吸光光度法3.ppt

第第 九九 章章吸吸 光光 光光 度度 法法化学分析化学分析：常量组分：常量组分(1%),Er 0.1%0.2%依据化学反应依据化学反应,使用玻璃仪器使用玻璃仪器 化学分析与仪器分析方法比较化学分析与仪器分析方法比较仪器分析仪器分析：微量组分：微量组分(101010105 5 5 5 超高灵敏度超高灵敏度超高灵敏度超高灵敏度 =（6-106-106-106-10）101010104 4 4 4 高灵敏度高灵敏度高灵敏度高灵敏度 2 2 2 2 101010104 4 4 4 不灵敏不灵敏不灵敏不灵敏朗伯朗伯-比尔定律的适用条件比尔定律的适用条件1.单色光单色光 应选用应选用 max处或肩峰处测定处或肩峰处测定2.吸光质点形式不变吸光质点形式不变 离解、络合、缔合会破坏线性关系离解、络合、缔合会破坏线性关系 应控制条件应控制条件(酸度、浓度、介质等酸度、浓度、介质等)3.稀溶液稀溶液 浓度增大，分子之间作用增强浓度增大，分子之间作用增强 x104(nm)亚甲蓝阳离子水溶液的吸收光谱亚甲蓝阳离子水溶液的吸收光谱a.6.3610-6 mol/Lb.1.2710-4 mol/Lc.5.9710-4 mol/L亚甲蓝阳离子亚甲蓝阳离子单体单体 max=660 nm二聚体二聚体 max=610 nm二聚体的二聚体的生成破坏生成破坏了了A与与c的线性关系的线性关系 0 1 2 3 4 mg/mlA。*0.80.60.40.20溶液浓度的测定溶液浓度的测定A bc工作曲线法工作曲线法(校准曲线校准曲线)朗伯朗伯-比尔定律的分析应用比尔定律的分析应用吸光度的加合性吸光度的加合性 在在多多组组分分体体系系中中如如果果各各吸吸光光物物质质之之间间无无相相互互作作用用这这时时体体系系总总的的吸吸光光度度等等于于各各个个吸吸光光物物质的吸光度之和。质的吸光度之和。9.1.3 9.1.3 偏离比耳定律的原因偏离比耳定律的原因在相同条件下测得试液的吸光度，从工作曲线上在相同条件下测得试液的吸光度，从工作曲线上在相同条件下测得试液的吸光度，从工作曲线上在相同条件下测得试液的吸光度，从工作曲线上就可查得试液的浓度，这就是工作曲线法。就可查得试液的浓度，这就是工作曲线法。就可查得试液的浓度，这就是工作曲线法。就可查得试液的浓度，这就是工作曲线法。1.1.1.1.现象现象现象现象 标准曲线法测定未知溶液的浓度时，发现：标标准曲线法测定未知溶液的浓度时，发现：标标准曲线法测定未知溶液的浓度时，发现：标标准曲线法测定未知溶液的浓度时，发现：标准曲线常发生弯曲（尤其当溶液浓度较高时），这准曲线常发生弯曲（尤其当溶液浓度较高时），这准曲线常发生弯曲（尤其当溶液浓度较高时），这准曲线常发生弯曲（尤其当溶液浓度较高时），这种现象称为对朗伯种现象称为对朗伯种现象称为对朗伯种现象称为对朗伯比耳定律的偏离。比耳定律的偏离。比耳定律的偏离。比耳定律的偏离。难以获得真正的纯单色光。难以获得真正的纯单色光。难以获得真正的纯单色光。难以获得真正的纯单色光。分光光度计只能获得近乎单色的狭窄光带，是一分光光度计只能获得近乎单色的狭窄光带，是一分光光度计只能获得近乎单色的狭窄光带，是一分光光度计只能获得近乎单色的狭窄光带，是一个有限波长宽度的复合光。复合光可导致对朗伯个有限波长宽度的复合光。复合光可导致对朗伯个有限波长宽度的复合光。复合光可导致对朗伯个有限波长宽度的复合光。复合光可导致对朗伯比比比比耳定律的正或负偏离。耳定律的正或负偏离。耳定律的正或负偏离。耳定律的正或负偏离。非单色光、杂散光、非平行入射光都会引起对朗非单色光、杂散光、非平行入射光都会引起对朗非单色光、杂散光、非平行入射光都会引起对朗非单色光、杂散光、非平行入射光都会引起对朗伯伯伯伯比耳定律的偏离比耳定律的偏离比耳定律的偏离比耳定律的偏离.最主要的是非单色光作为入射光引起的偏离。最主要的是非单色光作为入射光引起的偏离。最主要的是非单色光作为入射光引起的偏离。最主要的是非单色光作为入射光引起的偏离。2.2.2.2.