溶解度最低，而各种蛋白质又具有不同等电点的特点进行分离的方法。（一）原理及特点在等电点时，蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子净电荷为零，此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，所以蛋白质在等电点时，其溶解度最小，最易形成沉淀物。在实际工作中，普遍使用等电点法作为去杂手段。如工业上生产胰岛素时，在粗提液中先调pH=8.0去除碱性蛋白质，再调pH=3.0去除酸性蛋白质。54（二）等电点沉淀操作在进行等电点操作时，需要注意以下几个问题。1蛋白质种类的影响不同的蛋白质，具有不同的等电点。在生产过程中应根据分离要求，采用合适的pH值生产目的产物或者除去目的产物以外的杂质。如果是除去目的产物之外的杂蛋，若目的产物也是蛋白质，且等电点较高时，可先除去低于等电点的杂蛋白。如细胞色素C的等电点为10.7，在细胞色素C的提取纯化过程中，调pH=6.0除去酸性蛋白，调pH=7.58.0，除去碱性蛋白。552盐离子对等电点的影响同一种蛋白质在不同条件下，等电点不同。在盐溶液中，蛋白质若结合较多的阴离子(如Cl-、SO42-等)，则等电点移向较低的pH值，因为负电荷相对增多了，只有降低pH值才能达到等电点状态；若蛋白质结合较多的阳离子，则等电点的pH值升高，因为结合阳离子后，正电荷相对增多，只有pH值升高才能达到等电点状态。563目的成分对pH值的要求。过酸过碱会导致蛋白质等活性物质变性失活，因此在生产中应尽可能避免直接用强酸或强碱调节pH值，以免局部过酸或过碱。调节pH值应以尽量不增加新物质为原则，所用的酸或碱应与原溶液中的盐或即将加入的盐相对应。4由于各种蛋白质在等电点时，仍存在一定的溶解度，使沉淀不完全，而多数蛋白质的等电点又都十分接近，因此当单独使用等点电沉淀法效果不理想时，可以考虑采用几种方法结合来实现沉淀分离。57二、水溶性非离子型聚合物沉淀法（一）基本原理水溶性非离子型聚合物近年来逐渐广泛应用于核酸和酶的分离提纯。这类物质包括不同相对分子质量的聚乙二醇（PEG）、葡聚糖等，其中，应用最多的是聚乙二醇（PEG）。PEG的亲水性强，能溶于水和许多有机溶剂，对热稳定，有广范围的相对分子质量，在生物大分子制备中，采用较多的是相对分子质量为600020000的PEG。聚合物有较强的亲水性，同时与生物大分子之间以氢键相互作用形成复合物，由于重力作用和空间位置排斥而形成沉淀析出。58（二）操作方法用水溶性非离子型聚合物沉淀生物大分子时，一般有两种方法：选用两种水溶性非离子型聚合物组成液-液两相体系，使生物大分子在两相系统中不等量分配，从而造成分离。此方法是不同生物大分子表面结构不同，有不同的分配系数，并且有离子强度、pH值和温度等的影响，从而增强了分离的效果。选用一种水溶性非离子型聚合物和一种盐溶液，使生物大分子在同一液相中，由于被排斥而相互凝集沉淀析出。用该方法操作时应先离心除去大悬浮颗粒，调整溶液的pH值和温度，然后加人中性盐和聚合物至一定浓度，混匀再冷贮一段时间后，由于蛋白质在两种溶液中溶解度不同即形成沉淀。59（三）影响因素PEG的沉淀效果主要与其本身的浓度和相对分子质量有关，同时还受离子强度、溶液pH值和温度等因素的影响。