基因克隆表达.ppt

基因的克隆与表达基因的克隆与表达基因克隆基因克隆(genecloning)基因表达基因表达(geneexpression)-原核基因表达原核基因表达 -真核基因表达真核基因表达基 因 克 隆 Gene Cloning概述概述克隆克隆载载体体受体受体细细胞胞体外重体外重组组的策略的策略基因克隆工作流程基因克隆工作流程一、概述确定了遗传信息的携带者，即基因的盆子载体是DNA而不是蛋白质揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理提出了中心法则和操纵子学说，破译了遗传密码1973年年Cohen完成第一个基因工程完成第一个基因工程实验实验经经体外重体外重组组获获得得杂杂合合DNA杂杂合子合子转转化入大化入大肠肠杆菌杆菌所需元件：所需元件：限制性内切限制性内切酶酶连连接接酶酶载载体体受体受体细细胞胞基因克隆（分子克隆基因克隆（分子克隆molecularcloning）-通通过过体外重体外重组组技技术术,将一将一段目的段目的DNA经经切割、切割、连连接插入适当接插入适当载载体体，并，并导导入入受体受体细细胞胞，扩扩增形成大量增形成大量子代分子的子代分子的过过程。程。基因克隆的核心基因克隆的核心-体外重体外重组组(Recombination):人工将一段目的人工将一段目的DNA插入一个插入一个载载体的体的过过程。程。基因克隆的技基因克隆的技术术路路线线目的基因目的基因载载体体体外重体外重组组重重组组子（子（杂杂合合DNA）转转化化受体受体细细胞胞筛选筛选阳性克隆阳性克隆大量大量扩扩增，增，获获得子代得子代DNA二、克隆二、克隆载载体体复制基因(replicator)选择性记号克隆位点三、受体三、受体细细胞胞1、定、定义义：外源：外源DNA导导入的入的细细胞，是重胞，是重组组体体扩扩增的增的场场所。所。2、要求：易于接、要求：易于接纳纳外源外源DNA 无特异的内源性核酸内切无特异的内源性核酸内切酶酶 载载体复制、体复制、扩扩增不受阻增不受阻 与与载载体有互体有互补补性性四、体外重四、体外重组组的策略的策略1、粘末端、粘末端连连接接1）全同源粘末端）全同源粘末端连连接接 最方便最方便简单简单 高背景高背景-载载体自身体自身环环化化 双向插入双向插入2）定向克隆：使外源基因定向插入到）定向克隆：使外源基因定向插入到载载体体中的克隆策略中的克隆策略粘粘-粘粘连连接：最有效、最快捷接：最有效、最快捷粘粘-平平连连接：适用于外源基因接：适用于外源基因仅仅与与载载体有体有一个相同一个相同酶酶切位点，可将另一末端切位点，可将另一末端补补平平2、平末端、平末端连连接：接：酶酶切点切点为为平末端或任何两个末端平末端或任何两个末端补补平平的的DNA效率低，效率低，酶酶用量大用量大3、人工接、人工接头连头连接接人工接人工接头头：人工合成含有：人工合成含有酶酶切位点的寡切位点的寡核苷酸片段核苷酸片段4、T-A克隆克隆T-vector两条两条链链的的5端含有一个游端含有一个游离的离的TPCR过过程中，普通的程中，普通的Taq酶酶可在可在产产物的物的3端多加一个端多加一个A五、基因克隆的工作流程五、基因克隆的工作流程（一）目的基因的（一）目的基因的获获得得1、直接分离、直接分离3、构建、构建cDNA文文库库4、PCR5、人工合成、人工合成6、差异、差异显显示示1、直接分离、直接分离DNA适用于克隆原核生物的适用于克隆原核生物的基因基因组组文文库库2、构建基因、构建基因组组文文库库，筛选筛选目的基因目的基因基因基因组组文文库库(gene library)：将某种将某种生物的基因生物的基因组组DNA切割成一定大小切割成一定大小的片段，并与合适的的片段，并与合适的载载体重体重组组后后导导入宿主入宿主细细胞，胞，进进行克隆。行克隆。