引起偏离的因素（两大类）引起偏离的因素（两大类）引起偏离的因素（两大类）引起偏离的因素（两大类）（1 1 1 1）物理性因素，即仪器的非理想引起的；物理性因素，即仪器的非理想引起的；物理性因素，即仪器的非理想引起的；物理性因素，即仪器的非理想引起的；物理因素：物理因素：非单色光作为入射光引起的偏离：非单色光作为入射光引起的偏离：假设由波长为假设由波长为假设由波长为假设由波长为1 1 1 1和和和和2 2 2 2的两单色光的两单色光的两单色光的两单色光组成的入射光通过浓度为组成的入射光通过浓度为组成的入射光通过浓度为组成的入射光通过浓度为c c c c的溶液，则：的溶液，则：的溶液，则：的溶液，则：A A1 1lglg（0101/t1t1 ）1 1 bcbc A A2 2lglg(0202/t2t2 ）2 2 bcbc式中：式中：式中：式中：0 0 0 01 1 1 1、0 0 0 02 2 2 2分别为分别为分别为分别为1 1 1 1、2 2 2 2 的入射光强度；的入射光强度；的入射光强度；的入射光强度；t1t1t1t1 、t2t2t2t2分别为分别为分别为分别为1 1 1 1、2 2 2 2 的透射光强度；的透射光强度；的透射光强度；的透射光强度；1 1 1 1、2 2 2 2分别为分别为分别为分别为1 1 1 1、2 2 2 2的摩尔吸收系数；的摩尔吸收系数；的摩尔吸收系数；的摩尔吸收系数；故：故：A A总总总总 =lglg（0 0总总总总/t t总总总总 )=lg(=lg(I I0 01 1 +0 02 2)/()/(t1t1 +t2t2 ）=lg(=lg(I I0 01 1 +o o2 2)/()/(0 01 1 10 10-1 1 bcbc +0 02 2 10 10-2 2 bcbc ）令：令：令：令：2 2 -1 1=；设：设：设：设：0 01 1 =0 02 2 lglg（0 0/t t ）bcbc I It t=I=I0 010 10-bcbc 因实际上只能测总吸光度因实际上只能测总吸光度因实际上只能测总吸光度因实际上只能测总吸光度A A总总总总，故故故故A总总=A总总=lg(2I01)/t 1(1+10-bc)=A1+lg2-lg(1+10-bc)Lg(2ILg(2I0 0)/(It)/(It1 1+It+It2 2)讨论：讨论：A A总总总总=A A1 1+lg2-lg(1+lg2-lg(11010 bcbc )(1)(1)=0=0；即即即即：1 1=2 2 =则则则则：A A总总总总 lglg（o o/t t）bcbc(2)(2)0 0 若若若若 0 0；即即即即 2 2 0,0,A A总总总总值随值随值随值随c c值增大而减小，则标准曲线偏离直线向值增大而减小，则标准曲线偏离直线向值增大而减小，则标准曲线偏离直线向值增大而减小，则标准曲线偏离直线向c c 轴弯轴弯轴弯轴弯曲，即负偏离；曲，即负偏离；曲，即负偏离；曲，即负偏离；反之，则向反之，则向反之，则向反之，则向A A轴弯曲，即正偏离。轴弯曲，即正偏离。轴弯曲，即正偏离。轴弯曲，即正偏离。讨论：讨论：(3)(3)很小时，即很小时，即很小时，即很小时，即 1 1 2 2：可近似认为是单色光。在低浓度范围内，不发生可近似认为是单色光。在低浓度范围内，不发生可近似认为是单色光。在低浓度范围内，不发生可近似认为是单色光。在低浓度范围内，不发生 偏离。偏离。偏离。偏离。(4)(4)(4)(4)为克服非单色光引起的偏离，首先应选择比较好为克服非单色光引起的偏离，首先应选择比较好为克服非单色光引起的偏离，首先应选择比较好为克服非单色光引起的偏离，首先应选择比较好 的单色器。此外还应将入射波长选定在待测物质的单色器。此外还应将入射波长选定在待测物质的单色器。此外还应将入射波长选定在待测物质的单色器。此外还应将入射波长选定在待测物质 的最大吸收波长且吸收曲线较平坦处。的最大吸收波长且吸收曲线较平坦处。的最大吸收波长且吸收曲线较平坦处。的最大吸收波长且吸收曲线较平坦处。讨论讨论：选选选选用用用用谱谱谱谱带带带带a a a a的的的的复复复复合合合合光光光光进进进进行行行行测测测测量量量量，得得得得到到到到右右右右图图图图的的的的工工工工作作作作曲曲曲曲线线线线a a，A A与与与与c c基本呈直线关系基本呈直线关系基本呈直线关系基本呈直线关系。选用谱带选用谱带选用谱带选用谱带b b的复合光进行测量的复合光进行测量的复合光进行测量的复合光进行测量，的变化较大的变化较大的变化较大的变化较大，则则则则A A随随随随波波波波长长长长的的的的变变变变化化化化较较较较明明明明显显显显，得得得得到到到到的的的的工工工工作作作作曲曲曲曲线线线线明明明明显显显显偏离线性。偏离线性。偏离线性。偏离线性。