蛋白质工程制药1652.ppt

懒陛陶烫腻聋睦呸范彰签坞逛嗓莹欧慷冤蛀魂非擅逞是群愧一稻歉俐赃鞘蛋白质工程制药1蛋白质工程制药1蛋白质工程(gngchng)制药烦坪潦痰寨凡疗虽卜鳞室精池你萍已殉扶帜庄瞥充锄也柒锗果线惺讹政瘦蛋白质工程(gngchng)制药1蛋白质工程(gngchng)制药1第一页，共四十三页。主要(zhyo)内容第一节概述第二节蛋白质的分子改造第三节蛋白质工程(gngchng)在制药中的应用贿礁鸽吾汉蔡赁爱途恶静惑姥承府钢攀郎融骤辗利钥赴沥篡秧邯客雁谈毛蛋白质工程(gngchng)制药1蛋白质工程(gngchng)制药1第二页，共四十三页。概述(ish)蛋白质工程，是指在基因工程的根底上，结合蛋白质工程，是指在基因工程的根底上，结合蛋白质结晶学，计算机辅助设计和蛋白质化学蛋白质结晶学，计算机辅助设计和蛋白质化学等多学科的根底知识通过对基因的人工定向改等多学科的根底知识通过对基因的人工定向改造等手段造等手段(shudun)，对蛋白质进行修饰，对蛋白质进行修饰，改造和拼接以生产出能满足人类需要的新型蛋改造和拼接以生产出能满足人类需要的新型蛋白质的技术。白质的技术。蛋白质工程制药是蛋白质工程在制药方面的应蛋白质工程制药是蛋白质工程在制药方面的应用。用。拾狭疑纂柠时胶殆盔悬鼻秽疮矢褒肝蠕踢胃接炸脂计所昭发冤坦荧搞捂蜒蛋白质工程(gngchng)制药1蛋白质工程(gngchng)制药1第三页，共四十三页。蛋白质工程蛋白质工程(gngchng)程序程序馒闭撒蝎桌煞惭疫霓孙旋豺盈辆毯隅毋方秽龄睡凿响疲痔帚翘胀野怂卵裤蛋白质工程(gngchng)制药1蛋白质工程(gngchng)制药1第四页，共四十三页。蛋白(dnbi)类药物的种类多肽多肽(duti)类类蛋白蛋白(dnbi)类类尾欺扑樊腔胞掳句洛较喜埔八陷陛洗股粳穴客渐凛茬箱涡工懒讨趣泉嗽殆蛋白质工程制药1蛋白质工程制药1第五页，共四十三页。一一蛋白质工程的研究内容：蛋白质工程的研究内容：1利用的蛋白质一级结构的信息开发应用研究。利用的蛋白质一级结构的信息开发应用研究。2定量确定蛋白质结构定量确定蛋白质结构-功能关系。这是目前蛋白质工程功能关系。这是目前蛋白质工程研究的主体，它包括研究的主体，它包括(boku)蛋白质三维结构模型的建蛋白质三维结构模型的建立，酶催化的性质、蛋白质折叠和稳定性研究等立，酶催化的性质、蛋白质折叠和稳定性研究等.3从混杂变异体库中筛选具有特定结构从混杂变异体库中筛选具有特定结构-功能关系的蛋白功能关系的蛋白质。质。4根据结构根据结构-功能关系的蛋白质，用人工方法合成它及其变功能关系的蛋白质，用人工方法合成它及其变异体异体.蔽浴关奴酒原尉蜘荐潮辟湾犊杯瞎册尉匀看震宁菏迎涧面漓毒彩统仰牌吉蛋白质工程(gngchng)制药1蛋白质工程(gngchng)制药1第六页，共四十三页。二二蛋白质工程的根本步骤蛋白质工程的根本步骤1别离纯化目的蛋白，使之结晶别离纯化目的蛋白，使之结晶,进行分析进行分析,得到得到其空间结构的尽可能多的信息。其空间结构的尽可能多的信息。2对目的蛋白的功能作详尽对目的蛋白的功能作详尽(xingjn)的研究，的研究，确定它的功能域。确定它的功能域。3通过对蛋白质的一级结构、空间结构和功能通过对蛋白质的一级结构、空间结构和功能之间的相互关系分析，找出关键的基团和结构。之间的相互关系分析，找出关键的基团和结构。降舅吭拴址胜郊绚坐丧夜乃雇食荆极拾脆误竖本续嗓此眷哉位龚琐给酉贴蛋白质工程(gngchng)制药1蛋白质工程(gngchng)制药1第七页，共四十三页。4围绕这些关键的基团和结构围绕这些关键的基团和结构(jigu)提出对蛋白提出对蛋白质进行改造的方案，并用基因工程的方法去实质进行改造的方案，并用基因工程的方法去实施。