这这些存在些存在于所有重于所有重组组体内的基因体内的基因组组DNA片段片段的集合，即基因的集合，即基因组组文文库库，它包含了，它包含了该该生物的所有基因。生物的所有基因。构建流程构建流程抽提基因抽提基因组组DNA鸟枪鸟枪法制法制备备DNA片片段段DNA片段与片段与载载体重体重组组转转化宿主菌化宿主菌筛选筛选目的基因（核酸探目的基因（核酸探针针法、法、免疫免疫结结合法）合法）特点及特点及应应用：用：包含所有包含所有遗传遗传信息信息构建构建难难度大（度大（单单拷拷贝贝基因、基因、长长片段基因）片段基因）筛选难筛选难度大度大用于研究基因在基因用于研究基因在基因组组中的情况中的情况3、构建、构建cDNA文文库库，筛选筛选目的基因目的基因cDNA文文库库(complementary DNA library)以以组织细组织细胞中的胞中的mRNA为为模模板，反板，反转录转录合成双合成双链链cDNA，各，各cDNA分子分分子分别别插入插入载载体形成重体形成重组组子，子，再再导导入宿主入宿主细细胞克隆胞克隆扩扩增。增。这这些在重些在重组组体内的体内的cDNA的集合即的集合即cDNA文文库库。cDNA文文库仅库仅包含正在表达的基因包含正在表达的基因不同物种、不同不同物种、不同组织组织的的cDNA文文库库不相同不相同基因基因总总量少，易量少，易筛选筛选4、PCR扩扩增目的基因片段增目的基因片段适用于克隆序列清楚的基因适用于克隆序列清楚的基因以基因以基因组组DNA为为模板，直接模板，直接进进行行PCR扩扩增增较难较难多采用以多采用以mRNA为为模板的模板的RT-PCR法法5、人工合成、人工合成较较短的短的DNA6、差异、差异显显示法示法(differential display,DD)筛选筛选差异表达的基因差异表达的基因（二）体外重（二）体外重组组连连接体系的建立：接体系的建立：温度：粘末端温度：粘末端连连接：接：12-18 平末端平末端连连接：室温（低于接：室温（低于30)DNA量：量：载载体分子数体分子数/目的基因分子数目的基因分子数=1：1-3酶酶量：平端量：平端连连接接时时需加大需加大酶酶量量（三）（三）转转化化Cacl2法、法、电击电击法法（四）重（四）重组组子的子的筛选筛选及及鉴鉴定定1、筛选筛选：平板法（抗生素、：平板法（抗生素、蓝蓝白斑）白斑）原位原位杂杂交交2、鉴鉴定：定：长长度度鉴鉴定：定：酶酶切、切、PCR方向方向鉴鉴定：定：联联合合酶酶切切测测序序基因的表达基因的表达 Gene Expression一表达系一表达系统统：基基因因工工程程中中用用来来获获得得有有功功能能的的异异源源蛋蛋白白质质的的体体系系，包包括括克克隆隆载载体体，表表达达载载体体及及受体受体细细胞。胞。据受体据受体细细胞的不同可分胞的不同可分为为：1原核表达系原核表达系统统：将将外外源源基基因因引引入入原原核核细细胞胞，并并使使其其在在原原核核细细胞胞中中以以发发酵酵形形式式快快速速高高效效地地表表达达、合成基因合成基因产产物的体系。物的体系。2真核表达系真核表达系统统：使外源基因在真核：使外源基因在真核细细胞中表达的体系。胞中表达的体系。二原核生物基因二原核生物基因结结构和表达特点构和表达特点1.原核生物染色体原核生物染色体DNA是裸露的是裸露的环环形形DNA，其其转录转录和翻和翻译译是偶是偶联联的的连续连续进进行。行。2.原核生物形成原核生物形成多多顺顺反子反子mRNA：mRNA在合成在合成过过程中和多个核糖体程中和多个核糖体结结合，翻合，翻译译形成多条形成多条肽链肽链。3、一般不含内含子（、一般不含内含子（intron），没有），没有转转录录及翻及翻译译后加工系后加工系统统4、原原核核生生物物中中功功能能相相关关的的基基因因串串联联在在一起，形成一起，形成操操纵纵子子。操操纵纵子（子（operon）：是一：是一组组功能上相功能上相关，受同一关，受同一调调控区控制的基因控区控制的基因组组成的成的一个一个遗传单遗传单位位原原核核生生物物基基因因表表达达的的基基本本单单位位（即即一一个个转录单转录单位）。