基因重组端粒与端粒酶.ppt

端粒与端粒酶端粒与端粒酶陈莉陈莉南通大学基础医学院南通大学基础医学院早在早在30年代，两名遗传学家年代，两名遗传学家Muller和和Mcclintock分别在不同的实验室用不同的生物做实分别在不同的实验室用不同的生物做实验发现染色体末端结构对保持染色体的稳定十分重验发现染色体末端结构对保持染色体的稳定十分重要，要，Muller将这一结构命名为将这一结构命名为端粒（端粒（telomere）。直到直到1985年年Greider等从四膜虫中真正证实了端粒的等从四膜虫中真正证实了端粒的结构为极简单的结构为极简单的6个核苷酸个核苷酸TTAGGG序列的多次重序列的多次重复后发现了复后发现了端粒酶端粒酶(telomeraseTRAP-eze)。端粒与端粒酶是当今生物学研究的热点。端粒与端粒酶是当今生物学研究的热点。端粒是位于真核细胞染色体末端的核酸蛋白端粒是位于真核细胞染色体末端的核酸蛋白复合体复合体,其功能在于维持染色体的稳定性和完整性。其功能在于维持染色体的稳定性和完整性。端粒酶是一种核酸核蛋白酶端粒酶是一种核酸核蛋白酶,能以自身的能以自身的RNA为模板合成端粒的重复序列为模板合成端粒的重复序列,以维持端粒长度的稳以维持端粒长度的稳定性。定性。许多研究表明许多研究表明,端粒、端粒酶的功能失调将影端粒、端粒酶的功能失调将影响细胞的生物学行为，包括细胞周期的稳定性、细响细胞的生物学行为，包括细胞周期的稳定性、细胞增殖、癌变、凋亡、衰老。胞增殖、癌变、凋亡、衰老。第一节第一节端粒与端粒酶端粒与端粒酶一、端粒的结构与功能一、端粒的结构与功能1972年年JamesWatson提出了提出了“复制末端问题复制末端问题”，复制，复制DNA的的DNA多聚酶并不能将线性染色体多聚酶并不能将线性染色体末端的末端的DNA完全复制。也就是说在线性完全复制。也就是说在线性DNA复制复制时，时，DNA多聚酶留下染色体末端一段多聚酶留下染色体末端一段DNA（一段一段端粒）不复制。端粒）不复制。端粒端粒DNA复制的特点是在每次复制的特点是在每次DNA复制中，复制中，每条染色体的每条染色体的3端均有一段端均有一段DNA无法得到复制，无法得到复制，随着细胞每次分裂，染色体随着细胞每次分裂，染色体3一末端将持续丧失一末端将持续丧失50-200bp的的DNA，因而细胞分裂具有一定的限度，因而细胞分裂具有一定的限度，即分裂寿命。所以端粒的长度可作为细胞的即分裂寿命。所以端粒的长度可作为细胞的“分分裂时钟裂时钟”，反映细胞分裂能力。，反映细胞分裂能力。真核细胞染色体末端会随着细胞分裂而缩短，真核细胞染色体末端会随着细胞分裂而缩短，这个缩短的端粒再传给子细胞后，随细胞的再次分这个缩短的端粒再传给子细胞后，随细胞的再次分裂进一步缩短。随着每次细胞分裂，染色体末端逐裂进一步缩短。随着每次细胞分裂，染色体末端逐渐缩短，直至细胞衰老。人类体细胞遵循这个规则渐缩短，直至细胞衰老。人类体细胞遵循这个规则从细胞出生到衰老，单细胞生物遵循这个规则分裂从细胞出生到衰老，单细胞生物遵循这个规则分裂后定有其它机制保持单细胞生物传代存活，生殖细后定有其它机制保持单细胞生物传代存活，生殖细胞亦如此。胞亦如此。端粒端粒：是真核细胞线性染色体末端特殊结构。是真核细胞线性染色体末端特殊结构。由端粒由端粒DNA和端粒相关蛋白组成。和端粒相关蛋白组成。端粒端粒DNA：为不含功能基因的简单、高度重复序列为不含功能基因的简单、高度重复序列,在生物进化过程中具有高度保守性。在生物进化过程中具有高度保守性。不同物种的端粒不同物种的端粒DNA序列存在差异序列存在差异。人类及其它脊椎动物染色体端粒的结构是5TTAGGG3的重复序列,长约15kb。体细胞的端粒有限长度（telomererestrictionfragmentsTRFS）大多数明显短于生殖细胞，青年人的TRFs又显著长于年长者，提示TRFs随着细胞分裂或衰老，在不断变短，主要是由于DNA聚合酶不能完成复制成线性DNA末端所致。端端粒粒DNA由由两两条条互互相相配配对对的的DNA单单链链组组成成,其其双双链链部部分分通通过过与与端端粒粒结结合合蛋蛋白白质质TRF1和和TRF2结结合合共共同同组组成成t环环(tloops)。这这种种t环环特特殊殊结结构构可可维维持持染染色色体体末末端端的的稳稳定定,保保持持染染色色体体及及其其内内部部基基因因的的完完整整性性,从从而而使使遗遗传传物物质质得得以以完完整整复复制制。