(2)化学性因素化学性因素朗伯朗伯朗伯朗伯比耳定律的假定：所有的吸光质点之间不发生相比耳定律的假定：所有的吸光质点之间不发生相比耳定律的假定：所有的吸光质点之间不发生相比耳定律的假定：所有的吸光质点之间不发生相互作用；仅在稀溶液互作用；仅在稀溶液互作用；仅在稀溶液互作用；仅在稀溶液(c c1010 10-2-2 mol L mol L-1-1时，吸光质点间可能发生缔时，吸光质点间可能发生缔时，吸光质点间可能发生缔时，吸光质点间可能发生缔合等相互作用，直接影响了对光的吸收。合等相互作用，直接影响了对光的吸收。合等相互作用，直接影响了对光的吸收。合等相互作用，直接影响了对光的吸收。故：朗伯故：朗伯故：朗伯故：朗伯比耳定律只适用于稀溶液。比耳定律只适用于稀溶液。比耳定律只适用于稀溶液。比耳定律只适用于稀溶液。溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配合物的形溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配合物的形溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配合物的形溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配合物的形成等化学平衡时。使吸光质点的浓度发生变化。成等化学平衡时。使吸光质点的浓度发生变化。成等化学平衡时。使吸光质点的浓度发生变化。成等化学平衡时。使吸光质点的浓度发生变化。质点间的静电作用质点间的静电作用质点间的静电作用质点间的静电作用质点间的缔合作用质点间的缔合作用质点间的缔合作用质点间的缔合作用质点间的化学反应质点间的化学反应质点间的化学反应质点间的化学反应例：例：例：例：CrOCrO4 42-2-+2+2HH+=Cr Cr2 2OO7 72-2-+HH2 2OO稀释溶液或增大溶液稀释溶液或增大溶液稀释溶液或增大溶液稀释溶液或增大溶液pHpH，CrCr2 2OO7 72-2-CrO CrO4 42-2-溶液在高酸度溶液在高酸度溶液在高酸度溶液在高酸度时测定，六价铬均以时测定，六价铬均以时测定，六价铬均以时测定，六价铬均以CrCr2 2OO7 72-2-形式存在形式存在形式存在形式存在吸光质点间相互作用引起的对吸光定律的偏离吸光质点间相互作用引起的对吸光定律的偏离吸光质点间相互作用引起的对吸光定律的偏离吸光质点间相互作用引起的对吸光定律的偏离9.2 9.2 光度计及其基本部件光度计及其基本部件分光光度计：测定物质吸光度分光光度计：测定物质吸光度分光光度计：测定物质吸光度分光光度计：测定物质吸光度紫外可见分光光度计，可见分光光度计紫外可见分光光度计，可见分光光度计紫外可见分光光度计，可见分光光度计紫外可见分光光度计，可见分光光度计单波长单光束分光光度计：常见单波长单光束分光光度计：常见单波长单光束分光光度计：常见单波长单光束分光光度计：常见单波长双光束分光光度计单波长双光束分光光度计单波长双光束分光光度计单波长双光束分光光度计双波长分光光度计双波长分光光度计双波长分光光度计双波长分光光度计结构：结构：结构：结构：光度计部件光度计部件光度计部件光度计部件基本组成基本组成：五个单元组成：五个单元组成0.575光源光源光源光源单色器单色器单色器单色器吸收池吸收池吸收池吸收池检测器检测器检测器检测器显示显示显示显示 1.1.1.1.光源光源光源光源 在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。命。命。命。可见光区：钨灯作为可见光区：钨灯作为可见光区：钨灯作为可见光区：钨灯作为光源，其辐射波长范围在光源，其辐射波长范围在光源，其辐射波长范围在光源，其辐射波长范围在3203202500 nm2500 nm。紫外区：氢灯、氘灯。紫外区：氢灯、氘灯。紫外区：氢灯、氘灯。紫外区：氢灯、氘灯。发射发射发射发射185185400 nm400 nm的连续的连续的连续的连续光谱。光谱。光谱。光谱。2 2.单色器单色器 将光源发射的复合光分解成单色光并可从中将光源发射的复合光分解成单色光并可从中将光源发射的复合光分解成单色光并可从中将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任意波长单色光的光学系统。选出一任意波长单色光的光学系统。选出一任意波长单色光的光学系统。选出一任意波长单色光的光学系统。入射狭缝入射狭缝准直透镜准直透镜棱镜棱镜聚焦透镜聚焦透镜出射狭缝出射狭缝白光白光红红紫紫1 12 23 3.