第十四章基因重组与基因工程(人卫第七版).pptx

第十四章第十四章基因重组与基因工程基因重组与基因工程GeneticRecombinationandGeneticEngineering主讲主讲许春鹃许春鹃生化与分子生物学教研室生化与分子生物学教研室Tel:18970786460QQ:15863025二、细菌的基因转移与重组二、细菌的基因转移与重组（一）接合作用（一）接合作用当当细细胞胞与与细细胞胞、或或细细菌菌通通过过菌菌毛毛相相互互接接触触时时，质质粒粒DNA从从一一个个细细胞胞（细细菌菌）转转移移至至另另一一细细胞胞（细细菌菌）的的DNA转转移移称称为为接接合合作作用用(conjugation)。第第一一节节自然界自然界DNA重组和基因转移重组和基因转移并并非非任任何何质质粒粒DNA都都有有这这种种转转移移能能力力，只只有有某某些些较较大大的的质质粒粒，如如F因因子子方方可可通通过过接接合合作作用从一个细胞转移到另一个细胞。用从一个细胞转移到另一个细胞。（二）转化作用（二）转化作用通通过过自自动动获获取取或或人人为为地地供供给给外外源源DNA，使使细细胞胞或或培培养养的的受受体体细细胞胞获获得得新新的的遗遗传传表表型型，称为称为转化作用转化作用(transformation)。细菌细菌溶解溶解新细菌新细菌摄取摄取DNA重组重组图图14-3转化作用转化作用（三）转导作用（三）转导作用当当病病毒毒从从被被感感染染的的（供供体体）细细胞胞释释放放出出来来、再再次次感感染染另另一一（受受体体）细细胞胞时时，发发生生在在供供体体细细胞胞与与受受体体细细胞胞之之间间的的DNA转转移移及及基基因因重组即为重组即为转导作用转导作用(transduction)。噬菌体的生活史噬菌体的生活史溶菌生长途径溶菌生长途径(lysispathway)溶源菌生长途径溶源菌生长途径(lysogenicpathway)发发生生在在同同源源序序列列间间的的重重组组称称为为同同源源重重组组(homologousrecombination)，又又称称基基本本重重组组。是是最最基基本本的的DNA重重组组方方式式，通通过过链链的的断断裂裂和和再再连连接接，在在两两个个DNA分分子子同同源源序序列列间间进进行行单单链链或或双双链链片片段段的的交交换换。同同源源重重组组不不需需要要特特异异DNA序序列列，而而是是依依赖赖两两分分子子之之间间序序列列的的相相同同或类似性。或类似性。以以E.coli的的同同源源重重组组为为例例，了了解解同同源源重重组组机制的机制的Holliday模型。模型。一、同源重组是最基本的一、同源重组是最基本的DNA重组方式重组方式交换后的交换后的DNA分子分子同源重组同源重组交换点交换点两条同源两条同源DNA双螺旋双螺旋内切酶内切酶(RecBCD)DNA侵扰侵扰(RecA)分支迁移分支迁移(RecA)内切酶内切酶(RecBCD)DNA连接酶连接酶535353535353535353535353535333535335535353Holliday中间体中间体53535353图图14-1同源重组机制同源重组机制Holliday中间体中间体535353535355533355553333555533335555333355553333内切酶内切酶(RuvC)内切酶内切酶(RuvC)DNA连接酶连接酶DNA连接酶连接酶拼接重组体拼接重组体片段重组体片段重组体图图14-1同源重组机制同源重组机制由由整整合合酶酶催催化化，在在两两个个DNA序序列列的的特特异异位位点点 间间 发发 生生 的的 整整 合合,称称 位位 点点 特特 异异 重重 组组(site-specificrecombination)。（一）（一）噬菌体噬菌体DNA的整合的整合一一个个由由病病毒毒编编码码的的特特殊殊重重组组蛋蛋白白质质，称称为为整整合合酶酶，能能识识别别细细菌菌染染色色体体的的一一个个特特定定的的DNA序序列列和和病病毒毒基基因因组组的的另另一一个个序序列列，它它把把这这两两个个序序列列拉拉到到一一起起并并催催化化两两个个DNA的的断断裂裂和和重重接接，从而把病毒基因组整合进细菌基因组。从而把病毒基因组整合进细菌基因组。