趋化实验.ppt
IL-8生物活性的测定 基本原理基本原理：IL-8是典型的是典型的CXC家族趋化因子，对嗜中性粒细胞和家族趋化因子，对嗜中性粒细胞和T淋巴细胞有趋化淋巴细胞有趋化作用。作用。IL-8的趋化作用没有种属特异性，因此，可以用豚鼠嗜中性粒细的趋化作用没有种属特异性，因此，可以用豚鼠嗜中性粒细胞代替人嗜中性粒细胞对其进行活性检测胞代替人嗜中性粒细胞对其进行活性检测。趋化因子诱导的细胞移动方式有两类：趋化因子诱导的细胞移动方式有两类：化学增活现象，指增强细胞的随机运动，琼脂糖小滴化学动力实验是化学增活现象，指增强细胞的随机运动，琼脂糖小滴化学动力实验是检测这种活性的比较简易，快速，重复性好的方法。检测这种活性的比较简易，快速，重复性好的方法。趋化性，指诱导细胞向趋化因子化学浓度高的方向移动。琼脂糖中的趋化性，指诱导细胞向趋化因子化学浓度高的方向移动。琼脂糖中的趋化实验和微孔小室中的趋化实验则是常用的测定细胞因子趋化活性趋化实验和微孔小室中的趋化实验则是常用的测定细胞因子趋化活性的方法。的方法。微孔小室中的趋化实验微孔小室中的趋化实验：微孔小室中的趋化实验是根据靶细胞（单核巨噬细胞，中性粒细胞微孔小室中的趋化实验是根据靶细胞（单核巨噬细胞，中性粒细胞或淋巴细胞等）能够趋化性主动迁移，穿过一定孔径的滤膜而设计或淋巴细胞等）能够趋化性主动迁移，穿过一定孔径的滤膜而设计的。滤膜将小室分隔成上下两部分。靶细胞在上面，趋化因子在下的。滤膜将小室分隔成上下两部分。靶细胞在上面，趋化因子在下面，趋化因子通过滤膜形成梯度，细胞则沿着梯度穿过膜孔，黏附在面，趋化因子通过滤膜形成梯度，细胞则沿着梯度穿过膜孔，黏附在膜的下面，计数滤膜下表面的细胞数即可测出趋化因子的趋化能力。膜的下面，计数滤膜下表面的细胞数即可测出趋化因子的趋化能力。趋化材料和趋化时间的选择趋化材料和趋化时间的选择：趋化趋化滤膜的材料和孔径需根据靶细胞的大小选择滤膜的材料和孔径需根据靶细胞的大小选择；中性粒细胞用；中性粒细胞用3m孔径的孔径的PVPF聚碳酸膜（聚碳酸膜（Polycarbonate membranes）,趋化时间为趋化时间为30分钟；单核细分钟；单核细胞用胞用8m孔径的孔径的PVPF聚碳酸膜，趋化时间为聚碳酸膜，趋化时间为90分钟；粘附力弱的淋巴细胞则分钟；粘附力弱的淋巴细胞则用表面复以明胶或纤粘素的用表面复以明胶或纤粘素的5m或或8mPVPF聚碳酸膜，以免淋巴细胞穿过膜聚碳酸膜，以免淋巴细胞穿过膜后落入下室，趋化时间为后落入下室，趋化时间为180分钟。分钟。不同趋化因子浓度的确定不同趋化因子浓度的确定：趋化因子特异活性非常高，某些趋化因子在较高浓度时促进细胞趋化因子特异活性非常高，某些趋化因子在较高浓度时促进细胞趋化的作用反而降低，所以待测样品常需连续趋化的作用反而降低，所以待测样品常需连续5倍或倍或10倍系列稀释倍系列稀释以获得最适剂量的趋化结果。每次实验都需设好对照，因为不同以获得最适剂量的趋化结果。每次实验都需设好对照，因为不同来源或活力靶细胞的趋化能力差异很大来源或活力靶细胞的趋化能力差异很大 趋化因子活性的表达方式有三种趋化因子活性的表达方式有三种，其中最常用的是用趋化指数表示，趋化指数（其中最常用的是用趋化指数表示，趋化指数（chemotactic index,CI）是指细胞迁移到待测样品液的数目和迁移到对照液的数目的比值是指细胞迁移到待测样品液的数目和迁移到对照液的数目的比值。