高中生物教学课程血红蛋白的提取与分离人教选修.pptx

教学目标教学重点教学难点1.理解色谱法、电泳法等分离大分子的基本原理理解色谱法、电泳法等分离大分子的基本原理2.了解缓冲液的组成及其作用了解缓冲液的组成及其作用 3.血红蛋白的分离样品处理血红蛋白的分离样品处理凝胶色谱法的原理凝胶色谱法的原理电泳法分离大分子的原理电泳法分离大分子的原理分离生物大分子的基本思路：分离生物大分子的基本思路：选用一定的选用一定的物理或化学物理或化学的方法分离具有的方法分离具有不同物理或化学性质的不同物理或化学性质的生物大分子生物大分子。凝胶色谱法（凝胶色谱法（分配色谱法分配色谱法）凝胶：是由是由多糖类化合物分子多糖类化合物分子（如（如葡聚糖或琼脂糖葡聚糖或琼脂糖）在在一定的条件下互相交联在一起构成的一定的条件下互相交联在一起构成的多孔小球体多孔小球体（凝胶粒），内部有许多贯穿的通道。（凝胶粒），内部有许多贯穿的通道。凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示凝胶色谱法（凝胶色谱法（分配色谱法分配色谱法）凝胶色谱法的原理当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量 较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢移动速度较慢;而相对而相对分子量较大分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通的蛋白质无法进入凝胶内部的通 道，只能在道，只能在凝胶外部凝胶外部移动，路程移动，路程较短较短，移动速度，移动速度较较 快快。相对分子质量不同相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。的蛋白质分子因此得以分离。依据的特性是：依据的特性是：依据的特性是：依据的特性是：蛋白质分子量的大小。蛋白质分子量的大小。蛋白质分子量的大小。蛋白质分子量的大小。凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示凝胶色谱法分离蛋白质的原理凝胶色谱柱洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。凝胶电泳法凝胶电泳法电泳电泳带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。类型类型:琼脂糖琼脂糖凝胶电泳、凝胶电泳、聚丙稀酰胺聚丙稀酰胺凝胶电泳。凝胶电泳。血血血血液液液液血浆血浆血浆血浆水水水水 分分分分其他物质：其他物质：其他物质：其他物质：血浆蛋白、血浆蛋白、血浆蛋白、血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等无机盐、磷脂、葡萄糖等无机盐、磷脂、葡萄糖等无机盐、磷脂、葡萄糖等血细血细血细血细 胞胞胞胞白细胞白细胞白细胞白细胞血小板血小板血小板血小板红细胞红细胞红细胞红细胞（最多）（最多）（最多）（最多）血红蛋白血红蛋白血红蛋白血红蛋白（90909090）两个两个两个两个肽链肽链肽链肽链两个两个两个两个一肽链一肽链一肽链一肽链四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团四个亚铁红素基团2.2.血液有哪些成分？血液有哪些成分？血液有哪些成分？血液有哪些成分？1.1.1.1.用鸡的红细胞提取用鸡的红细胞提取DNADNADNADNA，用哺乳动物的红细胞，用哺乳动物的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有鸡的红细胞具有细胞核，含有鸡的红细胞具有细胞核，含有鸡的红细胞具有细胞核，含有DNADNADNADNA，便于进行，便于进行，便于进行，便于进行DNADNADNADNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。白含量丰富，便于提取血红蛋白。白含量丰富，便于提取血红蛋白。白含量丰富，便于提取血红蛋白。二、实验操作样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定1.1.样品处理：样品处理：（一）蛋白质提取和分离步骤（一）蛋白质提取和分离步骤（二）操作过程（二）操作过程 本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎 动物的血液来分离血红蛋白。动物的血液来分离血红蛋白。(1)(1)(1)(1)红细胞的洗涤红细胞的洗涤红细胞的洗涤红细胞的洗涤:洗涤目的洗涤目的洗涤目的洗涤目的:去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化。分离纯化。洗涤操作：洗涤操作：洗涤操作：洗涤操作：1 1、采集血样。注意、采集血样。注意要加入柠檬酸钠防止血液凝固。2 2、低速短时间低速短时间离心（速度越高和时离心（速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果）分离的效果）3 3、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。4 4、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为0.90.9的氯化的氯化钠钠溶液洗涤。溶液洗涤。5 5、低速离心（低速短时间）、低速离心（低速短时间）6 6、重复三、重复三次，直至上清液中已次，直至上清液中已没有黄色没有黄色，表明洗涤干净。，表明洗涤干净。(2)(2)(2)(2)血红蛋白的释放：血红蛋白的释放：血红蛋白的释放：血红蛋白的释放：加蒸馏水到加蒸馏水到原血液体积原血液体积，再加再加4040体积的体积的甲苯甲苯 ，置于置于磁力搅拌器磁力搅拌器上充分搅拌上充分搅拌1010分分钟钟（加速细胞破裂加速细胞破裂）,细胞破裂释放出细胞破裂释放出血红蛋白。血红蛋白。