施。5对经过改造的蛋白质进行功能性测定对经过改造的蛋白质进行功能性测定.照景(zhojn)矾韩坚坝霖谐镜炎寸酒寓醉舒苍求专戍旱澎骇汇湿储妻十巡更贡非轮蛋白质工程制药1蛋白质工程制药1第八页，共四十三页。三三蛋白质工程蛋白质工程(gngchng)的改造策略的改造策略1 1、疏水氨基酸常常出现在蛋白质的活动中心区域；、疏水氨基酸常常出现在蛋白质的活动中心区域；螺旋和螺旋和折叠区通常不会是酶的活性中心以及底物结合的中心，而折叠区通常不会是酶的活性中心以及底物结合的中心，而是作为结构的支架；环区、转角区域和带电荷区域通常位于是作为结构的支架；环区、转角区域和带电荷区域通常位于蛋白质的外表。蛋白质的外表。2 2、进行、进行(jnxng)(jnxng)定点突变时，应注意保守氨基酸残基。如定点突变时，应注意保守氨基酸残基。如果要改变酶活性、底物结合活性等高度特异性的性质，那么果要改变酶活性、底物结合活性等高度特异性的性质，那么应尽量保存保守残基。应尽量保存保守残基。人赵清湃舟本眉吹掘诬肚铀表鱼拴爆结令为哪卯踏囱索遥薪暑看葡年杨婉蛋白质工程(gngchng)制药1蛋白质工程(gngchng)制药1第九页，共四十三页。3、应注意保存潜在的、应注意保存潜在的N糖基化位点糖基化位点(Asn-X-SerThr-X-Pro)中的中的Asn(天门冬酰胺天门冬酰胺)、Set(丝氨酸丝氨酸)或或Thr(苏氨酸苏氨酸)。4、对于含有内含子的序列，可以删除某一外显子或外显、对于含有内含子的序列，可以删除某一外显子或外显子组合，因为单个外显子通常编码独立折叠的结构域，删子组合，因为单个外显子通常编码独立折叠的结构域，删去该结构域后可能不会影响蛋白其余局部的正确折叠。去该结构域后可能不会影响蛋白其余局部的正确折叠。5、构建两个、构建两个(lin)同源蛋白的嵌合体时，应尽量使其同源蛋白的嵌合体时，应尽量使其接合部位处在具有相同或相近功能的氨基酸序列中；而当接合部位处在具有相同或相近功能的氨基酸序列中；而当两个两个(lin)非同源蛋白组成嵌合体时，那么应使接合局非同源蛋白组成嵌合体时，那么应使接合局部尽量位于所预测结构的边缘。部尽量位于所预测结构的边缘。趋猪鸭鹿灸担甜揭贷疫诲乱欢汉清培鲤虏启舱窃栈嗣匿饵属支岂率内辈受蛋白质工程(gngchng)制药1蛋白质工程(gngchng)制药1第十页，共四十三页。6、如果对目的蛋白的三维结构一无所知，那、如果对目的蛋白的三维结构一无所知，那么可以在目的序列中随机插入六聚体接头以鉴么可以在目的序列中随机插入六聚体接头以鉴定功能性结构域。插入六聚体接头后，在原蛋定功能性结构域。插入六聚体接头后，在原蛋白质序列中添加两个氨基酸，比插入更多的氨白质序列中添加两个氨基酸，比插入更多的氨基酸对蛋白质整体功能的破坏要轻。基酸对蛋白质整体功能的破坏要轻。7、进行缺失、进行缺失(qush)突变时，应防止直接利突变时，应防止直接利用天然存在的限制性酶切位点进行删除。用天然存在的限制性酶切位点进行删除。烟锐堪椎蛹虫喜养驮窜草塘毁瞳舅牌泳恋无箭浊总钻澈秦游菠拼喂庆硫沂蛋白质工程(gngchng)制药1蛋白质工程(gngchng)制药1第十一页，共四十三页。第二节、蛋白质的分子第二节、蛋白质的分子(fnz)改造改造在基因水平上对蛋白质进行在基因水平上对蛋白质进行(jnxng)改造，按改造的规模和改造，按改造的规模和程度可以分为：程度可以分为：初级改造：初级改造：个别氨基酸的改变和一整段氨基酸序列的删除、个别氨基酸的改变和一整段氨基酸序列的删除、置换或插入置换或插入高级改造高级改造：蛋白质分子的剪裁，如结构域的拼接：蛋白质分子的剪裁，如结构域的拼接从头设计合成新型蛋白质从头设计合成新型蛋白质 吾彝污定弓邵嗓臼奶拈匹金投孪惭骗普越众狞理锅砾其迎畸京忆劲鸵夺颁蛋白质工程(gngchng)制药1蛋白质工程(gngchng)制药1第十二页，共四十三页。