X3-1-1__DNA重组技术的基本工具.pptx

1专题专题1 1 基因工程基因工程1.1 DNA1.1 DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具基础理论和技术发展催生了基因工程基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路科技探索之路1)基因转移载体的发现基因转移载体的发现2)工具酶的发现工具酶的发现3)DNA合成和测序技术的发明合成和测序技术的发明4)DNA体外重组的实现体外重组的实现5)重组重组DNA表达实验的成功表达实验的成功6)第一例转基因动物问世第一例转基因动物问世7)PCR技术的发明技术的发明角似鹿角似鹿鼻似狮鼻似狮目似虎目似虎唇似牛唇似牛爪似鹰爪似鹰髭似马髭似马鳞似鱼鳞似鱼身似蛇身似蛇设想一设想一 能否培养出具有抗虫能否培养出具有抗虫性状的抗虫棉呢？性状的抗虫棉呢？蓝色玫瑰蓝色玫瑰能生产胰岛素的大肠杆菌能生产胰岛素的大肠杆菌 转基因鼠转基因鼠能发荧光的转基因猪能发荧光的转基因猪9是指是指按照人们的意愿按照人们的意愿，进行严格的设计，通过，进行严格的设计，通过体外体外DNADNA重组和转基因重组和转基因等技术，赋予生物以等技术，赋予生物以新的遗传特新的遗传特性性，创造出更符合人们需要的，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物新的生物类型和生物产品产品。由于基因工程是在由于基因工程是在DNADNA分子水平分子水平上进行设计和上进行设计和施工的，又叫施工的，又叫DNADNA重组技术或基因拼接技术。重组技术或基因拼接技术。生长激素、胰岛素生长激素、胰岛素10基因拼接技术或基因拼接技术或DNADNA重组技术重组技术生物体外生物体外基因基因DNADNA分子水平分子水平人类需要的新的生物类型和生人类需要的新的生物类型和生物产品（或基因产物）物产品（或基因产物）剪切剪切 拼接拼接 导入导入 表达表达实实 质（原理）质（原理）基因重组基因重组对基因工程概念的理解对基因工程概念的理解 一种定向改造生物的新技术一种定向改造生物的新技术第第1 1节节121.1 DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具13基因工程培育抗虫棉的简要过程：基因工程培育抗虫棉的简要过程：普通棉花普通棉花(无抗虫特性无抗虫特性)苏云金芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌提取提取提取提取抗虫基因抗虫基因与载体与载体与载体与载体DNADNA拼接拼接拼接拼接导入导入导入导入棉花细胞棉花细胞(含含抗虫基因抗虫基因)棉花植株棉花植株(有有抗虫特性抗虫特性)14关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆 菌细胞内提取。菌细胞内提取。关键步骤二：抗虫基因与载体关键步骤二：抗虫基因与载体DNA连接。连接。关键步骤三：抗虫基因进入棉细胞。关键步骤三：抗虫基因进入棉细胞。基因的分子手术刀基因的分子手术刀限制性内切酶。限制性内切酶。基因的分子缝合针基因的分子缝合针DNADNA连接酶。连接酶。基因的分子运输车基因的分子运输车载体。载体。抗虫棉培育抗虫棉培育阅读课本阅读课本4-5页页“限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶分子手术刀分子手术刀”的相关内容，填写下表的相关内容，填写下表自主学习一自主学习一主要主要从原核生物中分离纯化而来从原核生物中分离纯化而来已经分离出大约已经分离出大约4000种种1、识别双链、识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序分子的某种特定核苷酸序列列2、使每一条链中使每一条链中特定部位特定部位的两个核的两个核苷酸之间的苷酸之间的磷酸二酯键磷酸二酯键断开。断开。形成两种末端：黏性末端或形成两种末端：黏性末端或形成两种末端：黏性末端或形成两种末端：黏性末端或平末端平末端平末端平末端12345脱氧核苷酸的结构脱氧核苷酸的结构 G1234512345 A3,5-磷磷酸二酯酸二酯键键3端5端3端5端磷酸二酯键磷酸二酯键18仔细观察各限制酶仔细观察各限制酶 识别的特定序列有识别的特定序列有何特点？何特点？