缺缺少少端端粒粒的的染染色色体体不能稳定存在。不能稳定存在。端端粒粒DNA与与结结构构蛋蛋白白形形成成的的复复合合物物如如同同染染色色体体的的一一顶顶“帽帽子子”，它它既既可可保保护护染染色色体体不不被被降降解解，又又避避免免了了端端粒粒对对端端融融合合（end-endfusion）以以及及染染色色体体的的丧丧失失，同同时时端端粒粒能能帮帮助助细细胞胞识识别别完完整整染染色色体体和和受受损损染染色色体体。在在生生理理情情况况下下，端端粒粒作作为为细细胞胞“分分裂裂时时钟钟”能缩短，最终导致细胞脱离细胞周期。能缩短，最终导致细胞脱离细胞周期。二、端粒酶的结构与功能二、端粒酶的结构与功能 在在端端粒粒被被发发现现以以前前，人人们们就就推推测测生生殖殖细细胞胞之之所所以以能能世世代代相相传传，其其中中可可能能存存在在一一种种维维持持端端粒粒长长度度的的特特殊殊机机制制，体体细细胞胞可可能能正正是是由由于于缺缺乏乏这这种种机机制制，它它的的染染色色体体末末端端才才面面临临着着致致死死性性缺缺失失（deletion）的的危危险险。因因 此此 在在 正正 常常 人人 体体 细细 胞胞 间间 永永 生生 化化 细细 胞胞（immortalizedcells）及及肿肿瘤瘤细细胞胞的的转转化化过过程程中中可可能能也也存存在在着着与与生生殖殖细细胞胞类类似似的的机机制制。这这些些细细胞胞怎怎样样保保持持细细胞胞具具有有继继续续分分裂裂或或长长期期分分裂裂的的能能力力呢呢？科科学学家家们们发发现现端端粒粒确确实实随随着着每每次次分分裂裂而而缩缩短短，但但也也会会被被新新合合成成的的端端粒粒片片断断再再延延长长。科科学学家家们们怀怀疑疑，可可能能尚尚有有末末被被发发现现的的酶酶，该该酶酶具具有有标标准准的的DNA多多聚聚酶酶所所不不具具备备的的功功能能，能能使使已已缩缩短短的的端端粒粒延延长长，使使科科学学家家们们兴兴奋奋的的是是到到1984年年首首先先在在四四膜膜虫虫中中证证实实了了这这种种能能使使端粒延长的酶端粒延长的酶端粒酶的存在。端粒酶的存在。端粒酶的结构端粒酶的结构 端粒酶在结构上为一核糖核蛋白复合体端粒酶在结构上为一核糖核蛋白复合体,由由RNA RNA 和结合的蛋白质组成和结合的蛋白质组成,是是RNARNA依赖的依赖的DNA DNA 聚合酶。它是聚合酶。它是一种特殊的能合成端粒一种特殊的能合成端粒DNADNA的酶的酶,通过明显的模板依赖通过明显的模板依赖方式每次添加一个核苷酸。方式每次添加一个核苷酸。端粒酶实质上是一种特殊的逆转录酶端粒酶实质上是一种特殊的逆转录酶 端粒酶端粒酶RNA(hTR)RNA(hTR)端粒酶逆转录酶（端粒酶逆转录酶（TERTTERT）端粒酶结合蛋白端粒酶结合蛋白（TEP）端粒酶端粒酶RNA(hTR)RNA(hTR)端粒酶逆转录酶端粒酶逆转录酶（TERTTERT）端粒酶结合蛋白端粒酶结合蛋白（TEP）端粒酶端粒酶RNARNA是第一个被克隆的端粒酶是第一个被克隆的端粒酶组分。组分。端粒酶端粒酶RNARNA含有与同源端粒含有与同源端粒DNADNA序列序列TTAGGGTTAGGG的互补序列的互补序列,核糖核酸酶核糖核酸酶H H切割此模板区切割此模板区,能使体外消除端粒酶能使体外消除端粒酶延长端粒的功能。延长端粒的功能。人人类类TERTTERT（hTERThTERT）基因基因为为一一单单拷拷贝贝基因基因,定位于定位于5 5p15.33,p15.33,具有具有7 7个保守序列个保守序列结结构域构域单单元和端粒元和端粒酶酶特异性特异性结结构域构域单单元元T T。破坏破坏TERT TERT 将消除端粒将消除端粒酶酶活性并致端粒活性并致端粒缩缩短。短。TEP1TEP1、生存生存动动力神力神经细经细胞基因胞基因(SMN)SMN)产产物物、hsp90hsp90、PinX1PinX1、Est1p Est1p 和和Est3pEst3p 1 1、端粒、端粒酶酶RNA(hTERT)RNA(hTERT)哺乳动物端粒酶哺乳动物端粒酶RNAs(hTRRNAs(hTR和和mTR)mTR)在许多组织的不在许多组织的不同发育阶段同发育阶段,甚至那些没有端粒酶活性的组织中广泛甚至那些没有端粒酶活性的组织中广泛表达。表达。体内端粒酶体内端粒酶RNA RNA 的存在对端粒酶功能至关重要，的存在对端粒酶功能至关重要，影响到端粒酶影响到端粒酶RNA RNA 的稳定性与突变的稳定性与突变,也可改变体内端也可改变体内端粒长度，并可通过改变端粒完整性或端粒结合因子的粒长度，并可通过改变端粒完整性或端粒结合因子的末端结合位点致细胞核分裂后期细胞死亡末端结合位点致细胞核分裂后期细胞死亡 。