用PEG等水溶性非离子型聚合物沉淀生物分子，在沉淀中含有大量的非离子型聚合物，这需要用吸附法、乙醇沉淀法或盐析法将目的物吸附或沉淀，而聚合物不被吸附、沉淀，从而将其去除，但在操作上具有一定的难度。60三、成盐沉淀法生物大分子和小分子都可以生成盐类复合物沉淀，这种方法称为成盐沉淀法。与生物分子的酸性基团相互作用形成的金属复合盐法（如铜盐、锌盐、钙盐、铅盐等）；与生物分子的碱性基团相互作用形成的有机酸复合盐法（如苦味酸盐、苦酮酸盐、鞣酸盐等）；无机复合盐法（如磷钼酸盐、磷钨酸盐等）。61任务四结晶技术延时符62主 要内 容1.晶体的概念2.结晶的过程3.影响结晶析出的主要条件4.提高晶体质量的方法63一、晶体的概念结晶是溶质呈晶态从溶液中析出来的过程，析出的固体称为晶体。很多生化物质利用形成晶体的性质进行分离纯化。溶液中的溶质在一定条件下分子有规则排列而结合形成晶体，只有同类分子或离子才能排列形成晶体，故结晶过程具有高度的选择性。任务四结晶技术641.稳定区：在SS曲线下半部区域，其浓度等于或低于平衡浓度，在这里不可能发生结晶，在该区域任意一点溶液均是稳定的。此时，溶液浓度未达到饱和，则固体的溶解速率大于沉积速率；2.介稳区：在SS曲线与TT曲线之间的区域。在介稳区，结晶不能自动进行，但如加入晶体，则能诱导结晶进行。这种加入的晶体称为晶种。介稳区又可细分为两个区：养晶区（TT曲线与SS曲线间）和刺激起晶区（TT曲线与TT曲线间）。溶液的过饱和与溶解度曲线3.不稳区：在TT曲线的上半部的区域，在该区域任意一点溶液均能自发形成结晶，溶液中溶质浓度迅速降低至SS线（饱和）。在此时，晶体生长速度快，晶体尚未长大，溶质浓度便降至饱和溶解度，此时已形成大量的细小结晶，晶体质量差。二、结晶的过程65结晶包括三个过程：过饱和溶液的形成；晶核的生成；晶体的成长。（一）过饱和溶液的形成结晶的首要条件是溶液达到过饱和。过饱和溶液的制备一般有四种方法。1.饱和溶液冷却法饱和溶液冷却法适用于溶解度随温度降低而显著减小的物质。例如，冷却L-氨酸的浓缩液至4左右，放置4h，L-脯氨酸结晶将大量析出。与此相反，对溶解度随温度升高而显著减少的场合，则应采用加温结晶。662.部分溶剂蒸发法部分溶剂蒸发法是将溶液在加压、常压或减压下加热，蒸发除去部分溶剂达到过饱和的结晶方法。此法主要适用于溶解度随温度的降低而变化不大的物质。例如，灰黄霉素的丙酮萃取液真空浓缩除去部分丙酮后即有结晶析出。3.化学反应结晶法此法是通过加入反应剂或调节pH值生成一个新的溶解度更低的物质，当其浓度超过它的溶解度时，就有结晶析出。例如：在头孢菌素C的浓缩液中加入乙酸钾，即析出头孢菌素钾盐；在利福霉素S的乙酸丁酯萃取浓缩液中加入氢氧化钠，利福霉素S即转为其钠盐而析出；四环素、氨基酸等水溶液，当其pH值调至等电点附近就会有结晶或沉淀。674.解析法解析法是向溶液中加入某些物质，使溶质的溶解度降低，形成过饱和溶液而结晶析出。抗溶剂最大的特点就是极容易溶解在原溶液的溶剂中。盐析结晶法：利用向溶液中加入合适的固体盐使溶液中溶质尽可能地结晶出来的方法称为盐析结晶法。如普鲁卡因青霉素结晶时加入一定量的食盐，可以使晶体容易析出。常用的固体盐有硫酸铵、氯化钠等。有机溶剂结晶法：向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂降低溶质的溶解度，使溶质结晶析出的方法。