限制酶的识别序列限制酶的识别序列限制酶所识别的序列的特限制酶所识别的序列的特点是：点是：找到一条中心轴线，找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链中轴线两侧的双链DNA上上的碱基是的碱基是反向对称重复反向对称重复排排列的列的，称为，称为回文序列回文序列中轴线在G与A之间切割大肠杆菌的一种限制酶(EcoR)只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。EcoRIEcoRI限制酶的作用限制酶的作用黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端EcoRIEcoRI限制酶的切割限制酶的切割 被限制酶切开的被限制酶切开的DNA两条两条单链的切口，带有几个单链的切口，带有几个伸出的伸出的核苷酸核苷酸，他们之间正好互补配他们之间正好互补配对，这样的切口叫对，这样的切口叫黏性末端黏性末端。错位切错位切SmaISmaI只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。中轴线SmaISmaI限制酶的作用限制酶的作用在G与C之间切割平末端平末端平末端平末端平末端平末端平末端平末端SmaISmaI限制酶的切割限制酶的切割当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNADNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端平末端。限制酶作用特点1、限制酶识别特定的核苷酸序列、限制酶识别特定的核苷酸序列回文序列回文序列回文序列：回文序列：在切割部位，一条链在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺另一条链反向读的顺序完全一致。序完全一致。2、限制酶断开磷酸二酯键、限制酶断开磷酸二酯键你能推测限制酶存在于原核生物中的你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？作用是什么吗？原核生物原核生物（主要是细菌）易受自然界（主要是细菌）易受自然界外源外源DNADNA（噬菌（噬菌体体DNADNA）的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了）的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNADNA侵入侵入时，会利用限制酶将外源时，会利用限制酶将外源DNADNA切割掉，以保证自身的切割掉，以保证自身的安全。安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源切割外源DNADNA、使之失效使之失效，从而达到，从而达到保护自身保护自身的目的。的目的。寻根问底寻根问底寻根问底寻根问底为什么限制酶不剪切细菌本身的为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其的细胞，其DNADNA分子中分子中不具备这种限制酶不具备这种限制酶的识别切割序列的识别切割序列，或者，或者通过甲基化酶将甲通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的种限制酶也不会使自身的DNADNA被切断，并被切断，并且可以防止外源且可以防止外源DNADNA的入侵。的入侵。261、要想获得某个特定性状的基因必须要用限制、要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？酶切几个切口？可产生几个黏性末端？要切两个切口，产生四个黏性末端。要切两个切口，产生四个黏性末端。3、如果把两种来源不同的、如果把两种来源不同的DNA用同一种限制用同一种限制酶来切割，会怎样呢？酶来切割，会怎样呢？会产生会产生相同的黏性末端相同的黏性末端，然后让两者的，然后让两者的黏性末端黏性末端黏合黏合起来，就似乎可以合成重组的起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。分子了。2、要把目的基因插入运载体的前提是什么要把目的基因插入运载体的前提是什么必须用同一种限制酶来切割目的基因和运载体。必须用同一种限制酶来切割目的基因和运载体。