端粒酶RNA转录模板远端区远端区参与和底物的结合。近端区近端区能添加特定的核苷酸,对底物识别并不重要。模板边界区模板边界区与端粒酶催化亚基TERT结合,也与端粒酶相关因子Est1p和Ku 结合。2 2、端粒酶逆转录酶、端粒酶逆转录酶(Telomerase reverse Telomerase reverse transcriptase,TERT)transcriptase,TERT)几乎所有存在端粒几乎所有存在端粒酶酶的机体均含有一的机体均含有一单单独的独的TERT TERT 基因基因,哺乳哺乳动动物物TERT TERT 的的转录转录由由许许多多转录转录因因子、激素和子、激素和细细胞外信号胞外信号严严格控制格控制。不同的不同的转录转录因因子子调节调节hTERThTERT在不同的在不同的细细胞内含物中的表达。癌基胞内含物中的表达。癌基因因c-mycc-myc是一个受特殊信号是一个受特殊信号调节调节的可的可诱导诱导癌基因癌基因,并可与并可与H HRasRas、N NRasRas、多瘤病毒多瘤病毒MTMT、LT LT 等癌基等癌基因因协协同作用同作用,促促进细进细胞无限增殖胞无限增殖,获获得永生化并得永生化并发发生癌生癌变变。c-myc c-myc 与与hTERThTERT FujimotoFujimoto等用等用c-myc c-myc 反反义义寡核甘酸寡核甘酸转转染白血病染白血病细细胞胞后后,这这些些细细胞胞中中端粒端粒酶酶活性均能被下活性均能被下调调,而而c-c-myc myc 正正义义寡核甘酸无此作用。寡核甘酸无此作用。WangWang等研究等研究发现发现c-mycc-myc在正常人乳腺上皮在正常人乳腺上皮细细胞和胞和二二倍体成倍体成纤维细纤维细胞中胞中诱导诱导端粒端粒酶酶活性活性,并能延并能延长长这些这些细胞细胞的寿命。因此的寿命。因此认为认为癌基因癌基因c-mycc-myc为为一重要的端粒一重要的端粒酶酶激活激活剂剂。存在于存在于hTERThTERT核心启核心启动动子中有两个重要的子中有两个重要的c-myc c-myc 结结合位点合位点(CACGTG,CACGTG,亦被称亦被称为为E E 盒盒)。c-myc c-myc 诱导诱导的的hTERT hTERT 表达起始速度快表达起始速度快,不受不受细细胞增殖或胞增殖或额额外的蛋白外的蛋白合成的影响合成的影响,与与c-myc c-myc 引起的直接的引起的直接的转录转录激活一致。激活一致。但癌基因但癌基因c-myc c-myc 不是唯一与不是唯一与hTERThTERT基因基因调节调节有关的有关的转转录录因子。因子。近期研究表明近期研究表明,Sp1 Sp1 协协同同c-myc c-myc 激活激活hTERThTERT的的转录转录,可可能能还还有其他因子有其他因子,如如Bcl-2 Bcl-2 抗凋亡基因、抗凋亡基因、E6HPVE6HPV16 16 型蛋型蛋白白，以及以及经过经过一些一些蛋白激蛋白激酶酶的磷酸化使的磷酸化使hTERT hTERT 上上调调。但。但在在诸诸多不同多不同类类型的瘤型的瘤细细胞中胞中,致致hTERThTERT上上调调的基本激活的基本激活剂剂是是c-mycc-myc。TERT TERT内的内的N-N-残基残基对对多种功能是重要的多种功能是重要的,包括与端粒包括与端粒酶酶RNARNA结结合、端粒合、端粒酶酶RNA RNA 装配和催化作用、与装配和催化作用、与p53 p53 的相的相互作用和互作用和细细胞永生化。胞永生化。TERT TERT的的C-C-残基也在人残基也在人类类原始原始纤维纤维母母细细胞的永生化、胞的永生化、端粒端粒组组装的装的竞竞争、核仁内定位、引物争、核仁内定位、引物结结合和合和渐进渐进性延性延长长等方面起重要作用。等方面起重要作用。3、端粒酶相关蛋白、端粒酶相关蛋白(TEP)端粒酶相关蛋白-1(TEP1)是一多功能的RNA 结合蛋白，TEP1 缺失导致rRNA 水平的显著降低以及TEP1 和rRNA 的丢失,但不导致端粒酶活性或端粒长度的紊乱。生存动力神经细胞基因(SMN)产物热休克蛋白（hsp）90、其他涉及到TERT转录后修饰的蛋白包括磷酸酶-A、Akt、cAbl、p53 和PARP。PinX1 与人TERT体外共表达时抑制人端粒酶活性。