样品室样品室 样品室放置各种类样品室放置各种类样品室放置各种类样品室放置各种类型的吸收池（比色皿）型的吸收池（比色皿）型的吸收池（比色皿）型的吸收池（比色皿）和相应的池架附件。吸和相应的池架附件。吸和相应的池架附件。吸和相应的池架附件。吸收池主要有石英池和玻收池主要有石英池和玻收池主要有石英池和玻收池主要有石英池和玻璃池两种。在紫外区测璃池两种。在紫外区测璃池两种。在紫外区测璃池两种。在紫外区测定须采用石英池，可见定须采用石英池，可见定须采用石英池，可见定须采用石英池，可见区测定一般用玻璃池。区测定一般用玻璃池。区测定一般用玻璃池。区测定一般用玻璃池。用于盛吸收试液，能透过所需光谱范围内的光线。用于盛吸收试液，能透过所需光谱范围内的光线。用于盛吸收试液，能透过所需光谱范围内的光线。用于盛吸收试液，能透过所需光谱范围内的光线。4 4.检测系统检测系统 将光强度转换成电流来进行测量。光电检测器。将光强度转换成电流来进行测量。光电检测器。将光强度转换成电流来进行测量。光电检测器。将光强度转换成电流来进行测量。光电检测器。要求：对测定波长范围内的光有快速、灵敏的响应，要求：对测定波长范围内的光有快速、灵敏的响应，要求：对测定波长范围内的光有快速、灵敏的响应，要求：对测定波长范围内的光有快速、灵敏的响应，产生的光电流应与照射于检测器上的光强度成正比。产生的光电流应与照射于检测器上的光强度成正比。产生的光电流应与照射于检测器上的光强度成正比。产生的光电流应与照射于检测器上的光强度成正比。一般的分光光度计常采用光电管作检测器。一般的分光光度计常采用光电管作检测器。一般的分光光度计常采用光电管作检测器。一般的分光光度计常采用光电管作检测器。硒光电池硒光电池9.3 9.3 显色反应与条件的选择显色反应与条件的选择显色反应和显色剂显色反应和显色剂显色反应和显色剂显色反应和显色剂在分光光度分析中，利用显色反应把待测组分在分光光度分析中，利用显色反应把待测组分在分光光度分析中，利用显色反应把待测组分在分光光度分析中，利用显色反应把待测组分X X X X 转变为有色化合物，然后再进行测定。转变为有色化合物，然后再进行测定。转变为有色化合物，然后再进行测定。转变为有色化合物，然后再进行测定。使试样中的被测组分与化学试剂作用生成有色化使试样中的被测组分与化学试剂作用生成有色化使试样中的被测组分与化学试剂作用生成有色化使试样中的被测组分与化学试剂作用生成有色化合物的反应叫合物的反应叫合物的反应叫合物的反应叫显色反应显色反应显色反应显色反应。mXmX（待测物）待测物）待测物）待测物）nRnR（显色剂显色剂显色剂显色剂）X XmmR Rn n （有色化合物）（有色化合物）（有色化合物）（有色化合物）9.3.19.3.1 显色反应的选择显色反应的选择 对显色反应的要求对显色反应的要求对显色反应的要求对显色反应的要求 (1)(1)(1)(1)灵敏度高，选择灵敏度高，选择灵敏度高，选择灵敏度高，选择较大较大较大较大(10(104 410105 5)的显色反应。的显色反应。的显色反应。的显色反应。避免共存组分干扰。避免共存组分干扰。避免共存组分干扰。避免共存组分干扰。(2)(2)(2)(2)选择性好，显色剂只与被测组分反应。选择性好，显色剂只与被测组分反应。选择性好，显色剂只与被测组分反应。选择性好，显色剂只与被测组分反应。(3)(3)(3)(3)显色剂在测定波长处无明显吸收显色剂在测定波长处无明显吸收显色剂在测定波长处无明显吸收显色剂在测定波长处无明显吸收 (4)(4)(4)(4)有色物组成固定，如：有色物组成固定，如：有色物组成固定，如：有色物组成固定，如：FeFe3+3+磺基水杨酸磺基水杨酸磺基水杨酸磺基水杨酸 三磺基水杨酸铁三磺基水杨酸铁三磺基水杨酸铁三磺基水杨酸铁(黄色黄色黄色黄色)（组成固定）（组成固定）（组成固定）（组成固定）FeFe3+3+SCN+SCN-FeSCN FeSCN2+2+、Fe(SCN)Fe(SCN)2 2+（组组组组成不固定）成不固定）成不固定）成不固定）(5)(5)有色物稳定性高，其它离子干扰才小。有色物稳定性高，其它离子干扰才小。(6)(6)显色过程易于控制，而且有色化合物与显色过程易于控制，而且有色化合物与 显色剂之间的颜色差别应尽可能大。显色剂之间的颜色差别应尽可能大。两种有色物质最大吸收波长之差：两种有色物质最大吸收波长之差：“对比度对比度”9.3.2 显色条件的选择显色条件的选择(1)(1)显色剂用量，显色剂用量，适当过量适当过量。