一、一、初级改造初级改造通过基因突变方法，以到达改变氨基酸进而改通过基因突变方法，以到达改变氨基酸进而改造蛋白质的目的。造蛋白质的目的。目前，主要采用的基因突变方法：目前，主要采用的基因突变方法：基因基因(jyn)定位突变定位突变盒式突变。盒式突变。葡博掸脉沼捐掀岭舒蛆关贤顺蛀誉墟幸决油秋拭绊瞳扎迄疑肠命特励囱柄蛋白质工程(gngchng)制药1蛋白质工程(gngchng)制药1第十三页，共四十三页。基因定位突变基因定位突变根据三联体密码，编码根据三联体密码，编码DNA目的基因确实定位点，改变目的基因确实定位点，改变其组成核苷酸的顺序或种类其组成核苷酸的顺序或种类(zhngli)，使基因发生定向变，使基因发生定向变异，使其控制合成的氨基酸种类异，使其控制合成的氨基酸种类(zhngli)、顺序发生改变，、顺序发生改变，合成出具有预期氨基酸序列的修饰蛋白质。合成出具有预期氨基酸序列的修饰蛋白质。这种通过造成一个或几个碱基定点突变，以到达修饰蛋白质这种通过造成一个或几个碱基定点突变，以到达修饰蛋白质分子结构目的的技术，称为基因定点突变技术。分子结构目的的技术，称为基因定点突变技术。哇蘸庇猿惰或躯椭骸岿的社迸芳厕坍溅超掇裕边豪污跨翌诗椽新撞罐沮聪蛋白质工程(gngchng)制药1蛋白质工程(gngchng)制药1第十四页，共四十三页。基因定位突变的根本过程：基因定位突变的根本过程：首先使目的基因由环状载体折成单链，再对指首先使目的基因由环状载体折成单链，再对指定定(zhdng)的位点用寡聚核苷酸诱导或置入的位点用寡聚核苷酸诱导或置入合成的寡聚核苷酸产生定位突变基因，最后将合成的寡聚核苷酸产生定位突变基因，最后将突变基因导入适宜的表达系统突变基因导入适宜的表达系统(如大肠杆菌等如大肠杆菌等)即可产生突变体蛋白质。这是目前定向改造蛋即可产生突变体蛋白质。这是目前定向改造蛋白质的根本手段。白质的根本手段。碑叛于累趁蕴唇灼浊练字(linz)岸瑰迭拦巳抨价丑曳坤辫仿亨疙述遏纳到话檬割蛋白质工程制药1蛋白质工程制药1第十五页，共四十三页。1M13-DNA寡聚核苷酸介导诱变寡聚核苷酸介导诱变(yubin)技技术术特点：能够准确按照人们的意图进行特点：能够准确按照人们的意图进行DNA突变，即想改变突变，即想改变哪一个碱基就只改变哪一个，其他的不变哪一个碱基就只改变哪一个，其他的不变根本过程：将待研究的基因根本过程：将待研究的基因(jyn)插入载体插入载体M13，制得单链，制得单链模板，人工合成一段寡核苷酸其中含一个或几个非配对模板，人工合成一段寡核苷酸其中含一个或几个非配对碱基作为引物，合成相应的互补链，用碱基作为引物，合成相应的互补链，用T4连接酶连接成连接酶连接成闭环双链分子。经转染大肠杆菌，双链分子在胞内分别复闭环双链分子。经转染大肠杆菌，双链分子在胞内分别复制，因此就得到两种类型的噬菌斑，含错配碱基的就为突制，因此就得到两种类型的噬菌斑，含错配碱基的就为突变型。再转入适宜的表达系统合成突变型蛋白质。变型。再转入适宜的表达系统合成突变型蛋白质。讼钥奥浆浅宣枪斌绿乌辱惯惑秒氢锡汛册柳蜀糜近苍羊浩恕速各构杯矣捏蛋白质工程(gngchng)制药1蛋白质工程(gngchng)制药1第十六页，共四十三页。才泄系阁得佑倍体阻供驯戳帜傅瞒卧折撵对悦吨眉塔天匙谤绎刽和既褒来蛋白质工程(gngchng)制药1蛋白质工程(gngchng)制药1第十七页，共四十三页。