芽殖酵母蛋白Est1p 和Est3p 这两个蛋白与体内端粒酶的功能有关。Est1p 足以使端粒延长。但是,在无Est1p存在的情况下Est2p-Cdc13pDBD融合也足以维持端粒长度。端粒酶的功能端粒酶的功能 端粒酶是在染色体末端不断合成端粒序列的酶，端粒酶是在染色体末端不断合成端粒序列的酶，它可以维持端粒的长度，维持细胞增殖潜能。端粒它可以维持端粒的长度，维持细胞增殖潜能。端粒酶以自身酶以自身RNA为模板合成端粒酶重复序列，具有逆为模板合成端粒酶重复序列，具有逆转录酶活性，它的活性不依赖于转录酶活性，它的活性不依赖于DNA聚合酶，对聚合酶，对RNA酶、蛋白酶和高温均敏感。端粒酶活性表达能酶、蛋白酶和高温均敏感。端粒酶活性表达能稳定端粒的长度，抑制细胞的衰老，在生殖细胞和稳定端粒的长度，抑制细胞的衰老，在生殖细胞和干细胞中可检测到高水平的端粒酶活性。干细胞中可检测到高水平的端粒酶活性。在体内还不清楚每一次细胞分裂有多少端粒在体内还不清楚每一次细胞分裂有多少端粒DNADNA合成。体内端粒酶的延长功能是一复杂的动态过程合成。体内端粒酶的延长功能是一复杂的动态过程:受双链端粒结合蛋白包括受双链端粒结合蛋白包括RAP1(RAP1(芽殖酵母芽殖酵母)、存在、存在于于t t环的环的TRF1(TRF1(依赖于端粒酶依赖于端粒酶)和和TRF2(TRF2(不依赖于端粒不依赖于端粒酶酶)的负调控。的负调控。第二节第二节端粒端粒酶对细胞死亡和细胞永生化的影响端粒端粒酶对细胞死亡和细胞永生化的影响 “端粒端粒酶假说端粒端粒酶假说”认为端粒酶的激活与细胞永认为端粒酶的激活与细胞永生化和恶性肿瘤的发生、发展密切相关。染色体末端的生化和恶性肿瘤的发生、发展密切相关。染色体末端的端粒端粒DNADNA进行性的缩短是限制人细胞寿命的先决条件。进行性的缩短是限制人细胞寿命的先决条件。相对地相对地,端粒酶的激活端粒酶的激活,合成端粒的合成端粒的DNADNA被认为是细胞永被认为是细胞永生化和癌症发展必需的一步。目前的资料证实生化和癌症发展必需的一步。目前的资料证实,端粒酶端粒酶对长期成活的组织和长期进行有丝分裂的细胞是必需的。对长期成活的组织和长期进行有丝分裂的细胞是必需的。细胞的死亡过程分为两个阶段细胞的死亡过程分为两个阶段,当端粒缩短至一当端粒缩短至一关键性长度关键性长度2 2kb-4kb kb-4kb 时时,染色体的稳定性就会遭到破坏染色体的稳定性就会遭到破坏,细胞开始衰老进入细胞开始衰老进入M M1期（期（mortalitystage1M M1）。在）。在M1期细胞对生长因子等失去反应，产生期细胞对生长因子等失去反应，产生DNA合成蛋白抑合成蛋白抑制因子，细胞周期检查点（制因子，细胞周期检查点（cellcyclecheckpoints）发发送周期停止信号，送周期停止信号，DNA合成停止，合成停止，DNA DNA 断裂断裂,活化活化p53 p53 依赖或非依赖或非p53 p53 依赖的依赖的DNA DNA 损伤途径。并诱导细胞周期损伤途径。并诱导细胞周期依赖性激酶（依赖性激酶（CDKCDK）抑制物如抑制物如p21,p27p21,p27产生产生,导致细胞导致细胞G1G1期生长停滞期生长停滞,最终走向死亡。如果这一过程中一些癌最终走向死亡。如果这一过程中一些癌基因基因SV40T抗原、抗原、PRB,p53,p16 PRB,p53,p16 等抑癌基因失活等抑癌基因失活,丧丧失正常功能失正常功能,均能使均能使M1期的机制被抑制使细胞逃逸期的机制被抑制使细胞逃逸M1期，继续生长获得额外的增殖能力，此时端粒酶仍为期，继续生长获得额外的增殖能力，此时端粒酶仍为阴性，端粒继续缩短，经过阴性，端粒继续缩短，经过20-30次分裂后，最终到达次分裂后，最终到达M2期。细胞由于端粒过短期。细胞由于端粒过短,基因不稳定基因不稳定,绝大多数细胞绝大多数细胞死亡死亡,只有极少数细胞由于端粒酶活性的上调或重新激只有极少数细胞由于端粒酶活性的上调或重新激活活,端粒的功能得到恢复端粒的功能得到恢复,基因重获稳定基因重获稳定,使细胞超越使细胞超越M M2期期,成为永生化细胞。成为永生化细胞。端粒酶被抑制端粒酶被抑制正常人体细胞正常人体细胞端粒丢失端粒丢失M1期阻滞期阻滞SV40T抗原抗原细胞分裂停止细胞分裂停止Rb、P53与病毒蛋白结合、突变与病毒蛋白结合、突变M1M2期间隔期间隔永生化永生化双着丝粒形成双着丝粒形成M2期退化期退化染色体失稳染色体失稳端粒酶被激活端粒酶被激活细胞凋亡细胞凋亡端粒酶在人体细胞永生性转化中端粒酶在人体细胞永生性转化中第三节第三节 端粒酶细胞周期中细胞增殖、凋亡的影响端粒酶细胞周期中细胞增殖、凋亡的影响一、端粒酶对细胞周期的影响一、端粒酶对细胞周期的影响端粒酶活性与细胞周期密切相关。