位）。共共同同协协调调作作用用，完完成成某某一一多多肽肽的的表表达达调调控。控。包包括括：调调控控区区(调调节节基基因因，启启动动基基因因，操作基因操作基因)、结结构基因构基因5、原核生物中参与、原核生物中参与转录转录的基因的基因结结构：构：启启动动子子终终止子止子启启动动子子(promoter,P)是指能被是指能被RNA聚合聚合酶酶识别识别、结结合并启合并启动动基因基因转录转录的一段的一段DNA序列。序列。一般一般长长40-60bp，富含富含A-T碱基碱基对对具有保守序列：具有保守序列：-10区（区（pribnow box）：）：TATAAT -35区：区：RNA聚合聚合酶酶识别识别并并结结合启合启动动子，但并不开始子，但并不开始转录转录各种启各种启动动子启子启动转录动转录能力不同。能力不同。启启动动子子强强弱取决于弱取决于-35区和区和-10区的碱基区的碱基组组成及其成及其间间隔序列隔序列终终止子（止子（terminator，T）:位于基因位于基因3端端,给给予予RNA聚合聚合酶酶转录终转录终止信号的止信号的DNA序序列列 6、与与转转译译有有关关的的原原核核细细胞胞结结构构：核糖体核糖体结结合位点合位点转译转译起始密起始密码码子子AUG 或或GUGSD顺顺序序（shine-dalgarno）：）：AUG上游上游3-11 bp长约长约3-9bpmRNA与与16s核核糖糖体体亚亚基基间间的的识识别别与与结结合序列合序列 三三外外源源基基因因在在原原核核表表达达系系统统中中表表达达的必要条件的必要条件：1.删删除内含子和除内含子和5非非编码编码区区2.外外源源基基因因置置于于强强启启动动子子和和SD顺顺序序控控制制下下3.维维持正确开放持正确开放阅读阅读框架（框架（ORF）4.mRNA稳稳定且可有效定且可有效转译转译，形成的蛋，形成的蛋白白质质不被降解不被降解四四影影响响外外源源基基因因在在原原核核细细胞胞中中表表达效率的因素达效率的因素：1、启、启动动子：建立表达子：建立表达载载体体时时，选择选择强强启启动动子。子。常常见见原核原核强强启启动动子子：Plac：受受Lac阻阻遏遏蛋蛋白白负负调调，受受IPTG的的诱导诱导Ptrp：取自大取自大肠肠杆菌色氨酸操杆菌色氨酸操纵纵子。子。Ptac:Lac启启动动子子和和Trp启启动动子子的的杂杂合合启启动动子。子。PL和和PR启启动动子子：噬菌体早期左：噬菌体早期左/右向启右向启动动子，受子，受噬菌体噬菌体CI基因基因负调负调控。温度控。温度诱导诱导。2、基因、基因剂剂量：量：3、核糖体、核糖体结结合位点：合位点：SD顺顺序与序与16srRNA3末端互末端互补补程度。程度。AUGSD间间距离。距离。AUG后的核苷酸后的核苷酸五原核表达五原核表达载载体：体：适用于在原核适用于在原核细细胞胞中表达外源基因的中表达外源基因的载载体。体。主要元件：主要元件：强强启启动动子子 SD顺顺序序 筛选标筛选标志志 其它其它调调控基因控基因类类型：型：融合型表达融合型表达载载体：体：-融合蛋白融合蛋白非融合型表达非融合型表达载载体：体：-天然完整蛋白天然完整蛋白分泌型表达分泌型表达载载体：体：-产产物可跨膜分泌物可跨膜分泌至胞周至胞周间间隙隙（一）融合型表达（一）融合型表达载载体体PSDForeignDNA融合型表达融合型表达载载体体融合基因融合基因技技术术关关键键：克隆基因插入原核序列：克隆基因插入原核序列3端端而而维维持正确持正确阅读阅读框架框架。