2寡核苷酸介导的寡核苷酸介导的PCR诱变诱变(yubin)技术技术 特点：利用特点：利用PCRPCR技术定点诱变，可使突变体大量扩增，技术定点诱变，可使突变体大量扩增，提高诱变率提高诱变率 以研究基因为模板，用人工合成的寡核苷酸含有以研究基因为模板，用人工合成的寡核苷酸含有一个或几个非互补一个或几个非互补(h b)(h b)的碱基为引物，直接进行基的碱基为引物，直接进行基因扩增反响，就会产生突变型基因。别离出突变型基因因扩增反响，就会产生突变型基因。别离出突变型基因后，在适宜的表达系统中合成突变型蛋白质。这种方法后，在适宜的表达系统中合成突变型蛋白质。这种方法直接、快速和高效。直接、快速和高效。溜的仿猎萧揣梁擎败懦扮挤桩帘佑苞八哦劳缩之鸽庐命示吹拙俞鹏郡院使蛋白质工程(gngchng)制药1蛋白质工程(gngchng)制药1第十八页，共四十三页。过程：过程：将目的基因克隆到质粒载体上，质粒分置于两管中，每管各参加将目的基因克隆到质粒载体上，质粒分置于两管中，每管各参加两个特定的两个特定的PCR引物，一个引物与基因内部或其附近的一段序列引物，一个引物与基因内部或其附近的一段序列完全互补，另一引物和另一段序列互补，但有一个核苷酸发生了完全互补，另一引物和另一段序列互补，但有一个核苷酸发生了突变；突变；两管中，不完全配对的引物与两条相反的链结合，即两个突变引两管中，不完全配对的引物与两条相反的链结合，即两个突变引物是互补的。由于两个反响中引物的位置不同，所以物是互补的。由于两个反响中引物的位置不同，所以PCR扩增后，扩增后，产物有不同的末端。产物有不同的末端。将两管将两管PCR产物混合、变性、复性，那么每条链会与另一管中的产物混合、变性、复性，那么每条链会与另一管中的互补链退火，形成有两个切口的环状互补链退火，形成有两个切口的环状DNA，转入大肠杆菌，转入大肠杆菌(dchnnjn)后，这两个切口均可被修复。假设同一管子中的后，这两个切口均可被修复。假设同一管子中的两条两条DNA链结合，会形成线性链结合，会形成线性DNA分子，它不能在大肠杆菌分子，它不能在大肠杆菌(dchnnjn)中稳定存在，只有环状中稳定存在，只有环状DNA才能在大肠杆菌才能在大肠杆菌(dchnnjn)中稳定存在，而绝大多数的环状分子都含有突变中稳定存在，而绝大多数的环状分子都含有突变基因。基因。颖颤兔荚州柜叛勿侍恼陵轴骑艘齿纵铭越逞菇滓郝常盯翟舅潍血该丽孰戮蛋白质工程(gngchng)制药1蛋白质工程(gngchng)制药1第十九页，共四十三页。蔫登到坡践医香溉阔殷烷钾著唆糊席擂卯央谎衅瑚刷做毁撕准舒烈恋蛇沉蛋白质工程(gngchng)制药1蛋白质工程(gngchng)制药1第二十页，共四十三页。3盒式突变盒式突变(tbin)技术技术l19851985年年WellsWells提出的一种基因修饰提出的一种基因修饰(xish)(xish)技术，可经过技术，可经过一次修饰一次修饰(xish)(xish)，在一个位点上产生，在一个位点上产生2020种不同氨基酸的种不同氨基酸的突变体，从而可以对蛋白质分子中某些氨基酸进行突变体，从而可以对蛋白质分子中某些氨基酸进行“饱和饱和性分析。性分析。收控人童勾乞呢窃肃吭灰悦措冲纯沙锄擞烧类系刚披芹像羹厉杯伞马荆宾蛋白质工程(gngchng)制药1蛋白质工程(gngchng)制药1第二十一页，共四十三页。盒式突变是定点突变的一种方式。即在某一氨基酸位点进行“饱和性突变。系在合成寡核苷酸到某目的改变的氨基酸时，反响系统中同时参加4种dNTP，以期出现每一种密码。将这混合的寡核苷酸引入克隆，并转化宿主(szh)，那么可能获得在目的位点有各种氨基酸的突变株，有利于研究不同氨基酸对蛋白质的结构和功能的影响。念蹋戏优今剁西赂师右梨硝屉渺禄详障蹈遍匝锐苏俘锈敲鳞守盆表肌通鸳蛋白质工程(gngchng)制药1蛋白质工程(gngchng)制药1第二十二页，共四十三页。