细胞周期所端粒酶活性与细胞周期密切相关。细胞周期所处阶段不同处阶段不同,端粒酶活性亦不同端粒酶活性亦不同,端粒酶活性与细胞端粒酶活性与细胞周期周期CDK-CKIs网络调控系统有关网络调控系统有关。实验发现永生。实验发现永生化细胞株在细胞周期各个时相都有端粒酶活性化细胞株在细胞周期各个时相都有端粒酶活性,而而静息细胞中活性降低静息细胞中活性降低,随着肿瘤细胞进入随着肿瘤细胞进入G1/S期期,端端粒酶活性逐渐升高粒酶活性逐渐升高,在复制在复制S期端粒酶活性最高期端粒酶活性最高,而而在在G2/M期端粒酶活性逐渐丧失期端粒酶活性逐渐丧失,当培养细胞处于无当培养细胞处于无血清而进入血清而进入G0期时期时,端粒酶活性不受影响。在人乳端粒酶活性不受影响。在人乳腺癌中腺癌中,端粒酶的高活性水平伴有端粒酶的高活性水平伴有cylinD或或cyclinE的高表达的高表达,某些周期蛋白可能参与端粒酶活性的调某些周期蛋白可能参与端粒酶活性的调控控。各种基因毒性或环境应激所致细胞各种基因毒性或环境应激所致细胞DNA双链双链破坏时可使野生型破坏时可使野生型p53活化活化,进而引起细胞周期停进而引起细胞周期停滞或诱导细胞凋亡滞或诱导细胞凋亡,使细胞得以避免表型恶性转化。使细胞得以避免表型恶性转化。端粒双链端粒双链DNA的破坏是否也能活化的破坏是否也能活化p53依赖的信依赖的信号传导通路呢号传导通路呢?kusumoto等在构建的端粒酶和等在构建的端粒酶和p53单或双缺陷鼠体内研究证实单或双缺陷鼠体内研究证实,端粒端粒DNA的丢失可的丢失可以诱导活化以诱导活化p53和和p21WAF1,并导致细胞周期停滞，并导致细胞周期停滞，而而p53的缺失则可促进端粒序列的丢失的缺失则可促进端粒序列的丢失,增大染色增大染色体的融合频率。端粒功能的缺失以及相继出现的体的融合频率。端粒功能的缺失以及相继出现的基因不稳定与基因不稳定与p53缺陷相协同而激活细胞恶性转化缺陷相协同而激活细胞恶性转化过程。过程。二、端粒酶对细胞增殖的影响二、端粒酶对细胞增殖的影响 曾一度认为端粒酶活性是细胞恶变或永生的标志曾一度认为端粒酶活性是细胞恶变或永生的标志,然而然而,不但在正常组织的永生化细胞不但在正常组织的永生化细胞(如造血干细胞、精如造血干细胞、精子子),),而且在非永生的、正常生理状态下增殖活跃的细而且在非永生的、正常生理状态下增殖活跃的细胞胞(如受抗原刺激的如受抗原刺激的T T及及B B淋巴细胞、口腔和食道粘膜上淋巴细胞、口腔和食道粘膜上皮、皮肤基底层角质形成细胞、宫颈上皮、小肠上皮皮、皮肤基底层角质形成细胞、宫颈上皮、小肠上皮)也可检出端粒酶活性。但也可检出端粒酶活性。但Lehner Lehner 等用定量等用定量RT-PCR RT-PCR 法在法在子宫内膜癌、增生期子宫内膜、分泌期子宫内膜及萎缩子宫内膜癌、增生期子宫内膜、分泌期子宫内膜及萎缩性子宫内膜检测到性子宫内膜检测到hTERT mRNA hTERT mRNA 表达值差异显著。可见表达值差异显著。可见,不同增殖程度的子宫内膜均表达端粒酶活性不同增殖程度的子宫内膜均表达端粒酶活性,但其程度但其程度不同。因此不同。因此,借助端粒酶定性检测判断良恶性增殖借助端粒酶定性检测判断良恶性增殖,其意其意义明显不如定量检测。义明显不如定量检测。已有多次报道已有多次报道:改变实验条件可使多种端粒酶活改变实验条件可使多种端粒酶活性阴性细胞表达端粒酶活性性阴性细胞表达端粒酶活性,并获得永生并获得永生;反之反之,抑制抑制某些增殖活跃组织的端粒酶活性能抑制细胞增殖。某些增殖活跃组织的端粒酶活性能抑制细胞增殖。另有人发现另有人发现:端粒酶通过调节端粒长度和生长促端粒酶通过调节端粒长度和生长促进因子基因表达来影响细胞增殖进因子基因表达来影响细胞增殖。提示端粒酶是细胞。提示端粒酶是细胞生长、增殖中的重要机制。生长、增殖中的重要机制。但少数永生化的肿瘤细胞株和一些软组织肿瘤但少数永生化的肿瘤细胞株和一些软组织肿瘤虽然没有端粒酶活性虽然没有端粒酶活性,但仍有较长端粒但仍有较长端粒,提示还存在提示还存在不依赖端粒酶的端粒延长机制不依赖端粒酶的端粒延长机制。