常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮等。在工业生产中,除了单独使用上述各法外,还常将几种方法合并使用。68（二）晶核的生成晶核是在过饱和溶液中最先析出的微小颗粒，是以后结晶的中心。单位时间内在单位体积溶液中生成的新晶核数目，称为成核速率。成核速率是决定晶体产品粒度分布的首要因素。工业结晶过程要求有一定的成核速率，如果成核速率超过要求,必将导致细小晶体生成,影响产品质量。1.成核机理（1）初级成核指过饱和溶液中的自发成核现象，即在没有晶体存在的条件下自发产生晶核的过程。根据饱和液中有、无其他微粒诱导分为：非均相成核和均相成核。（2）二次成核指向过饱和溶液中加入晶核，就会产生新的晶核，这种现象称为二次成核。工业生产中的成核现象通常为二次成核。692.常用的工业起晶方法在工业生产中，使溶液产生晶核，也叫起晶。采用合适的起晶方法，可以提高晶核质量，从而控制成品质量。常用的起晶方法有三种：自然起晶法、刺激起晶法和晶种起晶法。自然起晶法:溶剂蒸发进入不稳定区形成晶核、当产生一定量的晶种后，加入稀溶液使溶液浓度降至亚稳定区，新的晶种不再产生，溶质在晶种表面生长。剌激起晶法:将溶液蒸发至亚稳定区后，冷却，进入不稳定区，形成一定量的晶核，此时溶液的浓度会有所降低，进入并稳定在亚稳定的养晶区使晶体生长。晶种起晶法:将溶液蒸发后冷却至亚稳定区的较低浓度，加入一-定量和一-定大小的晶种，使溶质在晶种表面生长。该方法容易控制、所得晶体形状大小均较理想，是一种常用的工业起晶方法。70制备晶种的常用方法有两种：(1)如有现成晶体,可取现有晶体，经粉碎机粉碎，过筛，按各档目数20、30、40目分级投入一定量至待结晶溶液中使用。(2)如果没有现成晶体,可取12滴待结晶溶液置于表面玻璃皿上,缓慢蒸发除去溶液,可获得少量晶体。或者取少量待结晶溶液置于一试管中，旋转试管使溶液在管壁上形成薄膜,使溶剂蒸发至一定程度后,冷却试管,管壁上即可形成一层结晶。用玻璃棒刮下玻璃皿或试管壁上所得的结晶，蘸取少量接种到待结晶的溶液中,轻轻搅拌,并放置一定时间,即有结晶形成。713.成核速率的影响因素成核速率主要与溶液的过饱和度、温度以及溶质种类有关。在一定温度下，当过饱和度超过某一值时,成核速率则随过饱和度的增加而加快。要加快成核速率，就需要适当增加过饱和度,但过饱和度过高时,对成核速率并不利。实际生产中，常从晶体生长速率及所需晶体大小两个方面来选择适当的过饱和度。72在过饱和度不变的情况下，温度升高,成核速率也会加快,但温度又对过饱和度有影响，一般当温度升高时,过饱和度降低。所以温度对成核速率的影响要从温度与过饱和度相互消长的速率来决定。根据经验，一般成核速率开始随温度升高而上升，当达到最大值后,温度再升高,成核速率反而降低。成核速率与溶质种类有关。对于无机盐类,有下列经验规则:阳离子或阴离子的化合价越大，越不容易成核；在相同化合价下，含结晶水越多,越不容易成核。对于有机物质，一般结构越复杂，相对分子质量越大,成核速率就越慢。73（三）晶体的成长在过饱和溶液中已有晶核形成或加入晶种后,以浓度差为推动力,晶核或晶种将长大,这种现象称为晶体的成长。1.晶体成长理论工业结晶过程有关的晶体生长理论及模型很多。