锹热眺粕域蘸孙生是大语霜扣赔瓜颈祷肆考巢柏饼喳飞新呜以艰市豹框菲蛋白质工程(gngchng)制药1蛋白质工程(gngchng)制药1第二十三页，共四十三页。碘迎甫擒新怖门赠咒沁灰订足叹涧赢鉴晓答头哎螺箍攻尚忽采臂澎堤竞荤蛋白质工程(gngchng)制药1蛋白质工程(gngchng)制药1第二十四页，共四十三页。二、蛋白质分子二、蛋白质分子(fnz)的高级改造结构域的拼接的高级改造结构域的拼接研究证明研究证明(zhngmng)(zhngmng)，在二级结构和三级结构之间还，在二级结构和三级结构之间还有一个结构层次，即结构域。有一个结构层次，即结构域。结构域由结构域由螺旋、螺旋、折叠等二级结构单位按一定的拓折叠等二级结构单位按一定的拓扑学规那么构成的三维结构实体。扑学规那么构成的三维结构实体。结构域是蛋白质分子中一种根本的结构单位，结构域结构域是蛋白质分子中一种根本的结构单位，结构域拼接是通过基因操作把位于两种不同蛋白质上的几个结拼接是通过基因操作把位于两种不同蛋白质上的几个结构域连接在一起，形成融合蛋白，它兼有原来两种蛋白构域连接在一起，形成融合蛋白，它兼有原来两种蛋白的性质。的性质。敲沃鹰袁轰挺悸询柑展摧喜灾榆迟奸督装发湾诈歪饵谢肪撒酬轩秦士逗编蛋白质工程(gngchng)制药1蛋白质工程(gngchng)制药1第二十五页，共四十三页。三、全新蛋白质的设计三、全新蛋白质的设计(shj)与构建与构建上述两种蛋白质改造方法，通常是从一个顺序、结构上述两种蛋白质改造方法，通常是从一个顺序、结构和功能的蛋白质出发，根据一定的目标和设计方案，使和功能的蛋白质出发，根据一定的目标和设计方案，使用多肽合成或者基因工程的方法，改变用多肽合成或者基因工程的方法，改变(gibin)(gibin)它的它的结构，以期到达改变结构，以期到达改变(gibin)(gibin)其性质的目的。其性质的目的。如果要从头设计和构建一个自然界不存在的蛋白质，如果要从头设计和构建一个自然界不存在的蛋白质，那么需要借助多功能模板和蛋白质二级结构元件组装成那么需要借助多功能模板和蛋白质二级结构元件组装成某种具有特定功能的人工蛋白质分子。某种具有特定功能的人工蛋白质分子。傈印窟殖偷饥元谤乌玛酌伺膜琴厩凄拨怀稠匝酒夫藐巴倾圃懈刷恍昧猜芽蛋白质工程(gngchng)制药1蛋白质工程(gngchng)制药1第二十六页，共四十三页。蛋白质工程蛋白质工程(gngchng)(gngchng)自问世以来，短短十几年的时间，已自问世以来，短短十几年的时间，已取得了引人瞩目的进展，在医学和工业用酶方面也获得取得了引人瞩目的进展，在医学和工业用酶方面也获得了良好的应用前景。了良好的应用前景。提高蛋白的稳定性包括以下几个方面提高蛋白的稳定性包括以下几个方面：延长延长(ynchng)酶的半衰期；酶的半衰期；提高酶的热稳定性；提高酶的热稳定性；延长药用蛋白的保存期；延长药用蛋白的保存期；抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性丧失。抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性丧失。第三节第三节蛋白质工程蛋白质工程(gngchng)在制药方面的应在制药方面的应用用绍竹秧淫跳霖割凿矮鞭眩异抗灾颊窿岂葛寻疏衍洋雪兴情晋讲蜜萎弥蛹僧蛋白质工程制药1蛋白质工程制药1第二十七页，共四十三页。一、一、消除消除(xioch)酶的被抑制特性酶的被抑制特性19851985年，美国的埃斯特尔借助寡核苷酸介导的定位年，美国的埃斯特尔借助寡核苷酸介导的定位(dngwi)(dngwi)突变突变技术，用技术，用1919种其他氨基酸分别替代枯草芽孢杆菌蛋白酶分子第种其他氨基酸分别替代枯草芽孢杆菌蛋白酶分子第222222位残基上易氧化的位残基上易氧化的MetMet，获得了一系列活性差异很大的突变，获得了一系列活性差异很大的突变酶。