三、特异位点重组三、特异位点重组（二）细菌的特异位点重组（二）细菌的特异位点重组H2鞭毛蛋白鞭毛蛋白阻遏蛋白阻遏蛋白Hin重组酶重组酶（倒位酶）（倒位酶）H1鞭毛蛋白鞭毛蛋白hinH2rH1H1l鼠伤寒沙门杆菌鼠伤寒沙门杆菌H片段倒位决定鞭毛相转变片段倒位决定鞭毛相转变H片段片段hixhixPPPH片段片段hixhixhinH2rH1PPH1PH1基因被阻遏基因被阻遏三、特异位点重组三、特异位点重组（三）免疫球蛋白基因的重排（三）免疫球蛋白基因的重排V片段片段J片段片段RSSRSS间插间插DNAOHOHVJ单链切开单链切开RAG1RAG2分子内转酯反应分子内转酯反应单链切开、转移单链切开、转移核苷酸修复、连接核苷酸修复、连接三、特异位点重组三、特异位点重组由由插插入入序序列列和和转转座座子子介介导导的的基基因因移移位位或或重排称为重排称为转座转座(transposition)。四、转座重组四、转座重组（一）（一）插入序列转座插入序列转座插入序列发生的插入序列发生的转座转座有两种形式：有两种形式：(1)保守性转座：插入序列从原位迁到新位。保守性转座：插入序列从原位迁到新位。(2)复制性转座：插入序列复制后，其中一个复制性转座：插入序列复制后，其中一个复制本迁移到新位，另一个仍保留在原位。复制本迁移到新位，另一个仍保留在原位。（二）转座子转座（二）转座子转座转座子转座子：可从一个染色体位点转移到另一：可从一个染色体位点转移到另一个位点的分散的重复序列。个位点的分散的重复序列。piggyBac转座子的老鼠，转座子的老鼠，表达红色荧光蛋白表达红色荧光蛋白玉米玉米“花斑花斑”由一种由一种转座因子的存在所导转座因子的存在所导致致第第 二二 节节 重组重组DNA技术技术n重组重组DNA技术的发展史技术的发展史1865年年G.J.Mendel的豌豆杂交试验的豌豆杂交试验18661944年年O.T.Avery的肺炎球菌转化实验的肺炎球菌转化实验1973年年美国斯坦福大学的科学家构建美国斯坦福大学的科学家构建第一个第一个重组重组DNA分子分子1977年年美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一第一家家遗传工程公司，专门应用重组遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制技术制造医学上重要的药物。造医学上重要的药物。1980年年开始建造开始建造第一家第一家应用重组应用重组DNA技术生产胰岛技术生产胰岛素的工厂素的工厂1997年年英国罗林研究所成功的克隆了英国罗林研究所成功的克隆了多莉多莉克隆羊技术克隆羊技术一、重组一、重组DNA技术相关概念技术相关概念（一）（一）DNA克隆克隆l克隆克隆(clone)：指来自同一始祖的相同副本指来自同一始祖的相同副本或或拷贝的集合。拷贝的集合。l克隆化克隆化(cloning)：指获取同一拷贝的过程，指获取同一拷贝的过程，实际上是无性繁殖。实际上是无性繁殖。克隆可以是不同层次的，分子水平上的克克隆可以是不同层次的，分子水平上的克隆称为隆称为分子克隆分子克隆；细胞水平上的克隆称为；细胞水平上的克隆称为细胞细胞克隆克隆；整体水平的克隆称为；整体水平的克隆称为动物克隆动物克隆或或植物克植物克隆。隆。lDNA克隆克隆应用酶学的方法，应用酶学的方法，在体外在体外将各种来源的遗传物质将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的的DNA）与载体与载体DNA接合成一具有自我复制能力的接合成一具有自我复制能力的DNA分子分子复制子复制子，继而通过转化或转染宿主细胞，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一获得大量同一DNA分子，也称分子，也称基因克隆或重组基因克隆或重组DNA(recombinantDNA)。l基因工程基因工程(geneticengineering)实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称程，又称重组重组DNA工艺学。工艺学。（二）工具酶（二）工具酶表表14-1v限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶vDNA聚合酶聚合酶v逆转录酶逆转录酶vT4DNA连接酶连接酶v碱性磷酸酶碱性磷酸酶v末端转移酶末端转移酶vTaqDNA聚合酶聚合酶（二）（二）工具酶工具酶l限制性核酸内切酶的概念限制性核酸内切酶的概念GAATTCCTTAAG+EcoR GCTTAA5335AATTCG3553指指可可识识别别双双链链DNA中中特特异异序序列列,并并在在识识别别位位点点或或其其周周围围切切割割双双链链DNA的的一一类类内内切切酶酶(核核酸酸水水解解酶酶)。