传统的有扩散理论、吸附层理论，近年来提出的有形态学理论，统计学表面模型，二维成核模型等。其中得到普遍应用的应该是扩散学理论。按照扩散学说，晶体的成长过程，有三个步骤组成。（1）分子扩散过程溶液主体中的溶质借扩散作用穿过晶体表面的滞留层到达晶体表面，即溶质从溶液主体转移到晶体表面的过程。（2）表面反应过程到达晶体表面的溶质长入晶体表面的过程，是晶体增大的过程，同时放出结晶热。（3）传热过程释放出的结晶热，再扩散传递到溶液主体的过程。742.影响晶体成长的因素晶体的成长速率也是影响晶体产品粒度大小的一个重要因素。影响晶体生长速率的因素主要有温度、过饱和度、搅拌和杂质等。温度对晶体生长速率的影响要大于成核速率，当溶液缓慢冷却时,得到较粗大的颗粒;当溶液快速冷却时,达到的过饱和程度较高，得到的晶体较细小。过饱和度增高一般会使结晶速率增大,但同时引起黏度增加,结晶速率增大受阻。搅拌能促进扩散,加速晶体生长，同时也能加速晶核形成,但超过一定范围,效果就会降低,搅拌越剧烈,晶体越细。应确定适宜的搅拌速率,获得需要的晶体，防止晶簇形成。杂质通过改变晶体与溶液之间的界面。上液层的特性而影响溶质长人晶面,或通过杂质本身在晶面上的吸附，发生阻挡作用；如果杂质和晶体的晶格有相似之处，杂质能长入晶体内而产生影响。75三、影响结晶析出的主要条件结晶时,在过饱和溶液中生成新相的过程涉及固液平衡，影响结晶操作和产品质量的因素很多。1.溶液浓度溶质的结晶必须在超过饱和浓度时才能实现，所以目的物的浓度是结晶的首要条件，一定要予以保证。浓度高，结晶收率高，但溶液浓度过高时，结晶物的分子在溶液中聚集析出的速率太快，超过这些分子形成晶核的速率便得不到晶体，只获得-些无定形固体颗粒；再者，溶液浓度过高，相应的杂质浓度也增大，容易生成纯度较差的粉末结晶；另外，溶液浓度过高，结晶壁容易产生晶垢，给结晶操作带来困难。因此，溶液的浓度应根据工艺和具体情况确定或调整，才能得到较好、较多的晶体。一般情况下，结晶操作应以最大过饱和度为限，在不易产生晶垢的过饱和度下进行。762.样品纯度大多数情况下,结晶是同种物质分子的有序堆砌。无疑杂质分子的存在是结晶物质分子规则化排列的空间障碍。因此，多数生物大分子需要相当的纯度才能进行结晶。一般来说，纯度越高，越容易结晶，结晶母液中目的物的纯度应接近或超过50%。杂质的积累除了会影响产物结晶的纯度外，还会改变目标产物的溶解度，改变晶体的习性，影响目标产物结晶的理化性质(如导电性、催化反应活性)及生物活性(如抗生素药效)。773.溶剂溶剂对于晶体能否形成和晶体质量的影响十分显著，故在结晶试验中挑选合适的溶剂时应考虑：所用溶剂不能和结晶物质发生任何化学反应；选用的溶剂应对结晶物质有较高的温度系数，以便利用温度的变化达到结晶的目的；选用的溶剂应对杂质有较大的溶解度，或在不同的温度下结晶物质与杂质在溶剂中应有溶解度的差别；所用溶剂为易挥发的有机溶剂时，考虑操作方便、安全。工业生产，上还应考虑成本高低、是否容易回收等。784.pH值一般来说，两性生化物质在等电点附近溶解度低，有利于达到过饱和使晶体析出，所以生化物质结晶时的pH值一般选择在等电点附近。例如,溶菌酶的5%溶液，pH值为9.510，在4放置过夜便析出晶体。5.搅拌与混合增大搅拌速率可提高成核和生长速率，但搅拌速率过快会造成晶体的剪切破碎，影响结晶产品质量。在工业生产中应尽量利用直径或叶片较大的搅拌桨，并注意控制搅拌桨的转速。