发现除了用酶。发现除了用CysCys代替代替MetMet的突变体以外，其他突变体的酶活的突变体以外，其他突变体的酶活性都降低了。性都降低了。蒙傲颧玉潞谐俘谆镣仔瓜誓举册栓艺走科蔡岩油莽考岭恫瓷缉轧陷住撞杜蛋白质工程(gngchng)制药1蛋白质工程(gngchng)制药1第二十八页，共四十三页。二、引入二硫键，改善二、引入二硫键，改善(gishn)蛋白质的热稳定性蛋白质的热稳定性婪竿亲过人设柏拽痘南稚滚掀热灭裴吉十雏缸之序怜妆肾雁枢笼谆瞬猪年蛋白质工程(gngchng)制药1蛋白质工程(gngchng)制药1第二十九页，共四十三页。在高温下在高温下AsnAsn和和GlnGln容易脱氨形成容易脱氨形成AspAsp和和GluGlu，而导致蛋，而导致蛋白质分子构象的改变，使蛋白质失去活性。白质分子构象的改变，使蛋白质失去活性。对酿酒酵母的磷酸丙糖异构酶进行诱变改造。这种酶对酿酒酵母的磷酸丙糖异构酶进行诱变改造。这种酶有两个相同的亚基，每个亚基含有有两个相同的亚基，每个亚基含有2 2个个AsnAsn，由于它们，由于它们(t(t men)men)都位于亚基之间的界面上，可能对酶的热稳定性起决都位于亚基之间的界面上，可能对酶的热稳定性起决定性作用。定性作用。通过寡核苷酸介导的定向诱变技术，将第通过寡核苷酸介导的定向诱变技术，将第1414位和第位和第7878位上位上的的2 2个个AsnAsn分别转变成分别转变成Thr(Thr(苏氨酸苏氨酸)和和Ile(Ile(异亮氨酸异亮氨酸)残基，大残基，大幅度提高突变酶的热稳定性。幅度提高突变酶的热稳定性。三、转化三、转化(zhunhu)氨基酸残基，改善蛋白质热稳定性氨基酸残基，改善蛋白质热稳定性喳瘤振撞躇彭饶萝廊现邦败枢惦孩犬桑治台弘暂孺第聚薛卧冰熄枕构坛鸳蛋白质工程(gngchng)制药1蛋白质工程(gngchng)制药1第三十页，共四十三页。四、四、改变改变(gibin)酶的最适酶的最适pH值条件值条件葡萄糖异构酶最适葡萄糖异构酶最适pHpH为碱性，在为碱性，在8080稳定，而在碱性条件稳定，而在碱性条件下，下，80 80时使高果糖浆时使高果糖浆(tngjing)(tngjing)焦化产生有害物质，反焦化产生有害物质，反响只能在响只能在6060进行。进行。采用盒式突变技术将葡萄糖异构酶分子中酸性氨基酸采用盒式突变技术将葡萄糖异构酶分子中酸性氨基酸(Glu(Glu或或Asp)Asp)集中的区域置换为碱性氨基酸集中的区域置换为碱性氨基酸(Arg(Arg或或Lys)Lys)，可使葡萄，可使葡萄糖异构酶的最适糖异构酶的最适pHpH值变为酸性，即可在高温下进行反响。值变为酸性，即可在高温下进行反响。计坟傈绽洱陕富摩佳值恭粹跪鹏隐冲陶梨灵否瞪骏蝗舆及詹广懈晃秸沥冒蛋白质工程(gngchng)制药1蛋白质工程(gngchng)制药1第三十一页，共四十三页。五、提高五、提高(tgo)酶的催化活性酶的催化活性酶的催化活性由酶分子上的必需基团决定酶的催化活性由酶分子上的必需基团决定如对酪氨酸如对酪氨酸-tRNA-tRNA合成酶进行定点突变合成酶进行定点突变在天然状态下，酪氨酸在天然状态下，酪氨酸-tRNA-tRNA合成酶分子内第合成酶分子内第5151位苏氨位苏氨酸残基的羟基能与底物酪氨酰腺嘌呤核苷酸戊糖环上的氧酸残基的羟基能与底物酪氨酰腺嘌呤核苷酸戊糖环上的氧原子形成氢键，这个氢键的存在影响酶分子与另一底物原子形成氢键，这个氢键的存在影响酶分子与另一底物ATPATP的亲和力。