限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶天天然然存存在在于于细细菌菌体体内内，与与甲甲基基化化酶酶共共同同构构成成细细菌菌的的限限制制修修饰饰系系统统，限限制制外外源源DNA，保护自身保护自身DNA。l限制性核酸内切酶的分类限制性核酸内切酶的分类根据酶的组成、所需因子及裂解根据酶的组成、所需因子及裂解DNA方方式的不同，可将限制性核酸内切酶分为式的不同，可将限制性核酸内切酶分为、类。基因工程技术中常用的为类。基因工程技术中常用的为类酶类酶。l限制性核酸内切酶的命名限制性核酸内切酶的命名Hin d属属 系系 株株 序序Haemophilusinfluenzaed株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶限制性核酸内切酶一般以提取这类限制性核酸内切酶一般以提取这类酶的生物的属名和种名的第酶的生物的属名和种名的第1、2个个字母及菌株（型）的代号来命名字母及菌株（型）的代号来命名。l限制性核酸内切酶的作用机制限制性核酸内切酶的作用机制限制性核酸内切酶以环状和线形的双链限制性核酸内切酶以环状和线形的双链DNA为底为底物，在合适的反应条件下，识别一定的核苷酸序列，物，在合适的反应条件下，识别一定的核苷酸序列，使两条核糖链上特定位置的使两条核糖链上特定位置的磷酸二酯键断开磷酸二酯键断开，产生具，产生具有有3-OH基团和基团和5-磷酸基团的末端。磷酸基团的末端。l类限制性核酸内切酶的识别序列类限制性核酸内切酶的识别序列GGGGA AT TCCCCCCCCT TA AGGGG5335限制性内切核酸酶或限制性内切核酸酶或DNA结合蛋白所特异识别、结合蛋白所特异识别、结合的结合的DNA位点的核苷酸序列，呈二元旋转对称，其位点的核苷酸序列，呈二元旋转对称，其序列从序列从5端到端到3端回折后能互补，通常将这种特端回折后能互补，通常将这种特殊的结构顺序称为殊的结构顺序称为回文结构（回文结构（palindrome）。）。Bam HGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTG平头末端或钝性末端平头末端或钝性末端黏性末端黏性末端GCCTAGGATCCG+GTCCAGGACCTG+5353353535535335配伍末端配伍末端有有些些限限制制性性内内切切酶酶虽虽然然识识别别序序列列不不完完全全相相同同，但但切切割割DNA后后，产产生生相相同同的的黏黏性性末末端端，这这两两个个相相同的同的黏黏性末端称为性末端称为配伍未端。配伍未端。Bam Bam HHGGATCCCCTAGG5335+GCCTAGGATCCG5335+ATCTAGGATCTA5335Bg Bg llAGATCTTCTAGA5335（三）目的基因（三）目的基因用来扩增作研究或生产某一种蛋白质的基因。用来扩增作研究或生产某一种蛋白质的基因。就是在重组就是在重组DNA时，人们感兴趣的基因或时，人们感兴趣的基因或DNA序序列，又称列，又称目的目的DNA(targetDNA)。l目的基因的类型目的基因的类型cDNA(complementaryDNA)指经反转录合成的、与指经反转录合成的、与RNA互补的单链互补的单链DNA，经聚合可合成双链，经聚合可合成双链cDNA。基因组基因组DNA(geneticDNA)指代表一个细胞或生物体整套遗传信息指代表一个细胞或生物体整套遗传信息(染染色体及线粒体色体及线粒体)的所有的所有DNA序列。序列。（四）基因载体（四）基因载体l基因载体的定义基因载体的定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。分子。l常用的基因载体常用的基因载体质粒质粒DNA噬菌体噬菌体DNA病毒病毒DNA从构建克隆载体的从构建克隆载体的DNA来源不同分类来源不同分类l克隆载体克隆载体(cloningvector)为为使使插插入入的的外外源源DNA序序列列被被扩扩增增而而特特意设计的载体。意设计的载体。