仪器分析高职黄一石主编高效液相色谱法.pptx
第六章 高效液相色谱法第1页/共32页 第六章 高效液相色谱法第2页/共32页 第一节 高效液相色谱的主要类型u 高效液相色谱（HPLC）分析的分类 液固吸附色谱法 使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上的分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离；液液分配色谱法 使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离；离子交换色谱法；体积排阻色谱法；离子对色谱法；亲和色谱法；第3页/共32页 第一节 高效液相色谱的主要类型v 高效液相色谱分析的特点 能实现高效的分离;HPLC完成一次分离分析一般只需几分钟到几十分钟，比经典液相色谱快得多;灵敏度高，使HPLC的最小检测量可达10-1110-9g;能与计算机联用，自动化程度高；应用范围广，对样品的适用性广，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制；流动相可选择范围广，可通过改变流动相组成来改善分离效果；馏分容易收集，更有利于制备；第4页/共32页 第二节 高效液相色谱仪第5页/共32页 第二节 高效液相色谱仪第6页/共32页1、贮液器和吸滤器：一、一、高压输液系统高压输液系统贮液器:1-2L的玻璃瓶的玻璃瓶溶剂吸滤器:Ni合金，孔约0.45 m，防止颗粒物进行泵内。第二节 高效液相色谱仪第7页/共32页2、高压输液泵 要求流量准确可调、可调范围宽：流动相流速在0.5-2mL/min，输液泵的最大流量5-10mL/min耐高压：输出压力常达30-60MPa液流稳定。结构材料应耐化学腐蚀 第二节 高效液相色谱仪第8页/共32页 第二节 高效液相色谱仪第9页/共32页活塞型往复泵液相色谱仪中使用最广泛的恒流泵 第二节 高效液相色谱仪第10页/共32页双活塞型往复泵 第二节 高效液相色谱仪第11页/共32页离线超声波振荡脱气在线惰性气体鼓泡吹扫脱气在线真空脱气装置3、脱气装置：将相对分子量小的气体从溶剂中除去 第二节 高效液相色谱仪第12页/共32页4、梯度洗脱装置：为什么要进行梯度洗脱？使保留值相差很大的多种成分在合理的时间内全部洗脱并达到相互分离梯度洗脱：在分离过程中逐渐改变流动相组成，如溶剂的极性、离子强度、pH值等。第二节 高效液相色谱仪第13页/共32页高压梯度：用于二元梯度，用两个泵分别按设定的比例输送A和B两溶液至混合器 第二节 高效液相色谱仪第14页/共32页低压梯度：只用一个高压泵，在泵前安装了一个比例阀，混合就在比例阀中完成。第二节 高效液相色谱仪第15页/共32页二、二、进样系统进样系统将样品溶液准确送入色谱柱的装置 手动方式、自动方式 密封性好、死体积小、重复性好、进样时引起色谱系统的压力和流量波动要很小。进样器要求常用手动进样器六通阀进样器，第二节 高效液相色谱仪第16页/共32页六通阀进样LoadInject 第二节 高效液相色谱仪第17页/共32页三、三、色谱柱色谱柱柱长柱长1530cm，内径，内径45mm基质(硅胶或高分子聚合物微球)功能层(固定在基质表面对样品分子保留起实质作用的有机分子或功能团)第二节 高效液相色谱仪第18页/共32页四、检测系统 用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置。溶质性检测器溶质性检测器：仅对被分离组分理化特性响应仅对被分离组分理化特性响应紫外、荧光、电化学检测器紫外、荧光、电化学检测器总体检测器：对试样和洗脱液总理化性质响应示差折光，电导检测器 第二节 高效液相色谱仪第19页/共32页石英窗石英窗接色谱柱接色谱柱UV光电光电倍增管倍增管废液废液1、紫外检测器微量吸收池，光程为2-10mm,体积约为110 L最小检测量10-9gml-1对流量和温度波动不敏感可用于梯度洗脱。最常用的通用型检测器 第二节 高效液相色谱仪第20页/共32页光电二极管阵列检测器时间、光强度和波长三维谱 第二节 高效液相色谱仪第21页/共32页2、荧光检测器灵敏度高选择性好样品量很小适合药物和生化样品分析 第二节 高效液相色谱仪第22页/共32页3、蒸发光散射检测器适于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品的检测通用型和质量型检测器 第二节 高效液相色谱仪第23页/共32页光源光源调零调零光学零光学零参比参比样品样品平面镜平面镜透镜透镜光电转换光电转换记录仪记录仪放大器放大器遮光板遮光板溶剂相和样品+溶剂相对光的折射率不同，造成两束光强度差变化，差示信号放大记录代表样品浓度通用型检测器，灵敏度为10-7g/ml 对温度变化敏感，且不适于梯度淋洗4、示差折光检测器 第二节 高效液相色谱仪第24页/共32页接参比电极接参比电极和对电极和对电极接色谱柱接色谱柱Teflon塑料块塑料块1 cm工作电极工作电极(Pt,Au,碳糊碳糊)5、安培检测器 利用待测物在工作电极表面发生反应产生电流，此电流大小与待测物浓度成正比。流动相必须含电解质，且呈化学隋性。只能检测具有电活性的物质。第二节 高效液相色谱仪第25页/共32页五、数据处理和计算机控制系统色谱工作站在线显示自动采集处理储存自动控制 第二节 高效液相色谱仪第26页/共32页1 1、定性分析、定性分析色谱鉴定法：色谱鉴定法：保留时间对照保留时间对照化学鉴定法：化学鉴定法：利用专属化学反应对分离利用专属化学反应对分离 后收集的组分定性后收集的组分定性色谱色谱-光谱联用定性光谱联用定性 非在线色谱光谱联用法：非在线色谱光谱联用法：色谱光谱联用仪色谱光谱联用仪 第三节 高效液相色的应用第27页/共32页2 2、定量分析、定量分析外标法：外标法：外标工作曲线法、外标一点法、外标工作曲线法、外标一点法、外标二点法等外标二点法等 不需知道校正因子，但需进样量准确不需知道校正因子，但需进样量准确内标法：内标法：内标工作曲线法、内标一点法、内标工作曲线法、内标一点法、内标二点法、内标对比法内标二点法、内标对比法 第三节 高效液相色的应用第28页/共32页1、在食品分析中的应用食品营养成分分析：蛋白质、氨基酸、糖类、色素、维生素、香料、矿物质等；食品添加剂分析：甜味剂、防腐剂、着色剂、抗氧化剂等；食品污染物分析：霉菌毒素、微量元素、多环芳烃等。2、在环境分析中的应用 多环芳烃、农药（如氨基甲酸脂类）残留等。3、HPLC的应用领域 第三节 高效液相色的应用第29页/共32页3、在生命科学中的应用 分子水平上研究生命科学、遗传工程、临床化学、分子生物学等必不可少的工具低分子量物质：氨基酸、有机酸、有机胺、类固醇、卟啉、糖类、维生素等分离和测定高分子量物质：多肽、核糖核酸、蛋白质和酶的纯化、分离和测定 第三节 高效液相色的应用第30页/共32页4、在医学检验中的应用 体液中代谢物测定；药代动力学研究；临床药物监测：合成药物：抗生素、抗忧郁药、黄胺类药等天然药物：生物碱（吲哚碱、强心甙）等5、在无机分析中的应用 阳、阴离子的分析等。第三节 高效液相色的应用第31页/共32页感谢您的观看！第32页/共32页