(3)(3)(3)(3)分离血红蛋白溶液：分离血红蛋白溶液：分离血红蛋白溶液：分离血红蛋白溶液：过程：过程：过程：过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以将搅拌好混合液转移到离心管内，以 2000r/min2000r/min的速度离心的速度离心10 min10 min。试管中溶液层次：试管中溶液层次：试管中溶液层次：试管中溶液层次：第第1 1层（最上层）：甲苯层（层（最上层）：甲苯层（无色无色 透明透明）；第）；第2 2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白白 色薄层固体色薄层固体）；第）；第3 3层（中下层）：血红蛋白的水溶层（中下层）：血红蛋白的水溶 液层（液层（红色透明液体红色透明液体）；第）；第4 4层（最下层）：杂质沉层（最下层）：杂质沉 淀层（淀层（暗红色暗红色）。）。分离：分离：分离：分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏 斗中静置片刻后，分出下层的斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体红色透明液体。二、实验操作2 2、血红蛋白的粗分离、血红蛋白的粗分离-透析：透析：过程：过程：过程：过程：取取1ml1ml的血红蛋白溶液装入的血红蛋白溶液装入透析袋透析袋中，将透中，将透 析袋放入盛有析袋放入盛有300ml300ml的物质的量浓度为的物质的量浓度为20mmol/l20mmol/l的的 磷酸缓冲液磷酸缓冲液中（中（pHpH为为7.07.0），透析），透析1212小时。小时。透析目的：透析目的：透析目的：透析目的：除去样品中分子量较小的杂质除去样品中分子量较小的杂质。实验操作原理：透析袋能使小分子自由进出，而大原理：透析袋能使小分子自由进出，而大原理：透析袋能使小分子自由进出，而大原理：透析袋能使小分子自由进出，而大分子保留在袋内。分子保留在袋内。分子保留在袋内。分子保留在袋内。透析过程动画演示透析过程动画演示3 3、分离纯化血红蛋白、分离纯化血红蛋白-凝胶色谱操作凝胶色谱操作:（1 1 1 1）凝胶色谱柱的制作：）凝胶色谱柱的制作：）凝胶色谱柱的制作：）凝胶色谱柱的制作：（2 2）凝胶色谱柱的装填）凝胶色谱柱的装填 凝胶的选择：凝胶的选择：凝胶的选择：凝胶的选择：A A、材料：、材料：交联葡聚糖凝胶（交联葡聚糖凝胶（G-G-7575）。）。B B、代表意义：、代表意义：“G G”表示凝胶的交联程度，膨表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围胀程度及分离范围。7575表示凝胶的得水值，即每克凝表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水胶膨胀时吸水7.57.5克。克。凝胶的前处理：凝胶的前处理：凝胶的前处理：凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：配置凝胶悬浮液：计算并称计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。配成凝胶悬浮液。凝胶色谱柱的装填方法：凝胶色谱柱的装填方法：凝胶色谱柱的装填方法：凝胶色谱柱的装填方法：A A、固定：、固定：将色谱柱将色谱柱装置固定在支架上。装置固定在支架上。B B、装填：、装填：将凝胶悬浮液一次性将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。填装均匀。注意：注意：1 1、凝胶装填时尽量紧密，以降低、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。凝胶颗粒之间的空隙。2 2、装填凝胶柱时不得有气泡、装填凝胶柱时不得有气泡存在：存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果降低分离效果。洗涤平衡：洗涤平衡：洗涤平衡：洗涤平衡：装填完毕后，装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm50cm高的操作压下，用高的操作压下，用300ml300ml的的20mmol/l20mmol/l的的磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（pHpH为为7.07.0）充分洗涤平衡充分洗涤平衡1212小时小时。注意：注意：注意：注意：1 1、液面不要低于凝胶液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。生物大分子物质的分离效果。2 2、不能发生洗脱液流干，不能发生洗脱液流干，露露出凝胶颗粒的现象出凝胶颗粒的现象。（2 2）凝胶色谱柱的装填）凝胶色谱柱的装填50cm50cm50cm50cm高高高高装配好的凝胶柱（3 3）样品加入与洗脱）样品加入与洗脱 调节缓冲液面：调节缓冲液面：调节缓冲液面：调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。下降到与凝胶面平齐，关闭出口。滴加透析样品滴加透析样品滴加透析样品滴加透析样品：吸管吸吸管吸1ml1ml样品加到色谱柱的顶端，样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。不要破坏凝胶面。样品渗入凝胶床：样品渗入凝胶床：样品渗入凝胶床：样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。洗脱：洗脱：洗脱：洗脱：小心加入小心加入pH=7.0 pH=7.0 的的20mmol/l20mmol/l的磷酸缓冲液到的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。收集：收集：收集：收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每收集流出液，每5ml5ml收集一试管，连续收集。收集一试管，连续收集。（在分离过（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）功）。