l表达载体表达载体(expressionvector)为为使使插插入入的的外外源源DNA序序列列可可转转录录翻翻译译成多肽链而特意设计的载体。成多肽链而特意设计的载体。从从应用范围应用范围来分类，基因载体可分为：来分类，基因载体可分为：l 理想的基因载体应具备下列条件：理想的基因载体应具备下列条件：具有合适的具有合适的克隆位点（酶切位点），克隆位点（酶切位点），便于外源便于外源DNA的插入的插入;能携带目的基因进入宿主细胞，具有能携带目的基因进入宿主细胞，具有自主复制能力自主复制能力;具有具有可检测的选择标记可检测的选择标记，便于重组体的筛选和鉴定，便于重组体的筛选和鉴定;载体分子量相对较小，易于操作，并有足够的接纳载体分子量相对较小，易于操作，并有足够的接纳目的基因的容量，同时载体目的基因的容量，同时载体DNA与宿主与宿主DNA便于分便于分离离;安全安全，不应含有对受体细胞有害的基因，并且不会，不应含有对受体细胞有害的基因，并且不会任意转入除宿主细胞以外的其它生物的细胞。任意转入除宿主细胞以外的其它生物的细胞。1.质粒质粒(plasmid)l特点特点能能在在宿宿主主细细胞胞内内独独立立自自主主复复制制；带带有有某某些些遗遗传信息传信息,会会赋予宿主细胞一些遗传性状赋予宿主细胞一些遗传性状。质质粒粒常用的基因载体常用的基因载体pBR322质粒载体图谱质粒载体图谱常用的基因载体常用的基因载体pUC19质粒载体图谱质粒载体图谱常用的基因载体常用的基因载体2.噬菌体载体噬菌体载体噬菌体噬菌体（phage）是感染细菌的一类病毒，有双链）是感染细菌的一类病毒，有双链噬菌体和单链丝状噬菌体两大类，前者为噬菌体和单链丝状噬菌体两大类，前者为噬菌体类，噬菌体类，后者主要有后者主要有M13噬菌体和噬菌体和f1噬菌体。噬菌体。头部头部尾部尾部DNA尾部纤维尾部纤维衣壳衣壳常用的基因载体常用的基因载体l噬菌体噬菌体DNA改造系统改造系统gt系列（插入型，适用系列（插入型，适用cDNA克隆）克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）系列（置换型，适用基因组克隆）2.噬菌体载体噬菌体载体lM13噬菌体噬菌体DNA改造系统改造系统:M13mp系列和系列和pUC系列系列（适用于外源单链（适用于外源单链DNA的克隆）的克隆）3.动物病毒载体动物病毒载体4.酵母人工染色体载体酵母人工染色体载体(克隆外源克隆外源DNA大片段大片段)基因工程中要根据具体的实验需要，选择合适的基因工程中要根据具体的实验需要，选择合适的克隆载体或表达载体，同时对每一种载体必须选用合克隆载体或表达载体，同时对每一种载体必须选用合适的宿主细胞，方能达到最佳的克隆和表达效率。适的宿主细胞，方能达到最佳的克隆和表达效率。常用的基因载体常用的基因载体二、重组二、重组DNA技术基本原理及操作步骤技术基本原理及操作步骤目的基因的获取目的基因的获取重组重组DNA分子导分子导入宿主细胞入宿主细胞外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建克隆载体的选择和构建重组体的筛选重组体的筛选克隆基因的表达克隆基因的表达分分切切接接转转筛筛图图14-10以质粒为载体的以质粒为载体的DNA克隆过程克隆过程重组重组DNA增殖增殖载体载体外源外源DNA重组重组DNA分子分子细菌细菌转化或转染转化或转染筛选含重组筛选含重组质粒的细菌质粒的细菌细菌在培养液中繁殖后细菌在培养液中繁殖后,在固体培养基上生长在固体培养基上生长（一）目的基因的获取（一）目的基因的获取1.化学合成法化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列物的氨基酸序列。2.基因组基因组DNA文库文库(genomicDNAlibrary)3.cDNA文库文库(cDNAlibrary)4.聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)二、重组二、重组DNA技术基本原理及操作步骤技术基本原理及操作步骤（三）外源基因与载体的连接（三）外源基因与载体的连接（二）克隆载体的选择和构建（二）克隆载体的选择和构建利用利用DNA连接酶连接酶和和双链粘末端单链序列互双链粘末端单链序列互补补结合的配合使用将外源结合的配合使用将外源DNA与载体共价连接。与载体共价连接。