796.温度根据操作温度的不同，生成的晶形和结晶水会发生改变，因此，结晶操作温度一般可控制在较小的温度范围内。从生物活性物质的稳定性而言，一般要求在较低的温度下结晶，这样不容易变性失活。另外，低温可使溶质溶解度降低而有利于溶质的饱和，还可避免细菌繁殖。因此,生化物质的结晶温度多控制在020，对富含有机溶剂的结晶体系则要求更低的温度。但也有某些酶，如猪糜胰蛋白酶,需要在稍高的温度（25）下才能较好地析出晶体。另外，若温度过低，有时由于黏度大会使结晶生成变慢，可在低温下析出结晶后适当升温。通过降温促使结晶时，如果降温快,则结晶颗粒小;降温慢,则结晶颗粒大。80四、提高晶体质量的方法晶体的质量主要指晶体的大小、形状和纯度三个方面。工业上通常希望得到粗大而均匀的晶体。粗大而均匀的晶体较细小不规则的晶体便于过滤和洗涤，在储存过程中不容易结块。1.晶体大小过饱和度增加能使成核速度和晶体生长速度增快，但成核速度增加更快，因而得到细小的晶体。尤其过饱和度很高时影响更为显著。当溶液快速冷却时，能达到较高的饱和度，得到较细小的晶体；反之，缓慢冷却常得到较大的晶体。搅拌能促进成核加快扩散，提高晶体长大的速度，但当搅拌达到一定程度后再加快搅拌速度效果就不明显；相反，晶体还会被打碎。经验表明，搅拌越快，晶体越细。812.晶体形状同种物质用不同方法结晶时，得到的晶体形状可以完全不一样，虽然他们属于同种一种晶系。外形的变化是由于在个方向生长受阻，或在另一方向生长加速所致。前已指出，快速冷却常导致针状结晶。其他影响晶形的因素有过饱和度、搅拌、温度、pH等。从不同溶剂中结晶常得到不同的外形。例如，普鲁卡因青霉素在水溶液中结晶得方形晶体，而从乙酸丁酯中结晶呈长棒状。杂质的存在也会影响晶型，杂质可吸附在晶体的表面上，而使其生长速度受阻。水溶液中结晶方形晶体乙酸丁酯中结晶长棒形晶体823.晶体的纯度从溶液中结晶析出的晶体常会包含母液、尘埃和气泡等。要防止夹带气泡可不用强烈搅拌和避免激烈翻腾。晶体表面有一定的物理吸附能力，因此表面上有很多母液和杂质。晶体越细小，表面积越大，吸附的杂质也就越多。表面吸附的杂质可通过晶体的洗涤除去。当结晶速度过大时（如过饱和度较高、冷却速度很快时），常容易形成晶簇，而包含母液等杂质，或晶体对溶液有特殊的亲和力，晶格中常会包含溶剂。对于这种杂质，用洗涤的方法不能除去，只能通过重结晶来除去。例如，红霉素从有机溶剂中结晶时，用每一分子碱可含13个分子丙酮，只有在水中结晶才能除去。杂质与晶体具有相同晶形，称为同结晶现象。对于这种杂质需用特殊的物理化学方法分离除去。834.晶体结块晶体的结块给使用带来很多不便。结块的主要原因是母液没有洗净，温度的变化会使母液中溶质析出，而使颗粒胶结在一起。另外，吸湿性强的晶体容易结块。当空气中湿度较大时，表面晶体吸湿溶解成饱和溶液，充满于颗粒缝隙中，以后如空气中湿度降低时，饱和溶液蒸发又析出晶体，而使颗粒胶结成块。均匀整齐的颗粒晶体结块倾向较小，即使发生结块，由于晶块结构疏松，单位体积的接触点少，结块容易弄碎。粒度不均匀的晶体，由于大晶粒之间的空隙充填着较小晶粒，单位体积中接触点增多，结块倾向较大，而且不容易弄碎。晶粒均匀整齐，但为长柱形，能挤在一起而结块。845.重结晶重结晶是将晶体用合适的溶剂溶解，再次结晶，使纯度提高。