思考思考?27类型来源功能相同点差别EcoliDNA连接酶T4DNA连接酶大肠杆菌T4噬菌体催化形成磷酸二酯键只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端(效率较低)阅读课本第阅读课本第5页页“分子缝合针分子缝合针DNADNA连接酶连接酶”的相关内容，填写下表的相关内容，填写下表自主学习二自主学习二28基因工程的连接酶基因工程的连接酶“DNADNA连接酶连接酶”将两段将两段DNADNA片段连接片段连接1分类：根据酶的来源不同，可分为分类：根据酶的来源不同，可分为EcoliDNA连连 接酶和接酶和T4DNA连接酶两类连接酶两类2功能：恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的功能：恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的 磷酸二酯键磷酸二酯键。两种两种DNA连接酶连接酶(EcoliDNA连接酶和连接酶和T4DNA连接酶连接酶)的比较：的比较：相同点：都缝合相同点：都缝合磷酸二酯键磷酸二酯键区别：区别：EcoIiDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能连接酶来源于大肠杆菌，只能 使使黏性末端黏性末端之间连接；之间连接；T4DNA连接酶能缝合连接酶能缝合两种末端两种末端，但连接平末，但连接平末 端之间的效率较端之间的效率较低低。把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接起来催化形成磷酸二酯键DNADNA连接酶的作用连接酶的作用两两DNADNA片段要具有片段要具有互补互补的黏性末端的黏性末端才能拼起来才能拼起来DNADNA连接酶的缝合作用连接酶的缝合作用可把黏性末端之间的可把黏性末端之间的缝隙缝隙“缝合缝合”起来起来，注意：注意：DNADNA连接酶可连接双链连接酶可连接双链DNADNA中的中的DNADNA单链缺口，单链缺口，但不能连接单链但不能连接单链DNADNA！DNADNA连接酶与连接酶与DNADNA聚合酶是一回事吗？聚合酶是一回事吗？T T4 4 DNA DNA连接酶连接酶还可把还可把平末端之间的缝隙平末端之间的缝隙“缝合缝合”起来，起来，但效率较低但效率较低DNADNA连接酶的缝合作用连接酶的缝合作用A A T T GA A T T GC CA AA AT TT TA AA AT TT TDNA聚合聚合酶酶DNA聚合聚合酶酶DNA聚合聚合酶酶DNA聚合聚合酶酶DNA聚合聚合酶酶DNA聚合酶的作用聚合酶的作用都能催化形成都能催化形成磷酸二酯键磷酸二酯键都是蛋白质都是蛋白质不需要不需要需要需要形成完整的重形成完整的重组组DNA分子分子形成形成DNA的一条的一条链链基因工程基因工程DNA复制复制DNA连接酶与连接酶与DNA聚合酶的比较聚合酶的比较只能将只能将单个核苷单个核苷酸酸连接到已有的连接到已有的DNADNA片段上，形片段上，形成磷酸二酯键成磷酸二酯键在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键34DNA连接酶的种类连接酶的种类35362个个4个个1 1、每每连接两个相同的黏性未端要接两个相同的黏性未端要连接几个磷酸接几个磷酸二二酯键？2 2、用限制用限制酶酶切一个特定基因要切断几个磷酸二切一个特定基因要切断几个磷酸二酯键？思考：思考：2.为什么限制酶和为什么限制酶和DNA连接酶在微生物中能够分离连接酶在微生物中能够分离到到,而高等植物和动物中没有而高等植物和动物中没有?原核生物容易受到自然界外源原核生物容易受到自然界外源DNA的的入侵，但是生物在长期的进化过程中形成入侵，但是生物在长期的进化过程中形成了完善的防御机制，以防止外来病原物的了完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。侵害。限制性核酸内切酶就是细菌的防御性工限制性核酸内切酶就是细菌的防御性工具，当外源具，当外源DNA侵入时，限制性核酸内切侵入时，限制性核酸内切酶会将外源酶会将外源DNA切割掉，以保证自身的安切割掉，以保证自身的安全。全。所以，限制性核酸内切酶在原核生物中所以，限制性核酸内切酶在原核生物中主要起到切割外源主要起到切割外源DNA、使之失效，从而、使之失效，从而保护自身的作用。保护自身的作用。载体的作用载体的作用载体的必载体的必要条件要条件载体的种类载体的种类阅读课本第阅读课本第6页页“分子运输车分子运输车运载体运载体”的相关的相关内容，填写下表内容，填写下表自主学习三自主学习三1 1）能够能够在在在在宿主细胞中宿主细胞中复制复制并稳定地并稳定地并稳定地并稳定地保存保存。2 2）具多个）具多个）具多个）具多个限制酶切点限制酶切点，以，以，以，以便与外源基因连接便与外源基因连接。