试剂和材料试剂和材料：纯化的纯化的IL-8 注射器，离心管，移液器，注射器，离心管，移液器，Tip头头 0.17%D(+)-糖原糖原/生理盐水生理盐水 解剖器械（剪刀，镊子，止血钳）解剖器械（剪刀，镊子，止血钳）PBS,红细胞裂解液红细胞裂解液 趋化小室，趋化滤膜，细胞刮子趋化小室，趋化滤膜，细胞刮子Serum-free RPMI1640 计数板，玻璃片，显微镜，计数板，玻璃片，显微镜，甲醇，甲醇，Gimsa染色液染色液 红细胞裂解液：红细胞裂解液：豚鼠中性粒细胞，豚鼠中性粒细胞，0.17M Tris/0.16MNH4Cl液体石蜡，液体石蜡，将将10ml0.17MTris加到加到90ml 0.16M NH4Cl中，调中，调PH7.2实验程序实验程序：一豚鼠嗜中性粒细胞的制备一豚鼠嗜中性粒细胞的制备：1）取成年豚鼠）取成年豚鼠1只，腹腔注射含只，腹腔注射含0.17%糖原的生理盐水，糖原的生理盐水，13小时后，用小时后，用PBS缓冲液冲洗腹腔，收集腹腔液，缓冲液冲洗腹腔，收集腹腔液，1500rpm/min 10min,弃上清。弃上清。2）轻轻弹起沉淀，用）轻轻弹起沉淀，用3-5ml PH 7.2的的37预温的（预温的（Tris-NH4CL）红细胞溶解液，充分吹散，作用红细胞溶解液，充分吹散，作用3-5分钟，立分钟，立即加入即加入10-15ml serum-free RPMI1640,吹打均匀，吹打均匀，1500rpm/min 5min,弃上清，再加入弃上清，再加入serum-free RPMI1640,离洗两次。得到豚鼠嗜中性粒细胞，纯度可离洗两次。得到豚鼠嗜中性粒细胞，纯度可达达97%以上。以上。3）将纯化后的嗜中性粒细胞溶在）将纯化后的嗜中性粒细胞溶在serum-free RPMI 1640中，中，细胞计数，调整细胞浓度为细胞计数，调整细胞浓度为5x105/ml，备用。，备用。二样品的准备二样品的准备：将纯化的将纯化的IL-8用用PBS分别稀释为分别稀释为1000ng/ml,100ng/ml,10ng/ml,1ng/ml,0.1ng/ml。同时用稀释同时用稀释IL-8的的PBS作阴性对照。作阴性对照。（样品加入小室前最好放入（样品加入小室前最好放入37培养箱中预温，培养箱中预温，以免加样时出气泡）。以免加样时出气泡）。1 2 3 4 5 6 72IL-8(1g)PBS PBS PBS PBS PBS PBS 180l 180l 180l 180l 180l 100l 20l 20l 20l 20l 20l 20l(弃去20l)倍比稀释(1:10)倍比稀释(1:2)真核上清 PBS PBS PBS200l 100l 100l 100l100l 100l 100l 100l（弃去100l）（载体对照稀释同上）三准备底层小室，加样：三准备底层小室，加样：1）将趋化小室底层板放水平台上，）将趋化小室底层板放水平台上，NP标记位于右下方。标记位于右下方。2）将稀释好后预温的样品加入孔中，使液面微微隆起，每）将稀释好后预温的样品加入孔中，使液面微微隆起，每孔孔27l，（国产板每孔（国产板每孔25l），每个样品），每个样品3个复孔。为个复孔。为防止样品过度蒸发，整个加样过程应不超过防止样品过度蒸发，整个加样过程应不超过5分钟。分钟。3）将适当孔径的滤膜取出，在滤膜的一角剪去）将适当孔径的滤膜取出，在滤膜的一角剪去1mm的小的小角，缺角对角，缺角对 着着NP标记，分别用镊子夹住滤膜两端，水平标记，分别用镊子夹住滤膜两端，水平下降，中间部位最先接触小室液面，将膜平放在加完样的下降，中间部位最先接触小室液面，将膜平放在加完样的底层板上。底层板上。4）铺上硅胶垫，装上上层板，硅胶垫的缺角及上层板的）铺上硅胶垫，装上上层板，硅胶垫的缺角及上层板的NP标记位于右下方。装上螺丝，拧紧装置。标记位于右下方。装上螺丝，拧紧装置。四加入细胞四加入细胞：1）将已稀释好的细胞悬液加入上层小孔中，每孔）将已稀释好的细胞悬液加入上层小孔中，每孔50l，加样时微量加样，加样时微量加样器器Tip头贴着小孔壁，头贴着小孔壁，Tip头末端恰好位于滤膜稍上方，垂直快速加样，头末端恰好位于滤膜稍上方，垂直快速加样，避免孔底滞留气泡，（注意这一步加样过程中一定不要有气泡形成）。