因为杂质和结晶物质在不同溶剂和不同温度下的溶解度是不同的。重结晶的一般操作过程为：选择合适的溶剂；将经过粗结晶的物质加入少量的热溶剂中，并使之溶解；冷却使之再次结晶；分离母液；洗涤晶体。重结晶的关键是选择合适的溶剂。项目四 实训项目延时符85生化分离技术86实训1硫酸铵盐析法分级分离血浆中的IgG87【实训目的】1.了解硫酸铵沉淀蛋白质的原理；2.掌握硫酸铵分级沉淀分离血浆中LgG的基本操作和方法。88【实训原理】LgG是免疫球蛋白（简称IgG）的主要成分之一，分子量约为15万16万。gG是动物和人体血浆的重要成分之一。血浆蛋白质的成分多达70余种，要从血浆中分离出IgG,首先要进行尽可能除去其他蛋白质成分的粗分离程序，使IgG在样品中比例大为增高，然后再纯化而获得IgG。盐析法是粗分离蛋白质的重要方法之一，是利用各种蛋白质所带电荷不同、相对分子质量不同，从而在高浓度的盐溶液中溶解度就不同，因此一个含有几种蛋白质的混合液，就可用不同浓度的中性盐来使其中各种蛋白质先后分别沉析下来，达到分离纯化的目的，这种方法称为分级盐析。其中最常用的盐析剂是硫酸铵，本实训利用硫酸铵饱和溶液沉淀并分离目的蛋白质。89【实训器具与试剂】1.材料准备新鲜动物血浆或血清(无溶血现象)。2.试剂（1）饱和硫酸铵溶液:取化学纯(NH4)2SO4800g，加蒸馏水1000mL，不断搅拌下加热至5060，并保持数分钟，趁热过滤，滤液在室温中过夜，有结晶析出，即达到100%饱和度，使用时用浓NH4OH调至pH7.0。（2）0.2mol/LpH7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)其配制方法如下:3.仪器离心机、烧杯、高精度pH试纸、大容量瓶、移液管、玻璃棒等。90【实训操作步骤】1.在1支离心管中加入5mL血清和5mL0.0lmol/LpH7.0磷酸盐缓冲液，混匀。2.用胶头滴管吸取饱和硫酸铵溶掖，边滴加边搅拌于血浆溶液中，使溶液的最饱和度为20%，用滴管边加边搅拌，是为防止饱和硫酸铵一次性加入或搅拌不均匀造成局部过饱和的现象，使盐析达不到预期的饱和度，得不到目的蛋白质。搅拌时不要过急以免产生过多泡沫，致使蛋白质变性。3.加完后应在4C放置15min,使之充分盐析（蛋白质样品量大时，应放置过夜）。然后以3000r/min离心10min，弃去沉淀（沉淀为纤维蛋白原），在上清液中为清蛋白、球蛋白。914.量取上清液的体积，置于另一离心管中，用滴管继续在上清液中滴加饱和硫酸铵溶液，使溶液的饱和度达到50%（计算出应加人饱和硫酸铵溶液的休积）。加完后在4放15min，以3000r/min离心10min，清蛋白在上清液中，沉淀为球蛋白。弃去上清液，留下沉淀部分。5.将所得的沉淀再溶于5mL0.01mol/L，pH7.0磷胶盐缓冲液中。滴加饱和硫酸铵溶液，使溶液的饱和度达35%（计算出应加人饱和硫酸铵溶液的体积）。加完后4放置20min,3000r/min离心15min，a,球蛋白在上清液中，沉淀为IgG.。弃去上清液，即获得粗制的IgG沉淀。92【实训结果与处理】称量所得的沉淀的质量，分析影响产品收率的因素。【思考与讨论】1.如何继续分离纯化上清液中的球蛋白？2.如何加磷酸盐缓冲液？93实训2槐耳粗多糖的提取94【实训目的】1、掌握槐耳粗多糖的提取过程。2、了解分级沉淀的