3 3）具有某些）具有某些）具有某些）具有某些标记基因标记基因，便于进行，便于进行，便于进行，便于进行鉴定鉴定和和和和选择选择。4 4）必须是）必须是）必须是）必须是安全安全的的的的 ，对受体细胞，对受体细胞，对受体细胞，对受体细胞无害无害。5 5）载体）载体）载体）载体DNA DNA 分子应分子应分子应分子应大小适中大小适中，以便于，以便于，以便于，以便于提取提取和和和和操作操作1 1）作为）作为）作为）作为运载工具运载工具，将目的基因导入受体细胞中，将目的基因导入受体细胞中，将目的基因导入受体细胞中，将目的基因导入受体细胞中2 2）在受体细胞内对目的基因进行）在受体细胞内对目的基因进行）在受体细胞内对目的基因进行）在受体细胞内对目的基因进行大量复制大量复制细菌的质粒细菌的质粒(由天然的由天然的由天然的由天然的改造改造而成而成而成而成)病毒：病毒：噬菌体衍生物噬菌体衍生物噬菌体衍生物噬菌体衍生物、动植物病毒等。、动植物病毒等。39基因工程的基因工程的 载体载体目的目的目的目的基因基因基因基因指指某些小型某些小型DNADNA分子分子能够能够在宿主细胞中在宿主细胞中复制并复制并稳定地稳定地保存保存具有具有多个限制酶切点（多个限制酶切点（每种限制酶切每种限制酶切点最好只有一个点最好只有一个）具有具有标记基因标记基因，便于进行筛选，便于进行筛选条件条件40常用的运载体主要有两类：常用的运载体主要有两类：1）细菌细胞质的）细菌细胞质的质粒质粒 2）噬菌体噬菌体或某些或某些动植物病毒动植物病毒有标记基因的存有标记基因的存在，可用含青霉在，可用含青霉素的培养基鉴别。素的培养基鉴别。有切割位点有切割位点能复制并带着能复制并带着插入的目的基插入的目的基因一起复制因一起复制质粒质粒裸露的、结构简单的、独立于细菌裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核拟核DNA之之外，并具有外，并具有自我复制能力自我复制能力的很小的双链环状的很小的双链环状DNA分分子。子。最常用运载体最常用运载体质粒质粒 实际上在基因工实际上在基因工程操作中，真正程操作中，真正被用作载体的质被用作载体的质粒，都是在天然粒，都是在天然质粒的基础上进质粒的基础上进行过行过人工改造人工改造的。的。42 质粒是染色体外能够进行质粒是染色体外能够进行自主复制自主复制的的裸露的、结构简单的、双链环状裸露的、结构简单的、双链环状DNA分子。分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中放线菌等生物中核以外的核以外的DNA分子分子。Plasmids 质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性作用，但复制只能在宿主细胞内完成。性作用，但复制只能在宿主细胞内完成。性作用，但复制只能在宿主细胞内完成。性作用，但复制只能在宿主细胞内完成。43大肠杆菌的质粒大肠杆菌的质粒 最常用最常用的质粒是的质粒是大肠杆菌的质粒，其大肠杆菌的质粒，其中常含有中常含有抗药基因抗药基因，如四环素、氨苄青霉如四环素、氨苄青霉素的标记基因。素的标记基因。复制的形式：复制的形式：1 1、独立自我复制、独立自我复制、独立自我复制、独立自我复制2 2、整合到染色体上，随染色、整合到染色体上，随染色、整合到染色体上，随染色、整合到染色体上，随染色体体体体DNADNA同步复制同步复制同步复制同步复制。质粒（人工改造的质粒）质粒（人工改造的质粒）质粒（人工改造的质粒）质粒（人工改造的质粒）是是是是基因工程基因工程基因工程基因工程最常用最常用最常用最常用的运载体。的运载体。的运载体。的运载体。44A C GA C GT TG C AG C AGG标记基因标记基因外源基因外源基因A C GA C GT TG C AG C AT T45抗四环素基因抗四环素基因抗四环素基因抗四环素基因四环素四环素四环素四环素生长被抑制生长被抑制正常生活正常生活四环素四环素四环素四环素重组重组重组重组DNADNA46 例、已知标记基因有抗四环素基因和抗氨苄青例、已知标记基因有抗四环素基因和抗氨苄青例、已知标记基因有抗四环素基因和抗氨苄青例、已知标记基因有抗四环素基因和抗氨苄青霉素的基因，霉素的基因，霉素的基因，霉素的基因，现探讨某细菌的质粒中有无标记基因现探讨某细菌的质粒中有无标记基因现探讨某细菌的质粒中有无标记基因现探讨某细菌的质粒中有无标记基因或标记基因是什么或标记基因是什么或标记基因是什么或标记基因是什么？请设计实验、预期实验结果，？请设计实验、预期实验结果，？请设计实验、预期实验结果，？