吸光光度法是测定吸光光度法是测定吸光光度法是测定吸光光度法是测定显色反应达到平衡后显色反应达到平衡后显色反应达到平衡后显色反应达到平衡后溶液的溶液的溶液的溶液的吸光度，要能得到准确的测试结果，要使显色吸光度，要能得到准确的测试结果，要使显色吸光度，要能得到准确的测试结果，要使显色吸光度，要能得到准确的测试结果，要使显色反应完全和稳定反应完全和稳定反应完全和稳定反应完全和稳定吸光度吸光度A与显色剂用量与显色剂用量cR的关系会出现如图所示的的关系会出现如图所示的几种情况。选择曲线变化平坦处。几种情况。选择曲线变化平坦处。c(R)A（a a）a ab b显色剂浓度显色剂浓度显色剂浓度显色剂浓度C(R)C(R)：1.1.在在在在0 0a a范围内，显色剂用量不足，待测离子没有范围内，显色剂用量不足，待测离子没有范围内，显色剂用量不足，待测离子没有范围内，显色剂用量不足，待测离子没有完全转变成有色配合物完全转变成有色配合物完全转变成有色配合物完全转变成有色配合物 ，C(R)C(R)，AA；2.2.在在在在a ab b范围内，范围内，范围内，范围内，A A出现稳定值。出现稳定值。出现稳定值。出现稳定值。c(R)A（b b）a a b b 浅红浅红浅红浅红橙红橙红橙红橙红浅红浅红浅红浅红（b b）曲线：）曲线：）曲线：）曲线：例例例例（c c）曲线：例）曲线：例）曲线：例）曲线：例n n1 1，2 2，3 3，6 6c(R)A（c c）(2)(2)溶液溶液酸度酸度，既要防止被测离子生成沉淀，又需防，既要防止被测离子生成沉淀，又需防 止有色配合物离解。止有色配合物离解。在在pH23 Fe(ssal)+在在pH47 Fe(ssal)22-在在pH810 Fe(ssal)3在在pH12 Fe(OH)3棕橙色棕橙色 沉淀沉淀黄色黄色紫红色紫红色(3)(3)(3)(3)显色温度：显色温度：显色温度：显色温度：一般在室温下测定，有的反应需加热，以加速显色一般在室温下测定，有的反应需加热，以加速显色一般在室温下测定，有的反应需加热，以加速显色一般在室温下测定，有的反应需加热，以加速显色反应进行完全，有的有色化合物在温度偏高时又易分解反应进行完全，有的有色化合物在温度偏高时又易分解反应进行完全，有的有色化合物在温度偏高时又易分解反应进行完全，有的有色化合物在温度偏高时又易分解，不同的反应，不同的反应，不同的反应，不同的反应通过实验通过实验通过实验通过实验找出适宜的温度范围。找出适宜的温度范围。找出适宜的温度范围。找出适宜的温度范围。(4)(4)(4)(4)显色时间：显色时间：显色时间：显色时间：多数显色反应需一定时间才能完成。在颜色稳多数显色反应需一定时间才能完成。在颜色稳多数显色反应需一定时间才能完成。在颜色稳多数显色反应需一定时间才能完成。在颜色稳定的时间范围内进行比色测定。必须经实验，作出定的时间范围内进行比色测定。必须经实验，作出定的时间范围内进行比色测定。必须经实验，作出定的时间范围内进行比色测定。必须经实验，作出一定温度下的一定温度下的一定温度下的一定温度下的A-tA-tA-tA-t关系曲线，求出适合的时间。关系曲线，求出适合的时间。关系曲线，求出适合的时间。关系曲线，求出适合的时间。(5)(5)(5)(5)溶剂溶剂溶剂溶剂（6 6）干扰的消除干扰的消除 光度分析中，共存离子如本身有颜色，或与显色光度分析中，共存离子如本身有颜色，或与显色光度分析中，共存离子如本身有颜色，或与显色光度分析中，共存离子如本身有颜色，或与显色剂作用生成有色化合物，都会干扰测定。剂作用生成有色化合物，都会干扰测定。剂作用生成有色化合物，都会干扰测定。剂作用生成有色化合物，都会干扰测定。1 1 1 1）加入配位掩蔽剂或氧化还原掩蔽剂加入配位掩蔽剂或氧化还原掩蔽剂加入配位掩蔽剂或氧化还原掩蔽剂加入配位掩蔽剂或氧化还原掩蔽剂 使干扰离子生成无色配合物或无色离子使干扰离子生成无色配合物或无色离子使干扰离子生成无色配合物或无色离子使干扰离子生成无色配合物或无色离子如用如用如用如用SCNSCNSCNSCN-测定测定测定测定CoCoCoCo2+2+2+2+时，时，时，时，FeFeFeFe3+3+3+3+有干扰，加有干扰，加有干扰，加有干扰，加 入入入入 F F F F-，FeFeFeFe3+3+3+3+6F+6F+6F+6F-=FeF=FeF=FeF=FeF6 6 6 63-3-3-3-Fe Fe Fe Fe3+3+3+3+被掩蔽。