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细胞培养基础知识 陈鹏鹏概念狭义 群体培养广义 还包括克隆培养 群体培养 克隆培养体外培养细胞的分型贴附型 必须贴附于支持物表面才能生长悬浮型 于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面细胞的生长和增殖过程(1)培养细胞生命期(三个阶段)：a.原代培养或初代培养期 从体内取出的组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1-4周b.传代期 原代培养的细胞一经传代后便改称细胞系，在全生命期中此期的持续时间最长，在培养条件较好的情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型。c.衰退期 在此期间细胞开始时虽仍然存活，但增殖已经很缓慢并逐渐完全停止，进而细胞发生衰亡、死亡(传代3050次以后)(2)每代细胞的生长过程a.滞留期：包括游离期及潜伏期 游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮态，也称为悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。10min4h。潜伏期：此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为624h。b.指数增生期：又称对数期。此期间细胞增殖旺盛，成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。细胞生长增殖状况可以依据细胞倍增情况(细胞群体倍增时间)及细胞分裂指数等来判断。(35天)c.生长停止期(平顶期)：此期可供细胞生长的底物面积已被生长的细胞所占满，细胞虽尚有活力但已不再分裂增殖。此时细胞虽已停止生长，但仍存在代谢活动并可继续存活一定的时间。基本培养技术原代培养取材解剖或解离组织块接种机械法消化法胰蛋白酶胶原酶EDTA溶液传代培养消化传代不消化传代 针对悬浮生长和半悬浮生长a 吸光培养瓶中的培养液b 加适量的胰酶，待细胞间隙加大、快变圆时加血清中和c 用吸管吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液d 离心，弃上清加培养液e 分装接种，放入培养箱冻存和复苏原则：慢冻快融复苏的方法（1）从液氮中取出冷冻管，迅速投入3738水浴中，使其融化 （1分钟左右）；（2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上；（3）低速离心3-10分钟；（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。无菌培养工作环境和设备常用的培养器皿的清洗消毒操作技术方面整个操作过程要迅速敏捷但不能过快，以免形成气流。超净台内放置的所有培养瓶瓶口不能与与风向相逆，不允许用手触及器皿的无菌部分，如瓶口。开启或封闭瓶口操作时要经过酒精灯的烧灼，并在火焰附近工作。吸取培养液、DPBS或其它试剂是注意换管，防止交叉污染或污染扩大。使用培养液前，不宜较早开启瓶口。不在使用的培养液应立即封口。培养的细胞在处理之前不要过早的暴露空气中。操作时不要交谈、咳嗽，以防止唾沫和呼出气流引发污染。操作完毕后应将工作台面整理好，并消毒擦拭工作面，关闭超净台。注意事项1、实验进行前，超净台紫外灯照射30-60分钟灭菌，以75%酒精擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风扇运转几分钟后，才开始实验操作。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以75%酒精擦拭超净台面。操作间隔应让无菌操作台运转15分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。2、无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、移液枪等可以放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以75%酒精擦拭后才带入超净台内。实验操作应在台面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。3、定期检测下列项目：a.CO2培养箱之CO2浓度、温度、及水盘是否有污染。b.无菌操作台内之airflow压力，定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜，预滤网(300小时/预滤网，3000小时/HEPA)。c.水盘的水用无菌水，定期更换水槽的水。4、粉末培养基配制好后(加了血清)，一般在4度尽量不要超过1个月，如在-20度存放时间可长一些，但最好也不要超过3-4个月。5、一定要注意CO2培养箱的卫生，培养基放入后升温，容易在培养瓶身上吸附大量细菌。谢谢！