此外用识别此外用识别hTR3端不同序列的三种核酶作用端不同序列的三种核酶作用于肿瘤细胞于肿瘤细胞,4周内端粒酶活性降低周内端粒酶活性降低,端粒缩短端粒缩短,增殖增殖速度没有改变。速度没有改变。其他研究如黑素瘤细胞其他研究如黑素瘤细胞,8周内端粒酶活性降低周内端粒酶活性降低,但是传代超过但是传代超过20代后代后,端粒长度不缩短端粒长度不缩短,细胞持续增细胞持续增殖。说明除了端粒、端粒酶引起细胞增殖的作用外，殖。说明除了端粒、端粒酶引起细胞增殖的作用外，还有其他引起细胞的增殖机制。还有其他引起细胞的增殖机制。三、三、端粒酶对细胞凋亡的影响端粒酶对细胞凋亡的影响启动凋亡的某些基因位于端粒结构附近启动凋亡的某些基因位于端粒结构附近,完整的端完整的端粒结构可以抑制这些基因的表达粒结构可以抑制这些基因的表达,而维持端粒长度主而维持端粒长度主要依赖于端粒酶。要依赖于端粒酶。Holt等在实验中发现等在实验中发现,通过异位表达端粒酶通过异位表达端粒酶,而使端而使端粒长度保持稳定的某些正常细胞对凋亡的抵抗力增强；粒长度保持稳定的某些正常细胞对凋亡的抵抗力增强；用实验方法使端粒酶阳性细胞端粒延长用实验方法使端粒酶阳性细胞端粒延长,子代细胞生子代细胞生存和抗凋亡能力将增强；端粒酶阳性永生化细胞要比存和抗凋亡能力将增强；端粒酶阳性永生化细胞要比端粒酶阴性永生化细胞有更强的抗凋亡生存能力。这端粒酶阴性永生化细胞有更强的抗凋亡生存能力。这些与两个主要的凋亡途径些与两个主要的凋亡途径核内钙依赖核酸内切酶诱核内钙依赖核酸内切酶诱导途径和导途径和Caspese家族中家族中IL-1B转换酶活化途径存在缺转换酶活化途径存在缺陷有关。此外陷有关。此外,研究发现诱导研究发现诱导hTERT显性突变显性突变,降低降低肿瘤细胞内源性端粒酶活性肿瘤细胞内源性端粒酶活性,肿瘤细胞端粒将持续缩肿瘤细胞端粒将持续缩短短,继之异常有丝分裂增多继之异常有丝分裂增多,并最终出现大量凋亡细胞。并最终出现大量凋亡细胞。第四节第四节端粒酶与衰老端粒酶与衰老如何使人体衰老延迟，一直都是人类所不断追求如何使人体衰老延迟，一直都是人类所不断追求的。虽然科学家们发现了一些抗衰老的药物和方法，的。虽然科学家们发现了一些抗衰老的药物和方法，但都不够理想。细胞经过一定次数分裂后，端粒的不但都不够理想。细胞经过一定次数分裂后，端粒的不断丢失使细胞就进入不可逆转的生长抑制状态，脱离断丢失使细胞就进入不可逆转的生长抑制状态，脱离了细胞周期而衰老、凋亡，此过程即为复制性衰老。了细胞周期而衰老、凋亡，此过程即为复制性衰老。在体外培养中，衰老细胞逐渐增多的过程中，可用端在体外培养中，衰老细胞逐渐增多的过程中，可用端粒序列的逐渐丢失来作衰老量化机制精确模型。随着粒序列的逐渐丢失来作衰老量化机制精确模型。随着年龄增长，染色体中端粒长度缩短。年龄增长，染色体中端粒长度缩短。在早老患者中有一个过早的端粒缩短，进而在早老患者中有一个过早的端粒缩短，进而缩短的端粒允许染色体融合，这些现象与年老患缩短的端粒允许染色体融合，这些现象与年老患者的细胞中或培养的老化细胞中染色体组型衰老者的细胞中或培养的老化细胞中染色体组型衰老异常的高发生率密切相关。既然端粒酶活性表达异常的高发生率密切相关。既然端粒酶活性表达能稳定端粒的长度，使端粒在细胞复制过程中不能稳定端粒的长度，使端粒在细胞复制过程中不会丢失，细胞衰老的进程也能被阻止，从而寿命会丢失，细胞衰老的进程也能被阻止，从而寿命延长延长这正是人们研究的端粒酶与抗衰老关系这正是人们研究的端粒酶与抗衰老关系的新热点。的新热点。端端粒粒酶酶延延长长端端粒粒长长度度以以减减慢慢细细胞胞衰衰老老最最早早的的证证据据来来自自BodnarBodnar等等的的研研究究，19981998年年其其在在ScienceScience上上刊刊文文报报道道：将将人人的的端端粒粒酶酶基基因因导导入入端端粒粒酶酶阴阴性性的的正正常常人人体体细细胞胞中中激激活活其其表表达达并并培培养养细细胞胞，然然后后与与未未导导入入该该基基因因的的细细胞胞比比较较，发发现现前前者者端端粒粒明明显显增增长长，细细胞胞分分裂裂旺旺盛盛，细细胞胞寿寿命命比比后后者者大大大大延延长长，更更令令人人关关注注的的是是细细胞胞并并无无肿肿瘤瘤样样改改变变。KudoKudo等等报报道道端端粒粒酶酶活活性性和和细细胞胞凋凋亡亡可可作作为为伴伴有或不伴有子宫内发育延迟的胎盘衰老的标志有或不伴有子宫内发育延迟的胎盘衰老的标志。