茶叶中氨基酸总量的快速测定.ppt

茶叶中氨基酸总量的快速测定 茚三酮比色法茚三酮比色法 制作人：汪小钢实验目的实验目的 茶叶中氨基酸是茶汤的主要成分，它对茶汤的鲜甜味有重要作用，与茶叶的品质呈高度的正相关。此外，在茶叶加工过程中氨基酸在热力等作用下通过美拉德反应、Strecker降解等形成醛类等香气物质，从而影响茶叶品质。因此氨基酸是评判茶叶品质的一个重要指标。实验原理实验原理n n茶叶中氨基酸在缓冲溶液中与茚三酮同时加热，茶叶中氨基酸在缓冲溶液中与茚三酮同时加热，-氨基氮与茚三酮形成紫色的络合物，紫色的深氨基氮与茚三酮形成紫色的络合物，紫色的深浅与氨基酸含量呈正相关。其反应机理如下：浅与氨基酸含量呈正相关。其反应机理如下：试剂试剂 n n索伦逊氏缓冲溶液（索伦逊氏缓冲溶液（pH8.04pH8.04）：）：A A：称取磷酸二氢钾：称取磷酸二氢钾2.2682.268克，用水溶解并定容至克，用水溶解并定容至250250毫升；毫升；B B：称取：称取NaNa2 2HPOHPO4 42H2H2 2O11.878O11.878克（克（NaNa2 2HPOHPO4 4取取9.4679.467克），用水溶解并定容至克），用水溶解并定容至10001000毫升；毫升；取取A A液液0.50.5毫升加毫升加B B液液9.59.5毫升即配成约毫升即配成约pH8.04pH8.04的缓冲的缓冲液。具体用量可按此比例配制。液。具体用量可按此比例配制。n n茚三酮试剂：茚三酮试剂：取取1 1克茚三酮加克茚三酮加2525毫升水和毫升水和4040毫克氯化亚锡毫克氯化亚锡（SnClSnCl2 22H2H2 2OO）拌匀过滤，滤液在暗处存放一昼）拌匀过滤，滤液在暗处存放一昼夜，定容至夜，定容至5050毫升。存于暗处，可用数月。毫升。存于暗处，可用数月。主要仪器主要仪器n n分光光度计/吸滤装置/水浴锅测定方法（测定方法（I）标准曲线制作标准曲线制作 准确称取茶氨酸（或谷氨酸）准确称取茶氨酸（或谷氨酸）100100毫克溶于毫克溶于100100毫毫升水中，然后用水稀释成如下浓度：升水中，然后用水稀释成如下浓度：4040微克微克/毫升、毫升、8080微克微克/毫升、毫升、160160微克微克/毫升、毫升、240240微克微克/毫升、毫升、320320微克微克/毫升。分别移取以上各浓度溶液毫升。分别移取以上各浓度溶液1.01.0毫升置于毫升置于2525毫升容量瓶中，加毫升容量瓶中，加0.50.5毫升缓冲液，再加茚三酮毫升缓冲液，再加茚三酮显色剂显色剂0.50.5毫升，在沸水浴中加热毫升，在沸水浴中加热1515分钟，待冷却分钟，待冷却后加水定容至后加水定容至2525毫升。放置毫升。放置10101515分钟，于波长分钟，于波长570nm570nm处，用处，用1.01.0厘米比色杯，测定其吸光度厘米比色杯，测定其吸光度A A。以。以A A值为纵坐标，氨基酸浓度（微克值为纵坐标，氨基酸浓度（微克/毫升）为横坐毫升）为横坐标作图，得标准曲线并可求得线性回归方程。标作图，得标准曲线并可求得线性回归方程。测定方法（测定方法（II）茶叶中含量的测定茶叶中含量的测定 称取3.0000克左右磨碎茶样，加沸水450毫升在沸水浴中浸提45分钟，每隔10分钟摇瓶一次，趁热过滤，冷却后定容至500毫升得供试液。取试液1.0毫升置于25毫升容量瓶中，加0.5毫升缓冲液，再加茚三酮显色剂0.5毫升，在沸水浴中加热15分钟，待冷却后加水定容至25毫升。放置1015分钟，于波长570nm处，用1.0厘米比色杯，测定其吸光度。结果计算结果计算 式中：C 根据A值由线性回归方程求得的浓度（微克/毫升）V 样品总体积的毫升数 V1 被测液毫升数注意事项注意事项 n n如对测定结果准确度要求不高，可以用下式计算如对测定结果准确度要求不高，可以用下式计算茶叶中氨基酸的含量，不需要制作标准曲线。茶叶中氨基酸的含量，不需要制作标准曲线。n n在水浴中加热时，必须将容量瓶球状部分浸入沸在水浴中加热时，必须将容量瓶球状部分浸入沸水中，严格控制时间（水中，严格控制时间（1515分钟）和温度（沸腾），分钟）和温度（沸腾），比色时间必须在比色时间必须在1 12 2小时内完成，否则将影响测小时内完成，否则将影响测定结果。定结果。注意事项注意事项n n茚三酮有时包装不好或放置不当，常呈微红色，茚三酮有时包装不好或放置不当，常呈微红色，影响比色测定，故需重结晶，进行纯化后方可应影响比色测定，故需重结晶，进行纯化后方可应用。纯化方法：将用。纯化方法：将5 5克茚三酮溶于克茚三酮溶于1515毫升热水中，毫升热水中，加入加入0.250.25克活性炭，轻轻摇动，若溶液太浓不易操克活性炭，轻轻摇动，若溶液太浓不易操作可酌量加入作可酌量加入5 51010毫升水，毫升水，3030分钟后用滤纸过滤，分钟后用滤纸过滤，滤液放在冰箱内过夜，次晨即有黄白色结晶析出，滤液放在冰箱内过夜，次晨即有黄白色结晶析出，过滤后，再用过滤后，再用1 1毫升水洗涤结晶，然后置于干燥器毫升水洗涤结晶，然后置于干燥器中干燥，最后装入棕色玻璃瓶内保存。中干燥，最后装入棕色玻璃瓶内保存。n n多酚类物质对氨基酸测定有一定影响，除去多酚多酚类物质对氨基酸测定有一定影响，除去多酚类物质再用茚三酮显色定量，结果比较稳定可靠。类物质再用茚三酮显色定量，结果比较稳定可靠。去除多酚类物质的处理方法很多，聚乙烯吡咯烷去除多酚类物质的处理方法很多，聚乙烯吡咯烷酮法分析速度快，效果较好。酮法分析速度快，效果较好。