选择选择合适合适酶酶切位点切位点加人工合成的加人工合成的DNA接接头头构建位相构建位相载载体体-ATG-AACCTGGAATTCCTAGGT-TAC-TTGGACCTTAAGGATCCA-EcoRIBamHIAATCGGAAGAATTCAGACCTAGGTTTAGCCTTCTTAAGTCTGGCTCCA载载体部分序列体部分序列DNA序列序列位相位相载载体体-含有含有3种种读码读码框的系列框的系列载载体体优优点：点：表达效率高表达效率高产产物物稳稳定定 易易鉴鉴定定：融融合合蛋蛋白白分分子子量量大大，电电泳泳可可鉴鉴定定易易纯纯化：利用融合原核多化：利用融合原核多肽肽的特性的特性Ptac：IPTG诱导诱导GST融合蛋白融合蛋白直接直接纯纯化化产产物切割方便：物切割方便：pGEX-1 T凝血凝血酶酶pGEX-2T-凝血凝血酶酶pGEX-3T-X因子因子位相位相载载体体融合型融合型载载体体-pGEX系列系列（二）非融合型表达（二）非融合型表达载载体体PSDForeignDNA非融合型表达非融合型表达载载体体非融合基因非融合基因主要元件：主要元件：强强启启动动子子 SD：ATG：第一个密：第一个密码码子子非融合型表达非融合型表达载载体体-pPL-LamdaPL启启动动子子-温度温度诱导诱导插入位点插入位点-HpaI（三）分泌型表达（三）分泌型表达载载体：体：1、主要元件：、主要元件：启启动动子和子和SD序列序列信信号号肽肽序序列列：SD下下游游，编编码码信信号号肽肽，可引可引导导蛋白跨膜蛋白跨膜2、优优点：分泌表达，避免降解。点：分泌表达，避免降解。分泌型表达分泌型表达载载体体-pINIII-ompA1分泌型融合表达分泌型融合表达载载体体-pEZZ18六提高表达水平的手段六提高表达水平的手段1、选择选择合适合适载载体，提高翻体，提高翻译译水平水平 强强启启动动子子-提高提高转录转录水平水平核糖体核糖体结结合位点（合位点（ATG-SD）避免避免产产物降解物降解：分泌：分泌/融合表达融合表达 细细菌蛋白菌蛋白酶酶抑制抑制剂剂2、选择选择合适宿主合适宿主 Lac 启启动动子子-LacI菌菌PL/PR -CI857 溶源菌溶源菌3、诱导诱导表达表达温度温度诱导诱导-PLPR/IPTG的化学的化学诱导诱导-Plac、Ptac4、提高表达蛋白的、提高表达蛋白的稳稳定性，防止被宿定性，防止被宿主降解主降解七表达七表达产产物的物的检测检测：1、特异性、特异性鉴鉴定：定：荧荧光抗体法光抗体法免疫沉淀法免疫沉淀法免疫印迹法免疫印迹法ELISA2、生物学活性生物学活性鉴鉴定定八、原核表达系八、原核表达系统统的缺点的缺点1、没有、没有转录转录后加工系后加工系统统，不能，不能识别识别、剪除内含子剪除内含子2、缺乏翻、缺乏翻译译后加工系后加工系统统，不能，不能对对翻翻译译的蛋白的蛋白质进质进一步修一步修饰饰加工加工真核表达系真核表达系统统的必要性及的必要性及优势优势1.具具转录转录后加工系后加工系统统2.具翻具翻译译后修后修饰饰系系统统3.可可实现实现真正的分泌表达真正的分泌表达4.基因治基因治疗疗真核基因真核基因结结构及表达构及表达调调控特点控特点（一）真核基因（一）真核基因组组的复的复杂杂性性真核基因真核基因组庞组庞大，大，具大量非具大量非编码编码序列序列-mRNA丰度不同丰度不同结结构复构复杂杂：染色：染色质质、核膜、核膜、线线粒体粒体-表达表达调调控多控多样样不不连续连续性：内含子、外性：内含子、外显显子子没有操没有操纵纵子子结结构构(二）真核表达系二）真核表达系统统组组成：真核表达成：真核表达载载体体受体受体细细胞胞基因基因转转移方式移方式据受体据受体细细胞及表达胞及表达载载体的不同分体的不同分为为3种：种：酵母表达系酵母表达系统统哺乳哺乳动动物物细细胞表达系胞表达系统统昆虫昆虫细细胞表达系胞表达系统统（三）（三）转转化化1、原生、原生质质体法：去除厚壁体法：去除厚壁2、电电穿孔法：效率穿孔法：效率较较高高（四）外源基因的表达（四）外源基因的表达1、胞内表达、胞内表达2、分泌表达：在、分泌表达：在MCS前加入信号前加入信号肽肽序列序列（五）缺点（五）缺点不能不能实现实现全部的翻全部的翻译译后修后修饰饰功能功能