备课素材：利用PCR技术获取目的基因-高二下学期生物人教版选择性必修3.docx

利用PCR技术获取目的基因2019版高中生物学选择性必修三提到，利用PCR获取和扩增目的基因：那么，利用PCR技术获取目的基因具体过程是怎样的？PCR即聚合酶链式反应是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温(经常是60°C左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72°C左右)，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。下图为具有目的基因的某DNA分子，目的基因两侧是已知碱基序列的片段。首先高温使DNA分子变性，双螺旋结构解开（），变成单链。降低温度，根据已知序列合成的引物与已知序列结合（）。在热稳定DNA聚合酶的作用下，合成新链（）。在此以甲链为例，合成新链丙链。获得具有甲-丙双链的DNA分子。重复以上过程，以甲-丙DNA分子为模板，经过第二轮获得具有丙、丁双链的DNA分子（以丙链为例）。以具有丙-丁双链的DNA分子为模板，经过第三轮获得具有目的基因（以丁链为例）。完整过程如下图所示，一般需要获得的基因是有一定长度的，而模板长度很长。设计的引物決定了扩増产物的长度。第一个循环，引物与模板互补，此时变成两个模板，但因为模板很长，没有什么终止扩増，所以第一个循环扩増出来的新片段很长很长。第二个循环以新的长片段为模板进行，但新片段的一端是引物开头的，所以第二个循环得到的片段就是我们需要的长度，但只是一条链，所以还不能分离出目的基因。第三个循环，当以第二个循环得到的新片段为模板时，因为这个片段的长度就是需要扩増的长度，所以当第三个循环完成时，这个片段是需要的长度，且是双链DNA，这就得到了需要的目的基因了。所以至少要3个循环才能分离出目的基因。 例、下图是转基因猕猴培养过程示意图，请据图回答：（1）获取绿色荧光蛋白基因的方法包括_、利用 PCR 技术扩增和用化学方法 直接人工合成等。基因工程的核心步骤是_用图中数字表示），过程常用的方法是_。（2）从分子水平检测目的基因是否成功导入受体细胞的方法是_ 技术。（3）利用 PCR 技术扩增目的基因的前提是要有一段已知的目的基因核苷酸序列，根据这 一序列设计并合成_。（4）从雌性猕猴体内采集的卵母细胞，一般要培养到_ 阶段才能进行体外受 精。判断卵子受精的重要标志是_。（5）图中过程称为_ ，所用的早期胚胎通常是发育至_ 期的胚 胎，受体雌猴对移入子宫的外来胚胎不会发生 _反应，这为胚胎在受体雌猴体 内的存活提供了可能。【答案】从基因文库中获取  显微注射法 DNA分子杂交 （成对的）引物 减数第二次分裂中期（M中期） 在卵细胞膜和透明带的间隙可以观察到两个极体 胚胎移植 囊胚（或桑椹胚） 免疫排斥【解析】图示为转基因猕猴的培育过程示意图。标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。基因工程技术的基本步骤：目的基因的获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因用DNA分子杂交技术；检测目的基因是否转录出了mRNA用分子杂交技术；检测目的基因是否翻译成蛋白质用抗原抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。PCR是聚合酶链式反应的缩写，其扩增目的基因的原理是： DNA半保留复制的原理。扩增目的基因的前提是：要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成（成对的）引物。反应需要：模板DNA、四种脱氧核苷酸、一对引物、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）。胚胎移植，又称受精卵移植，是指将雌性动物的早期胚胎，或者通过体外受精及其他方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的雌性动物体内，使之继续发育为新个体的技术。相关技术包括：同期发情、超数排卵、胚胎的收集和移植（卵母细胞的体外成熟、精子的体外获能、体外受精、受精卵的体外培养和移植等一系列步骤）。（1）绿色荧光蛋白基因为目的基因，获取目的基因的方法包括：从基因文库中获取目的基因、利用PCR技术扩增目的基因和用化学方法直接人工合成等；基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建，即图示中的过程。过程是将目的基因导入受精卵这一受体细胞，常用的方法是显微注射法；（2）目的基因的检测与鉴定分为分子水平上的检测和个体水平上的鉴定。分子水平检测目的基因是否成功导入受体细胞的方法是DNA分子杂交技术；（3）PCR扩增目的基因的前提是：要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成（成对的）引物。（4）受体细胞常选处在M中（减数第二次分裂中）期的去核卵母细胞，通过电脉冲（或电刺激）进行激活，使其完成减数分裂和发育进程；受精过程包括5个阶段：1、精子穿过放射冠 2、精子穿过透明带 3、精子进入卵黄 4、原核形成 5、配子融合。是否完成受精的标志是：在卵黄膜和透明带的间隙可以观察到二个极体；（5）图中过程为胚胎移植，所用的早期胚胎通常是发育至桑椹胚或囊胚期的胚胎，由于胎盘屏障等原因，受体雌猴对移入子宫的外来胚胎不会发生免疫排斥反应，这为胚胎在受体雌猴内的存活提供了可能。学科网（北京）股份有限公司