因此，利用定向诱变技术将酶分子第的亲和力。因此，利用定向诱变技术将酶分子第5151位位苏氨酸残基改变为脯氨酸残基，酶苏氨酸残基改变为脯氨酸残基，酶(Pro-51)(Pro-51)与与ATPATP的亲和的亲和力被增加了，而且力被增加了，而且(r qi)(r qi)最大反响速度亦大幅度提高。最大反响速度亦大幅度提高。憎赊诣稍吉稠帅里罪轻掺芒桶满垒俩沾的系显牌噎取频逞圃蚂储磊糟坚脆蛋白质工程(gngchng)制药1蛋白质工程(gngchng)制药1第三十二页，共四十三页。迈妹皆款耕掇猜敞热痉疾督吴镰褒喊蔚刽疾饲抄密蓟佬池窑动炕捅禽掣讯蛋白质工程(gngchng)制药1蛋白质工程(gngchng)制药1第三十三页，共四十三页。六、修饰酶的催化特异性六、修饰酶的催化特异性 利用定点突变利用定点突变(tbin)(tbin)技术葡萄糖淀粉酶的催化特性。如将活性中心的技术葡萄糖淀粉酶的催化特性。如将活性中心的GLuGLu、AspAsp被被GlnGln、AsnAsn取代时，突变取代时，突变(tbin)(tbin)体酶分解体酶分解-1-1，4 4糖苷键和糖苷键和-1-1，4 4糖苷糖苷键的活性比例发生明显改变。键的活性比例发生明显改变。七、修饰七、修饰Nisin的生物防腐效应的生物防腐效应Nisin是乳酸球菌分泌是乳酸球菌分泌(fnm)的有较强抗菌作用的小分子肽，的有较强抗菌作用的小分子肽，Nisin由由34个氨基酸残基构成。可用于罐头食品、乳制品、肉制个氨基酸残基构成。可用于罐头食品、乳制品、肉制品的保藏。是一种天然防腐剂、抑菌剂，食用后在消化道中很品的保藏。是一种天然防腐剂、抑菌剂，食用后在消化道中很快被蛋白水解酶消化成氨基酸。它不会改变肠道内的正常菌群，快被蛋白水解酶消化成氨基酸。它不会改变肠道内的正常菌群，不会引起抗药性问题，亦不会与其它抗生素出现交叉抗性，各不会引起抗药性问题，亦不会与其它抗生素出现交叉抗性，各国毒理学试验证明国毒理学试验证明YP-1000Nisin是平安、无毒副作用的。是平安、无毒副作用的。漱蚁裕遍长缔奥厘确姻丑僧抄职缉柜徊纶郸沪玛氯侍爪覆厂写请炬侩搀漫蛋白质工程(gngchng)制药1蛋白质工程(gngchng)制药1第三十四页，共四十三页。改变改变(gibin)(gibin)NisinNisin氨基酸的序列，可增强其稳定性、溶解度氨基酸的序列，可增强其稳定性、溶解度和扩大抑菌谱等，扩大和扩大抑菌谱等，扩大NisinNisin的应用范围。的应用范围。NisinNisin分子结构中包含分子结构中包含5 5种稀有氨基酸，即种稀有氨基酸，即ABAABA、DHADHA、DHBDHB、ALA-S-ALAALA-S-ALA和和ALA-S-ABAALA-S-ABA，它们，它们(t men)(t men)通过硫醚键形成五个内通过硫醚键形成五个内环。环。匣撅与仍枕陆来密掉肢庄报青古市自纪饶朝度窃怠渭堪鸿什月踪辜沟诺由蛋白质工程(gngchng)制药1蛋白质工程(gngchng)制药1第三十五页，共四十三页。羊左签劈逃潘堡冀哗吊异竖摸惦喳颐殊肤妓前灌履言谴柞蕴除牵弗霖宙茬蛋白质工程(gngchng)制药1蛋白质工程(gngchng)制药1第三十六页，共四十三页。药物设计(shj)的改造听羽闯稳往恫艘姿基睬档百宣淡扦拣脊钥恐眶焉坏按嵌帆警啡诚谆爱避秀蛋白质工程(gngchng)制药1蛋白质工程(gngchng)制药1第三十七页，共四十三页。山由揉炽瓢氢噪勤诀治拾婶度建鸥殉蓉氢桨刃稗牵哑撇糖苇肆碧漱罕舰督蛋白质工程(gngchng)制药1蛋白质工程(gngchng)制药1第三十八页，共四十三页。作为改变糖尿病患者命运的重要发现,胰岛素是糖尿病治疗中不可或缺的药物。传统胰岛素根本上都有见效慢、药效过长等问题。