重组体克隆的筛选和鉴定.pptx

17第1页/共39页大肠杆菌第2页/共39页一、抗药性标记及其插入失活选择法pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因:Tetr和Ampr。Tetr上有插入位点BamH I和Sal I;Ampr上有插入位点Pst I。第一节 载体表型选择法1.原理：第3页/共39页pBR322第4页/共39页（1）四环素：（2）氨苄青霉素抗性基因：2.pBR322抗菌素标记选择产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色。抑制细菌生长，但不杀死细菌。杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。（3）环丝氨酸：第5页/共39页3.选择过程：如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素抗性基因失活，可用四环素加环丝氨酸平板培养基选择重组克隆。Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；丝氨酸杀死，保留下来；Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。反而被环丝氨酸杀死。（1）四环素抗性插入失活第6页/共39页无环丝氨酸培养基第7页/共39页（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。第8页/共39页二、-半乳糖苷酶显色反应选择法-半乳糖苷酶 乳糖半乳糖葡萄糖Xgal半乳糖5-溴-4-氯靛蓝+深蓝色1.原理：载体上有一段 -半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（Lac ZLac Z）的）的 片段片段（氨基端），其上有外源（氨基端），其上有外源DNADNA的插入位点。的插入位点。受体菌受体菌基因组基因组中有突变的中有突变的 -半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（片段缺失）片段缺失）。可以被。可以被IPTGIPTG诱导表达。诱导表达。载体和受体菌基因组可以载体和受体菌基因组可以互补互补形成完整有功能的形成完整有功能的 -半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。Xgal-(5-溴-4-氢-吲哚半乳糖苷)第9页/共39页-半乳糖苷酶法lacZAmN2H 片段COOHCOOH片段第10页/共39页X-galLac Z蓝色化合物X-gal第11页/共39页（LacZLacZ基因基因 N N端序列）端序列）插入片段插入片段（LacZLacZ基因失活）基因失活）LacZLacZ基因基因 N N端序列端序列LacZLacZ酶酶第12页/共39页2.选择过程第13页/共39页-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。第14页/共39页利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。一、直接电泳检测法从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。第二节 DNA电泳检测法 分子量 Marker载体重组克隆第15页/共39页筛选过程第16页/共39页1.原理PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断。2.过程（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。（2）按照外源DNA插入片断设计引物作PCR。（3）电泳PCR产物。（4）检查是否有PCR产物。（5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。第三节 PCR扩增检测法 第17页/共39页凝胶电泳检测加样孔DNA MarkerDNA Marker空质粒空质粒重组质粒重组质粒 重组质粒酶切重组质粒酶切重组质粒的重组质粒的PCRPCR扩增片段扩增片段电泳检测法、酶切法、法凝胶电泳检测电泳检测法、酶切法、法凝胶电泳检测第18页/共39页1.核酸杂交第四节 核酸杂交检测法 一、原理：重组克隆与探针杂交。3.识别标记32P 或 125I。（1）放射性同位素2.检测用的探针与外源DNA插入片断互补的序列。（2）非放射性标记荧光素第19页/共39页二、核酸杂交检测方法用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。1.Southern blotting从宿主细胞中提取DNA（或质粒载体），再用探针杂交。只有带有插入片断的重组载体才能只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂交，在底片上曝光显示。与探针杂交，在底片上曝光显示。第20页/共39页（1）原位杂交筛选特点：对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。第21页/共39页利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性质可分为几种作用方式：一、放射性抗体检测法第五节 免疫化学检测法 1.抗体与产物的结合方式对表达产物的检测。蛋白蛋白“杂交”第22页/共39页待测基因 产物蛋白一抗二抗125I 标记的二 抗结合蛋白固相支持滤膜待测基因 产物蛋白一抗125I标记的二抗固相支持滤膜待测基因 产物蛋白一抗固相支持滤膜固相支持滤膜待测基因 产物蛋白一抗 二抗125I 标记的二抗 结合蛋白125I标记的二抗第23页/共39页2.放射性抗体检测法过程第24页/共39页二、免疫沉淀检测法把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体反应形成“沉淀圈”。1.原理抗原抗体凝集反应。检测分泌型产物。2.方法第25页/共39页对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。第26页/共39页三、酶联免疫吸附测定（ELISA）Enzyme-linked immunosorbant assay1.原理：一抗（primary antibody）:与目标分子的特异结合。二抗（secondary antibody）：与一抗的特异性结合。酶连（enzyme-linke）：二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。第27页/共39页待测基因 产物蛋白一抗二抗酶 待测基因 产物蛋白一抗 二抗无色的底物有色的产物比色观察酶 19第28页/共39页2.ELISA检测的一般步骤（1）固定样品将待测样品加入96孔微量滴定板（microtiter plate）的孔中，干燥后就被固定在孔底。孔底第29页/共39页加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。（2）一抗结合一抗第30页/共39页加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉。二抗只识别一抗。二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物酶、脲酶等）。（3）二抗结合二抗第31页/共39页加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物质（或发光）。（4）显色反应第32页/共39页第33页/共39页在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打印出结果。（5）比色第34页/共39页3.ELISA的局限性有效，但准确性稍差（主要取决于一抗的特异性）。必须与其他方法一起综合考虑。最好用单克隆抗体（monoclonal antibody）第35页/共39页临床检验常用的单抗第36页/共39页结果多克隆抗体Blotting的结果单抗blotting结果第37页/共39页一般克隆与筛选策略第38页/共39页感谢您的观看！第39页/共39页