被掩蔽。被掩蔽。被掩蔽。2 2 2 2）选择适当的显色条件以避免干扰选择适当的显色条件以避免干扰选择适当的显色条件以避免干扰选择适当的显色条件以避免干扰 用磺基水杨酸测定用磺基水杨酸测定用磺基水杨酸测定用磺基水杨酸测定FeFeFeFe3+3+3+3+离子时离子时离子时离子时,Cu,Cu,Cu,Cu2+2+2+2+与试剂形成与试剂形成与试剂形成与试剂形成黄色络合物黄色络合物黄色络合物黄色络合物,干扰测定，但如控制干扰测定，但如控制干扰测定，但如控制干扰测定，但如控制pHpHpHpH在在在在2.52.52.52.5左右，左右，左右，左右，CuCuCuCu2+2+2+2+则不与试剂磺基水杨酸反应。则不与试剂磺基水杨酸反应。则不与试剂磺基水杨酸反应。则不与试剂磺基水杨酸反应。3 3 3 3）分离干扰离子分离干扰离子分离干扰离子分离干扰离子 用萃取、沉淀、电解、离子交换等方法除去用萃取、沉淀、电解、离子交换等方法除去用萃取、沉淀、电解、离子交换等方法除去用萃取、沉淀、电解、离子交换等方法除去干扰离子。干扰离子。干扰离子。干扰离子。4 4）选择适当的光度测量条件选择适当的光度测量条件选择适当的光度测量条件选择适当的光度测量条件选择适当的测定波长选择适当的测定波长515655415500钍-偶氮砷III 钴-亚硝基红盐 AA络合物络合物络合物络合物试剂试剂试剂试剂9.3.3 9.3.3 9.3.3 9.3.3 显色剂显色剂显色剂显色剂无机显色剂与金属离子生成的化合物不够稳定，无机显色剂与金属离子生成的化合物不够稳定，无机显色剂与金属离子生成的化合物不够稳定，无机显色剂与金属离子生成的化合物不够稳定，灵敏度和选择性也不高。灵敏度和选择性也不高。灵敏度和选择性也不高。灵敏度和选择性也不高。多数有机显色剂与金属离子生成极其稳定的螯合多数有机显色剂与金属离子生成极其稳定的螯合多数有机显色剂与金属离子生成极其稳定的螯合多数有机显色剂与金属离子生成极其稳定的螯合物，显色反应灵敏度和选择性都比较高，广泛应物，显色反应灵敏度和选择性都比较高，广泛应物，显色反应灵敏度和选择性都比较高，广泛应物，显色反应灵敏度和选择性都比较高，广泛应用于吸光光度分析中。用于吸光光度分析中。用于吸光光度分析中。用于吸光光度分析中。有机显色剂有机显色剂 CH3CCCH3 HON NOH NNOHCOOHSO3HOO型：型：NNNOH OHON型型：PARNH NHNSNS型型：双硫腙双硫腙NN型：型：丁二丁二酮肟酮肟邻二邻二氮菲氮菲磺基水杨酸磺基水杨酸偶氮类显色剂：性质稳定、显色反应灵敏度高、选择偶氮类显色剂：性质稳定、显色反应灵敏度高、选择偶氮类显色剂：性质稳定、显色反应灵敏度高、选择偶氮类显色剂：性质稳定、显色反应灵敏度高、选择 性好、对比度大，应用最广泛。偶氮性好、对比度大，应用最广泛。偶氮性好、对比度大，应用最广泛。偶氮性好、对比度大，应用最广泛。偶氮 胂胂胂胂IIIIII、PARPAR等。等。等。等。三苯甲烷类：铬天青三苯甲烷类：铬天青三苯甲烷类：铬天青三苯甲烷类：铬天青S S、二甲酚橙等、二甲酚橙等、二甲酚橙等、二甲酚橙等9.3.3 9.3.3 三元配合物在光度分析中的应用特性简介三元配合物在光度分析中的应用特性简介 由由由由一一一一种种种种金金金金属属属属离离离离子子子子同同同同时时时时与与与与两两两两种种种种不不不不同同同同的的的的配配配配位位位位体体体体形形形形成成成成的的的的三元配合物具有下列分析特性：三元配合物具有下列分析特性：三元配合物具有下列分析特性：三元配合物具有下列分析特性：1 1 1 1.稳定，可提高分析测定的准确度和重现性稳定，可提高分析测定的准确度和重现性稳定，可提高分析测定的准确度和重现性稳定，可提高分析测定的准确度和重现性 例例例例:Ti-EDTA-HTi-EDTA-H2 2OO2 2三元配合物的稳定性，比三元配合物的稳定性，比三元配合物的稳定性，比三元配合物的稳定性，比Ti-Ti-EDTA EDTA和和和和Ti-HTi-H2 2OO2 2二元配合物的稳定性，分别增二元配合物的稳定性，分别增二元配合物的稳定性，分别增二元配合物的稳定性，分别增 强约强约强约强约1000100010001000倍和倍和倍和倍和100100100100倍。倍。倍。倍。2 2 2 2.