根据实验目的、操作基因的性质不同，选择根据实验目的、操作基因的性质不同，选择合适的载体并构建克隆载体。合适的载体并构建克隆载体。二、重组二、重组DNA技术基本原理及操作步骤技术基本原理及操作步骤(1)同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接1.黏性末端连接黏性末端连接Bam H切割反应切割反应GGATCCCCTAGGGATCCGGCCTAGDNA连接酶连接酶+目的基因用目的基因用Bam H切割切割 载体载体DNA用用Bam H切割切割重组体重组体载体自连载体自连目的基因自连目的基因自连1.黏性末端连接黏性末端连接355353352.平端连接平端连接目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶DNA连接酶连接酶载体自连载体自连目的基因自连目的基因自连重组体重组体l选择宿主细胞条件选择宿主细胞条件安全宿主菌安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷处于处于感受态感受态(competent)根据采用的载体性质不同，导入重组根据采用的载体性质不同，导入重组DNA分分子有子有转化转化、转染转染和和感染感染等不同方式。等不同方式。（四）重组（四）重组DNA导入宿主细胞导入宿主细胞二、重组二、重组DNA技术基本原理及操作步骤技术基本原理及操作步骤基因工程中使用的宿主细胞主要有大肠杆基因工程中使用的宿主细胞主要有大肠杆菌、酵母细胞、各种来源的哺乳动物细胞、菌、酵母细胞、各种来源的哺乳动物细胞、植物细胞和昆虫细胞等。植物细胞和昆虫细胞等。1.直接选择法直接选择法(1)抗药性标记选择抗药性标记选择(2)标志补救标志补救(markerrescue)(3)分子杂交法分子杂交法原位杂交原位杂交Southern印迹印迹2.免疫学方法免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等如免疫化学方法及酶免检测分析等（五）重组体的筛选（五）重组体的筛选二、重组二、重组DNA技术基本原理及操作步骤技术基本原理及操作步骤重组重组DNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNAcDNA 人工合成人工合成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNA目的基因目的基因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交l表达体系的建立表达体系的建立表达载体的构建表达载体的构建受体细胞的建立受体细胞的建立表达产物的分离纯化表达产物的分离纯化（六）克隆基因的表达（六）克隆基因的表达1.原核表达体系原核表达体系(E.coli表达体系最为常用表达体系最为常用)2.真核表达体系真核表达体系(酵母、昆虫、乳类动物细胞酵母、昆虫、乳类动物细胞)二、重组二、重组DNA技术基本原理及操作步骤技术基本原理及操作步骤第三节第三节重组重组DNA技术与医学的关系技术与医学的关系一、疾病基因的发现与克隆一、疾病基因的发现与克隆根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子机制。的分子机制。二、生二、生物制药物制药三、基因诊断与治疗三、基因诊断与治疗（一）基因诊断的概念（一）基因诊断的概念基基因因诊诊断断(geneticdiagnosis)是利利用用分分子子生生物物学学及及分分子子遗遗传传的的技技术术和和原原理理，在在DNA水水平平分分析析、鉴鉴定定遗遗传传疾疾病病所所涉涉及及基基因因的的置置换换、缺缺失失或或插插入入等等突变。突变。基因治疗基因治疗(genetherapy)是向有功能缺陷的是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。的缺陷，从而达到治疗的目的。四、遗传疾病的预防四、遗传疾病的预防1.产前诊断产前诊断2.携带者测试基因携带者测试基因3.症候前诊断症候前诊断4.遗传病易感性遗传病易感性第三节第三节重组重组DNA技术与医学的关系技术与医学的关系（二）基因治疗的概念（二）基因治疗的概念思考题思考题1、自然界细菌发生基因转移的方式主要有哪、自然界细菌发生基因转移的方式主要有哪几种？其几种？