避免孔底滞留气泡，（注意这一步加样过程中一定不要有气泡形成）。2）检查上层液体中是否有气泡，一个比较简便的方法是观察小孔凸的反）检查上层液体中是否有气泡，一个比较简便的方法是观察小孔凸的反射光，如果小孔上方有一个异常大的凸液面，通常表明有滞留气泡。解射光，如果小孔上方有一个异常大的凸液面，通常表明有滞留气泡。解决的办法是用决的办法是用Tip头将孔中的液体吸干净，重新加样头将孔中的液体吸干净，重新加样。五孵育五孵育：将趋化小室放入将趋化小室放入37 5%CO2孵箱中，孵育孵箱中，孵育30分钟。分钟。六取出滤膜，清洗，染色六取出滤膜，清洗，染色：1)取出滤膜，拧下螺帽，将整个小室倒置，托着上层板的四角，取出滤膜，拧下螺帽，将整个小室倒置，托着上层板的四角，将小室慢慢地水平放在纸巾上，卸下下层板。将小室慢慢地水平放在纸巾上，卸下下层板。2)清洗，迁移细胞现位于滤膜朝上的一面，此面称为细胞面，另清洗，迁移细胞现位于滤膜朝上的一面，此面称为细胞面，另一面为一面为 非细胞面，用镊子夹起滤膜的一角，然后用大塑料夹夹非细胞面，用镊子夹起滤膜的一角，然后用大塑料夹夹住滤膜这一端距边缘住滤膜这一端距边缘1mm的宽度，拎起滤膜，迅速用塑料夹夹的宽度，拎起滤膜，迅速用塑料夹夹住滤膜另一端。在盛有住滤膜另一端。在盛有PBS缓冲液的平皿中沾湿非细胞面，注缓冲液的平皿中沾湿非细胞面，注意细胞面不要接触到意细胞面不要接触到PBS。3)在细胞刮上刮去非细胞面上的细胞，靠近大夹子处的滤膜先接在细胞刮上刮去非细胞面上的细胞，靠近大夹子处的滤膜先接 触细胞刮，在与细胞刮成触细胞刮，在与细胞刮成30度角方向轻轻上拉，该过程重复两度角方向轻轻上拉，该过程重复两 次。次。4)固定，小心将滤膜浸入甲醇中，室温固定，小心将滤膜浸入甲醇中，室温3分钟，将滤膜取出，用塑分钟，将滤膜取出，用塑 料夹夹住，自然干燥。料夹夹住，自然干燥。5)染色，将固定后的滤膜在染色，将固定后的滤膜在Gimsa染色液中染色染色液中染色30分钟，自来水分钟，自来水冲洗，置于玻片上，显微镜下观察。冲洗，置于玻片上，显微镜下观察。6)计数，在高倍镜下，每孔随机选取计数，在高倍镜下，每孔随机选取5个视野，累积细胞数，算出个视野，累积细胞数，算出三个复孔的平均值。作为该稀释度的迁移细胞数。三个复孔的平均值。作为该稀释度的迁移细胞数。IL-8组趋化的细胞数与缓冲液对照组中趋化细胞组趋化的细胞数与缓冲液对照组中趋化细胞 数的比值即为趋化指数，趋化指数大于数的比值即为趋化指数，趋化指数大于2有意有意 义义。技术要点技术要点：1）.分离纯化嗜中性粒细胞时，要仔细认真保证细胞活力。分离纯化嗜中性粒细胞时，要仔细认真保证细胞活力。2）.每次做实验均要设阴性对照，用真核细胞转染上清做趋每次做实验均要设阴性对照，用真核细胞转染上清做趋 化实验时，要设空载体转染上清做阴性对照。化实验时，要设空载体转染上清做阴性对照。3）.向趋化小室下孔中加样品时，上样量要适中，使之能形向趋化小室下孔中加样品时，上样量要适中，使之能形 成稍微隆起的液面，既能防止气泡形成，又可以防止样成稍微隆起的液面，既能防止气泡形成，又可以防止样 品发生交叉污染品发生交叉污染 4）.每个样品要做三个复孔。每个样品要做三个复孔。5）.放膜时要对准位置，过多调整位置，易发生交叉污染。放膜时要对准位置，过多调整位置，易发生交叉污染。6）.洗膜时注意，不要把细胞面与非细胞面弄反。洗膜时注意，不要把细胞面与非细胞面弄反。7）.不同趋化因子的趋化谱不同，用不同细胞做趋化反时，不同趋化因子的趋化谱不同，用不同细胞做趋化反时，应选用不同孔径的滤膜、不同的细胞浓度和不同的趋应选用不同孔径的滤膜、不同的细胞浓度和不同的趋 化时间。化时间。8）.做实验前做实验前要把小室洗净、要把小室洗净、晾干。晾干。