MattsonMattson等亦认为在研究神经细胞分化和存活中等亦认为在研究神经细胞分化和存活中激活端粒酶与激活端粒酶与TERTTERT功能，能较好地避免神经细胞死功能，能较好地避免神经细胞死亡，还可以促进神经细胞在各种神经元退化性病变亡，还可以促进神经细胞在各种神经元退化性病变条件下的恢复。条件下的恢复。阿尔茨海默病（阿尔茨海默病（Alzheimers diseaseAlzheimers disease，ADAD）是是一种常见于老年人的神经系统退化性疾病，其患者一种常见于老年人的神经系统退化性疾病，其患者的脑血管壁中可分离出致的脑血管壁中可分离出致ADAD神经元退行性病变的神经元退行性病变的-淀粉样蛋白。淀粉样蛋白。Zhu Zhu等利用反义技术和端粒酶抑制剂引发胎鼠海等利用反义技术和端粒酶抑制剂引发胎鼠海马区神经细胞中马区神经细胞中TERTTERT的功能抑制，发现显著增加了的功能抑制，发现显著增加了由由-淀粉样蛋白肽引起的细胞凋亡；淀粉样蛋白肽引起的细胞凋亡；嗜铬细胞瘤细胞中嗜铬细胞瘤细胞中TERTTERT的过量表达会降低此种的过量表达会降低此种细胞凋亡。细胞凋亡。其原因是其原因是TERTTERT功能降低的神经细胞在暴露于功能降低的神经细胞在暴露于-淀淀粉蛋白中能增强其氧化性并使线粒体功能发生障粉蛋白中能增强其氧化性并使线粒体功能发生障碍，因而引起细胞凋亡。碍，因而引起细胞凋亡。TERTTERT在神经退行性病变在神经退行性病变实验模型中展现出有神经保护性功能，提示在神实验模型中展现出有神经保护性功能，提示在神经细胞中若能提高端粒酶的活性可能会抑制与衰经细胞中若能提高端粒酶的活性可能会抑制与衰老相关的神经退行性病变，如老相关的神经退行性病变，如ADAD和脑老化的发生和脑老化的发生等。等。端粒缩短加快可在许多病变中观察到端粒缩短加快可在许多病变中观察到:如如Down Down 综合征、综合征、Werner Werner 综合征、毛细管扩张失调综合征、毛细管扩张失调症症 、先天性角化不良等、先天性角化不良等,虽然有些遗传异常和端虽然有些遗传异常和端粒缺陷的关系还不清楚粒缺陷的关系还不清楚,但可能的原因有但可能的原因有:端粒核酸外切酶活性和端粒核酸外切酶活性和(或或)有效利用的增加。有效利用的增加。端粒过度丢失。端粒过度丢失。在发育或出生后端粒补偿机制的不足在发育或出生后端粒补偿机制的不足(端粒酶端粒酶或正性或正性ALTALT样功能样功能)。端粒缩短加速可由于环境的应急介导的端粒缩短加速可由于环境的应急介导的DNA DNA 损损害或对这些损害敏感度增加所致。不管何种原因害或对这些损害敏感度增加所致。不管何种原因,端粒缩短速率增加可致增殖组织的早衰特征端粒缩短速率增加可致增殖组织的早衰特征,但但也促进由于致瘤突变而获得增殖活性提高的克隆也促进由于致瘤突变而获得增殖活性提高的克隆过分生长。过分生长。第五节第五节端粒酶活化是肿瘤的显著特征端粒酶活化是肿瘤的显著特征 尽管有研究认为端粒长度维持还可以借助于非尽管有研究认为端粒长度维持还可以借助于非端粒酶依赖模式，即端粒替代延长（端粒酶依赖模式，即端粒替代延长（altematire altematire Lengthening of telomere ALTLengthening of telomere ALT）机制，但其存在机制，但其存在上并不能否认永生化细胞中端粒酶的重要作用。自上并不能否认永生化细胞中端粒酶的重要作用。自从从19941994年年KimKim等创立等创立TRAPTRAP法检测端粒酶活性以来，法检测端粒酶活性以来，越来越多的文献证明端粒酶活性在大多数人类原发越来越多的文献证明端粒酶活性在大多数人类原发性肿瘤标本及肿瘤衍生细胞系中可被检测到。美国性肿瘤标本及肿瘤衍生细胞系中可被检测到。美国学者在学者在400多例来源于多例来源于12种不同组织的原发肿瘤病种不同组织的原发肿瘤病例中，肿瘤组织的端粒酶阳性率高达例中，肿瘤组织的端粒酶阳性率高达84.8，而肿，而肿瘤周围组织或良性病变中阳性率仅为瘤周围组织或良性病变中阳性率仅为4.4。