比二元配合物具有更高的灵敏度和更大的对比度比二元配合物具有更高的灵敏度和更大的对比度比二元配合物具有更高的灵敏度和更大的对比度比二元配合物具有更高的灵敏度和更大的对比度 灵敏度通常可提高灵敏度通常可提高灵敏度通常可提高灵敏度通常可提高1 1 1 1 2 2 2 2倍，有时甚至提高倍，有时甚至提高倍，有时甚至提高倍，有时甚至提高5 5 5 5倍以上。倍以上。倍以上。倍以上。3.3.3.3.比二元体系具有更高的选择性，比二元体系具有更高的选择性，比二元体系具有更高的选择性，比二元体系具有更高的选择性，减少了金属离子形减少了金属离子形减少了金属离子形减少了金属离子形 成类似配合物的可能性。成类似配合物的可能性。成类似配合物的可能性。成类似配合物的可能性。9.4 9.4 吸光度测量条件的选择吸光度测量条件的选择9.4.1 选择适当的入射波长选择适当的入射波长选择适当的入射波长选择适当的入射波长 一般选择一般选择一般选择一般选择 maxmax为入射光波长。为入射光波长。为入射光波长。为入射光波长。若若若若 maxmax 处有共存组分干扰时，则处有共存组分干扰时，则处有共存组分干扰时，则处有共存组分干扰时，则应考虑选择灵敏度稍低但能避免干应考虑选择灵敏度稍低但能避免干应考虑选择灵敏度稍低但能避免干应考虑选择灵敏度稍低但能避免干扰的入射光波长扰的入射光波长扰的入射光波长扰的入射光波长。如如如如图图图图选选选选500nm500nm波波波波长长长长测测测测定定定定，灵灵灵灵敏敏敏敏度度度度虽虽虽虽有有有有所所所所下下下下降降降降，却却却却消消消消除除除除了了了了干干干干扰扰扰扰，提提提提高了测定的准确度和选择性。高了测定的准确度和选择性。高了测定的准确度和选择性。高了测定的准确度和选择性。实际上就是以通过比色皿的光强度作为样品池的实际上就是以通过比色皿的光强度作为样品池的入射光强度。入射光强度。9.4.2 参比溶液的选择参比溶液的选择重重重重 点点点点 选择参比溶液所遵循的一般原则：选择参比溶液所遵循的一般原则：选择参比溶液所遵循的一般原则：选择参比溶液所遵循的一般原则：若仅待测组分与显色剂反应产物在测定波长处有吸若仅待测组分与显色剂反应产物在测定波长处有吸若仅待测组分与显色剂反应产物在测定波长处有吸若仅待测组分与显色剂反应产物在测定波长处有吸 收，其他所加试剂均无吸收，收，其他所加试剂均无吸收，收，其他所加试剂均无吸收，收，其他所加试剂均无吸收，用纯溶剂（水用纯溶剂（水用纯溶剂（水用纯溶剂（水)作参作参作参作参 比溶液；比溶液；比溶液；比溶液；若显色剂或其他所加试剂在测定波长处略有吸收若显色剂或其他所加试剂在测定波长处略有吸收若显色剂或其他所加试剂在测定波长处略有吸收若显色剂或其他所加试剂在测定波长处略有吸收,而试液本身无吸收，而试液本身无吸收，而试液本身无吸收，而试液本身无吸收，用用用用“试剂空白试剂空白试剂空白试剂空白”(不加试样溶不加试样溶不加试样溶不加试样溶液液液液)作参比溶液；作参比溶液；作参比溶液；作参比溶液；若待测试液在测定波长处有吸收，而显色剂等无吸若待测试液在测定波长处有吸收，而显色剂等无吸若待测试液在测定波长处有吸收，而显色剂等无吸若待测试液在测定波长处有吸收，而显色剂等无吸 收，收，收，收，则可用则可用则可用则可用“试样空白试样空白试样空白试样空白”(不加显色剂不加显色剂不加显色剂不加显色剂)作参比溶液；作参比溶液；作参比溶液；作参比溶液；若显色剂、试液中其他组分在测量波长处有吸收若显色剂、试液中其他组分在测量波长处有吸收若显色剂、试液中其他组分在测量波长处有吸收若显色剂、试液中其他组分在测量波长处有吸收,则可在试液中加入适当掩蔽剂将待测组分掩蔽后再则可在试液中加入适当掩蔽剂将待测组分掩蔽后再则可在试液中加入适当掩蔽剂将待测组分掩蔽后再则可在试液中加入适当掩蔽剂将待测组分掩蔽后再 加显色剂，作为参比溶液。加显色剂，作为参比溶液。加显色剂，作为参比溶液。加显色剂，作为参比溶液。光度分析的误差来源于两方面：一方面是各种光度分析的误差来源于两方面：一方面是各种化学因素化学因素引入的误差；另一方面是引入的误差；另一方面是仪器测量不仪器测量不准准引入的误差。对于化学因素，前面巳经讲过，引入的误差。对于化学因素，前面巳经讲过，现在我们来看仪器测量不准引入的误差。现在我们来看仪器测量不准引入的误差。