最新大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化ppt课件.ppt

大肠杆菌感受态细胞的置备大肠杆菌感受态细胞的置备与质粒转化与质粒转化一一.实验目的实验目的 通过本实验，学习大肠杆菌感受态细通过本实验，学习大肠杆菌感受态细胞制备和转化的原理与技术方法。胞制备和转化的原理与技术方法。3 3将将将将培培培培养养养养液液液液4ml4ml转转转转移移移移到到到到5ml5ml离离离离心心心心管管管管中中中中，4 4，2000g2000g离心离心离心离心3min3min4 4弃弃弃弃上上上上清清清清，加加加加0.5mL0.5mL用用用用冰冰冰冰预预预预冷冷冷冷的的的的0.1 0.1 M M CaClCaCl2 2溶溶溶溶液液液液，轻轻吹打或摇动混匀细胞轻轻吹打或摇动混匀细胞轻轻吹打或摇动混匀细胞轻轻吹打或摇动混匀细胞注注注注意意意意：加加加加入入入入CaClCaCl2 2动动动动作作作作需需需需轻轻轻轻柔柔柔柔，勿勿勿勿剧剧剧剧烈烈烈烈震震震震荡荡荡荡，并并并并且且且且尽量使细胞处于低温中尽量使细胞处于低温中尽量使细胞处于低温中尽量使细胞处于低温中5 5 5 5冰上放置冰上放置冰上放置冰上放置20min20min20min20min，2000g2000g2000g2000g离心离心离心离心2min2min2min2min 6 6弃弃弃弃上上上上清清清清，加加加加0.1ml0.1ml预预预预冷冷冷冷的的的的 0.1 0.1 M M CaClCaCl2 2溶溶溶溶液液液液，轻轻轻轻轻吹打或摇动混匀细胞，即得感受态细胞轻吹打或摇动混匀细胞，即得感受态细胞轻吹打或摇动混匀细胞，即得感受态细胞轻吹打或摇动混匀细胞，即得感受态细胞注注注注意意意意：离离离离心心心心后后后后观观观观察察察察沉沉沉沉淀淀淀淀，如如如如果果果果出出出出现现现现中中中中间间间间空空空空心心心心的的的的沉沉沉沉淀说明操作正常淀说明操作正常淀说明操作正常淀说明操作正常7 7将将将将取取取取0.1ml0.1ml感感感感受受受受态态态态细细细细胞胞胞胞转转转转移移移移到到到到1.5ml1.5ml离离离离心心心心管管管管中中中中，加加加加2l 2l 质粒，混匀，冰上放置质粒，混匀，冰上放置质粒，混匀，冰上放置质粒，混匀，冰上放置30min30min8 84242水浴水浴水浴水浴9090秒秒秒秒,在冰上放置在冰上放置在冰上放置在冰上放置2min2min9 9加加加加入入入入 0.5 0.5 mlml新新新新鲜鲜鲜鲜LBLB培培培培养养养养基基基基，3737，200rpm200rpm振振振振荡荡荡荡约约约约30min30min45min45min（注注注注：转转转转纯纯纯纯质质质质粒粒粒粒可可可可省省省省略略略略，转转转转连连连连接产物需进行）接产物需进行）接产物需进行）接产物需进行）10.10.取取取取 100l 100l 涂涂涂涂布布布布到到到到含含含含有有有有氨氨氨氨苄苄苄苄青青青青霉霉霉霉素素素素的的的的平平平平板板板板上上上上,加加加加X-X-gal/IPTGgal/IPTG各各各各3 3 3 3LL 1111倒置平皿，倒置平皿，倒置平皿，倒置平皿，3737培养培养培养培养1216h1216h每个平板大约每个平板大约20ml的培养基的培养基平板培养基平板培养基用用 CaCl2法制备的感受态细胞，可使每微克法制备的感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒超螺旋质粒 DNA产生产生5 106-2 107个转化菌个转化菌落。在实际工作中，每微克有落。在实际工作中，每微克有105以上的转化以上的转化菌落足以满足一般的克隆实验。菌落足以满足一般的克隆实验。结束语结束语谢谢大家聆听！谢谢大家聆听！41