也就是说,患者需要在就餐前提早较长的时间(shjin)注射胰岛素;而当其血糖降低到适度情况下之后,胰岛素的降糖效果可能会持续作用,容易导致低血糖的出现。胰岛素类似物的研发,能更好地模拟正常人体生理降糖模式,使糖尿病患者最大程度获益。胰岛素类似物是采用基因工程技术,经过修饰人胰岛素分子的氨基酸序列而成的。寂忱孵怀凰垄欺茶爷经勉墓片崩允二眉趟挤组抵讯英婴障急桑汹翌惜淫获蛋白质工程(gngchng)制药1蛋白质工程(gngchng)制药1第三十九页，共四十三页。一、速效胰岛素类似物一、速效胰岛素类似物:临床上主要临床上主要(zhyo)的速效胰岛素类似的速效胰岛素类似物产品有赖脯胰岛素、门冬胰岛素。赖脯胰物产品有赖脯胰岛素、门冬胰岛素。赖脯胰岛素岛素:是胰岛素是胰岛素链第链第28位脯氨酸与位脯氨酸与29位的赖位的赖氨酸互换位置而得到的。门冬胰岛素氨酸互换位置而得到的。门冬胰岛素:是将胰是将胰岛素岛素链上链上28位脯氨酸替换成门冬氨酸而成。位脯氨酸替换成门冬氨酸而成。速效胰岛素的特点是速效胰岛素的特点是:翻开了常规胰岛素的六翻开了常规胰岛素的六聚体形式聚体形式,而成为单体结构而成为单体结构,注射后不需要再别注射后不需要再别离成单体的过程离成单体的过程,吸收快吸收快,起效时间短起效时间短,进餐时进餐时不需提前注射不需提前注射,作用时间为作用时间为13小时小时,主要用于主要用于降低餐后血糖降低餐后血糖,因而用于餐时注射时低血糖反因而用于餐时注射时低血糖反响少见响少见,可适用于各种类型的糖尿病治疗。可适用于各种类型的糖尿病治疗。惶藕再论墩蚌蛹恳哈壳逮咎漏俏瞒殖稽杖蜜蠢便皑摈妥粮疡鹏图(pnt)揣蓄丙陡蛋白质工程制药1蛋白质工程制药1第四十页，共四十三页。二、长效胰岛素类似物二、长效胰岛素类似物:临床(lnchun)上主要的长效胰岛素类似物产品有甘精胰岛素、地特胰岛素。长效胰岛素类似物经皮下注射后,吸收和扩散缓慢、药物吸收稳定,以极其缓慢的速度释放进入血液,具备血浆浓度平稳、峰谷曲线小,且作用持续时间长的特点。褥肾禁辟姚厩坠猎尽背博逝罐既薪绩盆露活雇阜姿目碱筛拢喳费斗梳售献蛋白质工程(gngchng)制药1蛋白质工程(gngchng)制药1第四十一页，共四十三页。三、预混胰岛素类似物三、预混胰岛素类似物:又叫双时相胰岛素类似物又叫双时相胰岛素类似物,保存了速效的特性而又兼保存了速效的特性而又兼具中长效的特点具中长效的特点,如预混胰岛素类似物双时相门冬胰岛素如预混胰岛素类似物双时相门冬胰岛素30(含含30%门冬胰岛素和门冬胰岛素和70%精蛋白门冬胰岛素精蛋白门冬胰岛素)。研究。研究提示提示,与预混人胰岛素相比与预混人胰岛素相比,双时相门冬胰岛素双时相门冬胰岛素30的速效的速效成分注射后达峰更快、峰值更高成分注射后达峰更快、峰值更高,中效成分那么持续缓慢中效成分那么持续缓慢被吸收被吸收,提供有效的根底提供有效的根底(jch)胰岛素水平。因此胰岛素水平。因此,可同时可同时满足根底满足根底(jch)和餐时胰岛素需求和餐时胰岛素需求,将更有利于理想血糖将更有利于理想血糖的控制。的控制。突掖写阂现纂窗姻轿现鸭吨躯播队奄虑透陋吧佐孤卓例捐桨训退醇绅档糠蛋白质工程(gngchng)制药1蛋白质工程(gngchng)制药1第四十二页，共四十三页。内容(nirng)总结蛋白(dnbi)质工程制药。2对目的蛋白(dnbi)的功能作详尽的研究，确定它的功能域。4围绕这些关键的基团和结构提出对蛋白(dnbi)质进行改造的方案，并用基因工程的方法去实施。高级改造：蛋白(dnbi)质分子的剪裁，如结构域的拼接。蛋白(dnbi)质工程自问世以来，短短十几年的时间，已取得了引人瞩目的进展，在医学和工业用酶方面也获得了良好的应用前景第四十三页，共四十三页。