9.4.3 9.4.3 吸光度读数范围的选择吸光度读数范围的选择l一仪器测量误差：一仪器测量误差：l任任何何光光度度计计都都有有一一定定的的测测量量误误差差，测测量量误误差差的的来来源源主主要要是是光光源源的的发发光光强强度度不不稳稳定定，光光电电效效应应的的非非线线性性，电电位位计计的的非非线线性性，杂杂散散光光的的影影响响，单色器的光不纯等等因素，单色器的光不纯等等因素，l对于一台固定的光度计来说，以上因素都是固对于一台固定的光度计来说，以上因素都是固定的，也就是说，它的定的，也就是说，它的误差具有一定的稳定性误差具有一定的稳定性。其大小可由光度计的透光度的读数准确度表现其大小可由光度计的透光度的读数准确度表现出来。出来。具体说来，对于一个给定的光度计来说，其透具体说来，对于一个给定的光度计来说，其透光度的读数误差等于常数光度的读数误差等于常数T T，约为约为0.2%0.2%2%2%。但透光度的读数误差不能代表测定结果的误差。但透光度的读数误差不能代表测定结果的误差。测量结果的误差常用浓度的相对误差测量结果的误差常用浓度的相对误差C/CC/C表表示（示（C C表示测量结果的浓度的绝对误差）。表示测量结果的浓度的绝对误差）。它的大小是与它的大小是与T T的大小有关的。的大小有关的。而同样大小的而同样大小的T T在溶液浓度不同，所引起的在溶液浓度不同，所引起的浓度相对误差是不同的。浓度相对误差是不同的。二二.准确度准确度仪器测量误仪器测量误差差光度计的读数误光度计的读数误差一般为差一般为0.22(T),由于由于T与浓度与浓度c不是线性关系，不是线性关系，故不同浓度时故不同浓度时的的T引起的引起的误差不同。误差不同。100806040200T%c1 c2 c3 T T T-透光率读数误差透光率读数误差 c c1c1 c2c2 c3c3 lglgT T =bcbc微分微分微分微分:dlgdlgT T 0.434dln0.434dlnT T=0.4340.434T T-1-1 d dT T =b b d dc c是否存在最佳读数范围？何值时误差最小？是否存在最佳读数范围？何值时误差最小？c/c不仅与仪器的透光度误差不仅与仪器的透光度误差T 有关，而且与其透有关，而且与其透光度读数光度读数T 的值也有关。的值也有关。重重重重 点点点点吸光定律吸光定律根据误差传递公式，有根据误差传递公式，有 又又得得浓度测量的浓度测量的相对偏差相对偏差得得T=0.368=36.8%A=0.434 此时，此时，仪器测量误差最小仪器测量误差最小重重重重 点点点点A=A=lglgT T =bcbc最佳读数范围与最佳值最佳读数范围与最佳值:设：设：设：设：T T=1%=1%，c c/c c T T 关系曲线关系曲线关系曲线关系曲线T T 在在在在 20%20%65%65%之间时之间时之间时之间时,浓度浓度浓度浓度相对误差较小，相对误差较小，相对误差较小，相对误差较小，最佳读数范围最佳读数范围最佳读数范围最佳读数范围浓度相对误差最小时的浓度相对误差最小时的浓度相对误差最小时的浓度相对误差最小时的T Tminmin为为为为：T Tminmin 36.8%,36.8%,A Aminmin 0.4340.434普通分光光度法不适于高含量或极低含量物质的测定普通分光光度法不适于高含量或极低含量物质的测定普通分光光度法不适于高含量或极低含量物质的测定普通分光光度法不适于高含量或极低含量物质的测定提高光度测定的灵敏度和选择性的途径提高光度测定的灵敏度和选择性的途径合成性的灵敏度高的显色剂合成性的灵敏度高的显色剂采用分离富集和测定相结合采用分离富集和测定相结合 采用三元（多元）配合物显色体系采用三元（多元）配合物显色体系 9.5 吸光光度法的应用吸光光度法的应用1.单一组分测定单一组分测定1)金属离子金属离子:Fe-phen,Ni-丁二酮肟丁二酮肟,Co-钴试剂钴试剂2)磷的测定磷的测定:DNA中含中含P9.2%,RNA中含中含P9.5%,可得核酸量可得核酸量.H3PO4+12(NH4)2MoO4+21HNO3=(NH4)3PO412MoO3+12NH4NO3+12H2O磷钼磷钼黄黄(小小)磷磷钼钼(V)蓝蓝(大大)Sn2+3)蛋白质测定蛋白质测定溴甲酚绿、考马司亮蓝等溴甲酚绿、考马司亮蓝等4)氨基酸测定氨基酸测定茚三酮茚三酮(紫色化合物紫色化合物)5)水质检测水质检测:NH4+、NO2-、Mn2+、Fe2+、SO42-、Hg2+-6)药物含量测定药物含量测定比吸光系数定量；荷移比吸光系数定量；荷移光谱法测定光谱法测定.7)紫外吸收紫外吸收(UV):NO2-、NO3-、SO42-、SO32-、CO32-、SCN-、酪氨酸、色氨酸、酪氨酸、色氨