请设计实验、预期实验结果，并得出相应的实验结论。并得出相应的实验结论。并得出相应的实验结论。并得出相应的实验结论。对照组：对照组：对照组：对照组：不添加不添加不添加不添加抗抗抗抗生素生素生素生素实验组实验组实验组实验组1 1 1 1：添加一定添加一定添加一定添加一定浓度的浓度的浓度的浓度的四四四四环素环素环素环素实验组实验组实验组实验组2 2 2 2：添加一定添加一定添加一定添加一定浓度的浓度的浓度的浓度的氨氨氨氨苄青霉素苄青霉素苄青霉素苄青霉素实验组实验组实验组实验组3 3 3 3：添加一定添加一定添加一定添加一定浓度的浓度的浓度的浓度的四四四四环素环素环素环素和和和和氨氨氨氨苄青霉素苄青霉素苄青霉素苄青霉素47对照组：对照组：对照组：对照组：不添加不添加不添加不添加抗抗抗抗生素生素生素生素实验组实验组实验组实验组1 1 1 1：添加一定浓添加一定浓添加一定浓添加一定浓度的度的度的度的四环素四环素四环素四环素实验组实验组实验组实验组2 2 2 2：添：添：添：添加一定浓度的加一定浓度的加一定浓度的加一定浓度的氨苄青霉素氨苄青霉素氨苄青霉素氨苄青霉素实验组实验组实验组实验组3 3 3 3：添加：添加：添加：添加一定浓度的一定浓度的一定浓度的一定浓度的四环四环四环四环素素素素和和和和氨苄青霉素氨苄青霉素氨苄青霉素氨苄青霉素既既既既含有含有含有含有抗四环素基因也抗四环素基因也抗四环素基因也抗四环素基因也含有含有含有含有抗氨苄青霉素基因抗氨苄青霉素基因抗氨苄青霉素基因抗氨苄青霉素基因只含有只含有只含有只含有抗四环素基因抗四环素基因抗四环素基因抗四环素基因只含有只含有只含有只含有抗氨苄青霉素基因抗氨苄青霉素基因抗氨苄青霉素基因抗氨苄青霉素基因既既既既不含有不含有不含有不含有抗四环素基因也抗四环素基因也抗四环素基因也抗四环素基因也不不不不含有含有含有含有抗氨苄青霉素基因抗氨苄青霉素基因抗氨苄青霉素基因抗氨苄青霉素基因48重组重组DNA分子的模拟操作分子的模拟操作注意：这两条注意：这两条DNA分子的碱基对不是随意乱写的。分子的碱基对不是随意乱写的。首先，每个首先，每个DNA分子上的两条链上的碱基要互补分子上的两条链上的碱基要互补配对；配对；第二，每个第二，每个DNA分子中每条链都存在一个分子中每条链都存在一个G-A-A-T-T-C的碱基序列，也就是说是的碱基序列，也就是说是EcoRI限制酶的识限制酶的识别位点，并存在别位点，并存在G-A的切割位点。的切割位点。49天然的天然的DNA分子可以直接用做基因工程分子可以直接用做基因工程 载体吗？为什么？载体吗？为什么？提示：提示：提示：提示：基因工程中作为载体使用的基因工程中作为载体使用的基因工程中作为载体使用的基因工程中作为载体使用的DNADNA分子很多都是分子很多都是分子很多都是分子很多都是 质粒（质粒（质粒（质粒（plasmidplasmid），即独立于细菌拟核处染色），即独立于细菌拟核处染色），即独立于细菌拟核处染色），即独立于细菌拟核处染色 体体体体DNADNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的之外的一种可以自我复制、双链闭环的之外的一种可以自我复制、双链闭环的之外的一种可以自我复制、双链闭环的 裸露的裸露的裸露的裸露的DNADNA分子。分子。分子。分子。是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？不是不是不是不是 作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：501 1）载体载体载体载体DNADNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。才不至于因目的基因的插入而失活。才不至于因目的基因的插入而失活。才不至于因目的基因的插入而失活。2 2）载体载体载体载体DNADNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNADNA上随染色体上随染色体上随染色体上随染色体DNADNA的复制而同步复制。的复制而同步复制。的复制而同步复制。的复制而同步复制。3 3）载体载体载体载体DNADNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。4 4）载体载体载体载体DNADNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。到除受体细胞外的其他生物细胞中去。到除受体细胞外的其他生物细胞中去。到除受体细胞外的其他生物细胞中去。