其DNA重组的类型主要有哪些？重组的类型主要有哪些？2、试述重组、试述重组DNA技术的概念、基本原理及操技术的概念、基本原理及操作步骤。作步骤。3、请回答目的基因的来源。、请回答目的基因的来源。4、一个理想的基因载体应该具备哪些条件？、一个理想的基因载体应该具备哪些条件？图图14-2接合作用接合作用细胞质桥细胞质桥性鞭毛性鞭毛F质粒质粒图图14-4转导作用转导作用细菌细菌噬菌体噬菌体感染感染溶溶菌菌感染感染重重组组噬噬菌菌体体的的生生活活周周期期供体供体DNA目标目标DNAA保守性转座保守性转座新新DNA序列序列B复制性转座复制性转座新新DNA序列序列A插入序列：转座酶编码基因两侧连接反向末端重复序列插入序列：转座酶编码基因两侧连接反向末端重复序列(箭头所示箭头所示)；B转座子转座子Tn3：含有转座酶、：含有转座酶、-内酰胺酶及阻内酰胺酶及阻遏蛋白编码基因；遏蛋白编码基因；C转座子转座子Tn10：含四环素抗性基因及两：含四环素抗性基因及两个相同的插入序列个相同的插入序列IS10L图图14-8细菌的可流动性元件细菌的可流动性元件表表14-1重组重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶工工具具酶酶功功能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNA连接酶连接酶催化催化DNA中相邻的中相邻的5磷酸基和磷酸基和3羟基末端之间形成磷酸二羟基末端之间形成磷酸二酯键，使酯键，使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段连接分子或片段连接DNA聚合酶聚合酶合成双链合成双链cDNA分子或片段连接分子或片段连接缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针DNA序列分析序列分析填补填补3末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而无外切活性，而无53 外切活性。外切活性。常用于常用于cDNA第二链合成，双链第二链合成，双链DNA3 末端标记等末端标记等反转录酶反转录酶合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I进行填补，标记或进行填补，标记或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶在在3羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基化学合成法获取目的基因化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列序列人人DNA基因组文库基因组文库几百万个基因组几百万个基因组DNA片段片段重组重组DNA分子分子质粒导质粒导入细菌入细菌DNA片段插入片段插入质粒质粒限制酶切割限制酶切割mRNAcDNA双链双链cDNA重组重组DNA分子分子cDNA文库文库反转录酶反转录酶载体载体受体菌受体菌复制复制从从cDNA文库获取目的基因文库获取目的基因逆转录酶逆转录酶AAAATTTTAAAASISI核酸酶核酸酶DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解TTTT5 Primer15 Primer2变性、退火、延伸变性、退火、延伸5 5 5 5 5 5 TemplateDNA5 5 5 5 5 5 5 5 一、基本工作原理一、基本工作原理聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)2530次循环后，模板次循环后，模板DNA的含量的含量可以扩大可以扩大100万倍以上。万倍以上。(插入失活法插入失活法)抗药性标记选择抗药性标记选择组氨酸缺陷组氨酸缺陷型大肠杆菌型大肠杆菌无组氨酸无组氨酸的培养基的培养基酵母咪唑甘油磷酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因酸脱水酶基因促进组氨酸合成促进组氨酸合成DNA重组体重组体标志补救标志补救图图14-13利用利用互补原理筛选重组体互补原理筛选重组体pUC18原原位位杂杂交交Southern印迹印迹