附表附表人体组织中端粒酶活性人体组织中端粒酶活性肿瘤部位/类型与肿瘤邻近正常组织/良性病变肿瘤组织（%）肺3/68（4.4%）109/136（80.1%）乳腺2/28（7.1%）19/24（79.6%）前列腺1/18（5.6%）23/27（85.1%）结肠0/45（0）22/23（95.6%）肝1/1（100%）卵巢0/8（0）7/7（100%）肾0/55（0）40/55（72.7%）神经母细胞瘤0/17（0）94/100（94%）血液（淋巴瘤，CLLALL）21/23（91.3%）脑6/8（75%）其它（头顶部，Wilms瘤）8/93（8.6%）24/26(92.3)合计14/332（4.2%）365/430(84.8)ShayShay等报道了几年不同学者对肿瘤端粒酶探讨的等报道了几年不同学者对肿瘤端粒酶探讨的检测结果，总结了正常组织（检测结果，总结了正常组织（196196例），原位癌（例），原位癌（410410例），恶性肿瘤（例），恶性肿瘤（20312031例）和癌旁组织（例）和癌旁组织（690690例）的例）的端粒酶的阳性率，它们分别是端粒酶的阳性率，它们分别是0.5%0.5%、30%30%、85%85%和和11%11%。在前列腺癌、乳腺、胰腺、肺、肝的早期癌中端粒酶在前列腺癌、乳腺、胰腺、肺、肝的早期癌中端粒酶的阳性率为的阳性率为85.0%85.0%95.0%95.0%，而对应的癌旁或良性病变，而对应的癌旁或良性病变组织中，端粒酶基本上不能检出或活性极微弱。组织中，端粒酶基本上不能检出或活性极微弱。SumidaSumida等的研究结果表明等的研究结果表明,端粒酶在各种肿瘤中的阳端粒酶在各种肿瘤中的阳性率分别为性率分别为:口腔鳞状细胞癌口腔鳞状细胞癌80%80%90%,90%,食道癌食道癌87%,87%,胃癌胃癌85%,85%,肺癌肺癌80.1%,80.1%,肝癌肝癌85%,85%,乳腺癌乳腺癌85%,85%,肾癌肾癌71%,71%,胰胰腺癌腺癌95%,95%,端粒酶阳性率与肿瘤发生之间表现出良好的端粒酶阳性率与肿瘤发生之间表现出良好的相关性。相关性。Orlando等对泌尿系统恶性肿瘤进行了深入的等对泌尿系统恶性肿瘤进行了深入的流行病学调查流行病学调查,结果发现肾癌组织中端粒酶阳性率结果发现肾癌组织中端粒酶阳性率为为69%(345/497),正常肾组织为正常肾组织为2%(7/344);膀胱癌组膀胱癌组织中端粒酶阳性率为织中端粒酶阳性率为90%(342/381),正常组织为正常组织为27%(36/134);膀胱癌患者尿液中端粒酶阳性率为膀胱癌患者尿液中端粒酶阳性率为65%(436/675),膀胱灌洗液中端粒酶阳性率为膀胱灌洗液中端粒酶阳性率为72%(131/182),而正常人为而正常人为9%(47/486);前列腺癌组织前列腺癌组织中端粒酶阳性率为中端粒酶阳性率为80%(266/332),邻近组织为邻近组织为38%(32/83),前列腺上皮瘤为前列腺上皮瘤为16%(4/25),良性前列良性前列腺肥大为腺肥大为8%(11/129)。85%90%的人肿瘤细胞中可以检测到端粒的人肿瘤细胞中可以检测到端粒酶活性酶活性,而正常细胞中却没有或活性很低。人们推而正常细胞中却没有或活性很低。人们推测肿瘤细胞逃避衰老持续增殖是端粒酶激活或端测肿瘤细胞逃避衰老持续增殖是端粒酶激活或端粒维持机制改变的结果。粒维持机制改变的结果。一般认为一般认为,端粒酶的激活是恶性肿瘤发生过程端粒酶的激活是恶性肿瘤发生过程中的一个后期事件中的一个后期事件,使肿瘤细胞的端粒不再进行性使肿瘤细胞的端粒不再进行性缩短而得以维持缩短而得以维持,避免了细胞正常的复制避免了细胞正常的复制-衰亡机衰亡机制的制约而获得永生性制的制约而获得永生性,这是恶性肿瘤细胞显著的这是恶性肿瘤细胞显著的生物学特征之一生物学特征之一,是癌变机制中一个十分重要的环是癌变机制中一个十分重要的环节节。对细胞端粒功能的观察和推测的最显著的特征对细胞端粒功能的观察和推测的最显著的特征是发生端粒长度的维持是发生端粒长度的维持,甚至在离开常规的激活时甚至在离开常规的激活时端粒长度维持机制端粒长度维持机制(TMM)的延长的延长,使初期细胞突破衰使初期细胞突破衰老屏障后癌变。发生的原因老屏障后癌变。发生的原因,最可能为过度的端粒最可能为过度的端粒酶激活或酶激活或ALT样功能在在细胞癌变中端粒长度的保样功能在在细胞癌变中端粒长度的保留或增加留或增加,允许在致瘤突变发生时异常克隆的扩展。允许在致瘤突变发生时异常克隆的扩展。一些端粒酶阴性的癌症通过一种或几种一些端粒酶阴性的癌症通过一种或几种ALT途途经维持端粒的长度。端粒酶或经维持端粒的长度。端粒酶或ALT机制存在于绝大机制存在于绝大多数肿瘤细胞中以通过添加端粒重复序列而维持端多数肿瘤细胞中以通过添加端粒重复序列而维持端粒的长度。粒的长度。在一