5 5）载体载体载体载体DNADNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。大就不便操作。大就不便操作。大就不便操作。实际上自然存在的质粒实际上自然存在的质粒实际上自然存在的质粒实际上自然存在的质粒DNADNA分子并不完全具备上述条件，分子并不完全具备上述条件，分子并不完全具备上述条件，分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。51DNA连接酶有连接单链连接酶有连接单链DNA的本领吗？的本领吗？迄今为止，所发现的迄今为止，所发现的DNA连接酶都连接酶都不具有不具有连接单链连接单链DNA的能力，至于原因，的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链接单链DNA的酶。的酶。52思考：思考：思考：思考：一、一、质粒是基因工程中最常用的运粒是基因工程中最常用的运载体，它的主要特点体，它的主要特点是是（）1 1能自我复制能自我复制 2 2、不能自我复制不能自我复制3 3、结构很小构很小 4 4、成分是蛋白成分是蛋白质 5 5、是是环状状DNADNA分子分子 6 6、是是环状状RNARNA分子分子7 7、链状状DNADNA分子分子 8 8、能友好地借居在宿主能友好地借居在宿主细胞中胞中二、二、质粒上会存在某些粒上会存在某些标记基因，基因，这些些标记基因有什么基因有什么用途？用途？1、3、5、8 便于筛选、识别便于筛选、识别三、要想将某个特定基因与质粒相连，需要用几种限制三、要想将某个特定基因与质粒相连，需要用几种限制性内切酶和几种性内切酶和几种DNA连接酶处理？连接酶处理？为什么？为什么？一种一种53例1、以下是两种限制酶切割后形成的DNA片段，试分析：GC AATTC GC CTTAA CG G CG G (1)其中其中和和 是由一种限制酶切割形成的是由一种限制酶切割形成的 末端，末端，两者要重组成一个两者要重组成一个DNA 分子，所用分子，所用DNA连接酶通常连接酶通常是是 。(2)和和 是由另一种限制酶切割形成的是由另一种限制酶切割形成的 末端，末端，两者要形成重组两者要形成重组DNA片段，所用的连接酶通常是片段，所用的连接酶通常是 。平T4 DNA连接酶连接酶黏性黏性Ecoli DNA连接酶连接酶54例2、某科学家从细菌中分离出耐高温淀粉酶（Amy）基因a,通过基因工程的方法，将a转到马铃薯植株中，经检测发现Amy在成熟块茎细胞中存在。这一过程涉及 A.目的基因进入受体细胞后，可随着马铃薯的DNA分子的复制而复制，传给子代细胞B.基因a导入成功后，将抑制细胞原有的新陈代谢，开辟新的代谢途径C.细菌的DNA分子较小，可直接作为目的基因，导入受体中不需要整合到马铃薯的DNA分子中D.目的基因来自细菌，可以不需要运载体直接导入受体细胞A例：例：限制性内切酶限制性内切酶的识别序列和切点是的识别序列和切点是GGATCC，限，限制性内切酶制性内切酶的识别序列和切点是的识别序列和切点是GATC。在质粒上有。在质粒上有酶酶的一个切点，在目的基因的两侧各有一个酶的一个切点，在目的基因的两侧各有一个酶的切点。的切点。（1）请画出质粒被限制酶）请画出质粒被限制酶切割后所形成的黏性末端。切割后所形成的黏性末端。（2）请画出目的基因两侧被限制酶）请画出目的基因两侧被限制酶切割后所形成的黏性末切割后所形成的黏性末端。端。（3）在）在DNA连接酶作用下，上述两种不同限制酶切割后形成连接酶作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端能否连接？为什么？的黏性末端能否连接？为什么？可以连接。因为由上述两种不同限制酶切割后形成可以连接。因为由上述两种不同限制酶切割后形成相同的相同的黏黏性末端性末端（或是可以互补的）（或是可以互补的）小试身手小试身手随堂练习：1、关于限制酶的说法中，正确的是（、关于限制酶的说法中，正确的是（）A、限制酶是一种酶，只识别、限制酶是一种酶，只识别GAATTC碱基序碱基序 列列B、EcoRI切割的是切割的是GA之间的氢键之间的氢键C限制酶一般不切割自身的限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切分子，只切 割外源割外源DNAD限制酶只存在于原核生物中限制酶只存在于原核生物中答案：答案：C572 2、以下说法正确的是、以下说法正确的是 （）A A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 B B、质粒是基因工程中唯一的运载体、质粒是基因工程中唯一的运载体 C C、载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶、载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶 切点，以便与外源基因连接切点，以便与外源基因连接 D D、基因控制的性状都能在后代表现出来、基因控制的性状都能在后代表现出来C583 3、下列不是基因载体具备的条件的是（、下列不是基因载体具备的条件的是（）A A、能自我复制、能自我复制 B B、有多个限制酶切点、有多个限制酶切点 C C、具有标记基因、具有标记基因 D D、它是环状、它是环状DNADNAD594 4、有关基因工程的叙述中，错误的是（、有关基因工程的叙述中，错误的是（）A A、DNADNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B B、限制性核酸内切酶用于目的基因的获得、限制性核酸内切酶用于目的基因的获得 C C、目的基因须由载体导入受体细胞、目的基因须由载体导入受体细胞 D D、人工合成目的基因不用限制性内切酶、人工合成目的基因不用限制性内切酶A605 5、有关基因工程的叙述正确的是、有关基因工程的叙述正确的是 （）A A、限制酶只在获得目的基因时才用、限制酶只在获得目的基因时才用 B B、重组质粒的形成在细胞内完成、重组质粒的形成在细胞内完成 C C、质粒都可作为载体、质粒都可作为载体 D D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料D616 6、基基因因工工程程是是在在DNADNA分分子子水水平平上上进进行行设设计计施施工工的的。在在基基因因工工程程操操作作的的基基本本步步骤骤中中，不不进进行行碱碱基基互互补补配配对的步骤是对的步骤是 （）A A、人工合成目的基因、人工合成目的基因 B B、目的基因与载体结合、目的基因与载体结合 C C、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞 D D、目的基因的检测和表达、目的基因的检测和表达C7、在将胰岛素的基因与质粒形成重组DNA分子的过程中，下列哪组是所需要的 同一种限制酶切割两者；不需同一种限制酶切割两者；加入适量的DNA连接酶；不需加DNA连接酶A B C D8、（多选）（多选）有关基因工程的叙述中，错误的是有关基因工程的叙述中，错误的是 A、基因工程技术能定向地改造生物的遗传、基因工程技术能定向地改造生物的遗传 性状，培育生物新品种性状，培育生物新品种 B、重组、重组DNA的形成在细胞内完成的形成在细胞内完成 C、目的基因须由运载体导入受体细胞、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、质粒都可作为运载体、质粒都可作为运载体答案：答案：BD9、下列四条、下列四条DNA分子，彼此间具有粘性末端的一组是分子，彼此间具有粘性末端的一组是 A B C D答案：答案：D10、下列黏性末端属于同种内切酶切割而成的下列黏性末端属于同种内切酶切割而成的 是（是（）A、B、C、D、T C GA G C T T A AA GG T T C C AA G C T T C A G A A T T C G1111、下列哪一种酶是基因工程的工具酶下列哪一种酶是基因工程的工具酶 A A、DNADNA连接酶连接酶 B B、DNADNA酶酶 C C、RNARNA酶酶 D D、运载体、运载体AA1212、下列不适合用于基因工程的运载体下列不适合用于基因工程的运载体是（是（）A A、质粒、质粒 B B、噬菌体、噬菌体 C C、细菌、细菌 D D、病毒、病毒C13、下列说法正确的是下列说法正确的是：（：（）A、限制酶的切口一定是、限制酶的切口一定是GAATTC碱基序列碱基序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、重组技术所用的工具酶是限制酶、重组技术所用的工具酶是限制酶、连接酶、运载体连接酶、运载体 D、利用运载体在宿主细胞内对目的基因、利用运载体在宿主细胞内对目的基因 进行大量复制的过程可称为进行大量复制的过程可称为“克隆克隆”D14、在基因工程中，切割运载体和含有目的基因在基因工程中，切割运载体和含有目的基因 的的DNA片段，需使用（片段，需使用（）A.同种限制酶同种限制酶 B.两种限制酶两种限制酶C.同种连接酶同种连接酶 D.两种连接酶两种连接酶15、基因工程常用的受体细胞有（基因工程常用的受体细胞有（）(1)大肠杆菌大肠杆菌 （2）枯草杆菌）枯草杆菌（3）支原体）支原体 （4）动植物细胞）动植物细胞A.（3）（）（4）B.（1）（）（2）（）（4）C.（2）（）（3）（）（4）D.（1）（）（2）（）（3）16、如如图图为为大大肠肠杆杆菌菌及及质质粒粒载载体体的的结结构构模模式式图图，据图回答下列问题。据图回答下列问题。(3)氨氨 苄 青青 霉霉 素素 抗抗 性性 基基 因因 在在 质 粒粒 DNA上上 称称 为_，其作用是，其作用是_。(4)下列常在基因工程中用作下列常在基因工程中用作载体的是体的是()A苏云金芽云金芽孢杆菌抗虫基因杆菌抗虫基因B土壤土壤农杆菌中的杆菌中的RNA分子分子C大大肠杆菌的杆菌的质粒粒D动物物细胞的染色体胞的染色体【思思路路点点拨】本本题通通过质粒粒结构构的的模模式式图考考查质粒的功能和特点，分析如下：粒的功能和特点，分析如下：17、(2011年年北北大大附附中中高高二二检测)下下列列关关于于DNA连接接酶酶的叙述正确的是的叙述正确的是()催化相同黏性末端的催化相同黏性末端的DNA片段之片段之间的的连接接催化不同黏性末端的催化不同黏性末端的DNA片段之片段之间的的连接接催化两个黏性末端互催化两个黏性末端互补碱基碱基间氢键的形成的形成催催化化DNA分分子子两两条条链的的脱脱氧氧核核糖糖与与磷磷酸酸之之间磷磷酸二酸二酯键的形成的形成ABC D 【尝试解答】解答】D 18、(2011年年雅雅礼礼中中学学高高二二检测)基基因因工工程程中中，须使使用用特特定定的的限限制制酶酶切切割割目目的的基基因因和和质粒粒，便便于于重重组和和筛选。已已知知限限制制酶酶的的识别序序列列和和切切点点是是GGATCC，限限制制酶酶的的识别序序列列和和切切点点是是GATC。根据。根据图示判断下列操作正确的是示判断下列操作正确的是()A目的基因和目的基因和质粒均用限制粒均用限制酶酶切割切割B目的基因和目的基因和质粒均用限制粒均用限制酶酶切割切割C质粒粒用用限限制制酶酶切切割割，目目的的基基因因用用限限制制酶酶切割切割D质粒粒用用限限制制酶酶切切割割，目目的的基基因因用用限限制制酶酶切割切割【尝试解答】解答】D【解解析析】首首先先把把目目的的基基因因切切下下来来要要用用到到限限制制酶酶；如如果果再再用用限限制制酶酶切切割割质粒粒，则2个个标记基基因因都都被被切切开开，标记基基因因将将失失去去作作用用。而而用用限限制制酶酶切切割割质粒粒可可保保留留一一个个标记基基因因，而而产生生的的黏黏性性末末端端和和限制限制酶酶切割下来的目的基因可以互切割下来的目的基因可以互补配配对。【互互动探探究究】上上题中中限限制制酶酶切切开开化化学学键后后产生生哪种哪种类型的末端？型的末端？【提示】【提示】黏性末端。黏性末端。【易易误警警示示】(1)限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶是是一一类酶酶而而不不是一种是一种酶酶。(2)限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶作作用用的的化化学学键为磷磷酸酸二二酯键，而不是而不是氢键。(3)不不同同种种类的的限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶识别与与切切割割的的位位点点不同，不同，这与与酶酶的的专一性是一致的。一性是一致的。总结规律总结规律限制酶所识别的序列有什么特点？限制酶所识别的序列有什么特点？限制酶所识别的序列有什么特点？限制酶所识别的序列有什么特点？无论是无论是6 6个碱基还是个碱基还是4 4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链轴线两侧的双链DNADNA上的碱基是反向对称重复排列的。上的碱基是反向对称重复排列的。思考与探究思考与探究思考与探究思考与探究1 1 1 1限制酶在限制酶在DNADNA的任何部位都能将的任何部位都能将DNADNA切开吗？以下切开吗？以下是四种不同限制酶切割形成的是四种不同限制酶切割形成的DNADNA片段：片段：(1)CTGCA(2)AC(3)GC(1)CTGCA(2)AC(3)GC G TG G TG CGCG（4 4）G (5)G(6)GCG (5)G(6)GC CTTAA ACGTC CG CTTAA ACGTC CG(7)GT(8)AATTC(7)GT(8)AATTC CA G CA G你是否能将同种限制酶切割后产生的末端连接起来？你是否能将同种限制酶切割后产生的末端连接起