初探两种方法提取短翅豆芫菁体内斑蝥素含量--化学与应用化学本科学位论文.doc

学科代码：070302 学 号：095704010033 贵 州 师 范 大 学（本 科）毕 业 论 文 题 目：初探两种方法提取短翅豆芫菁体内斑蝥素含量 学 院： 化学与材料科学学院 专 业： 应用化学 年 级： 2009级 姓 名： 指导教师： 完成时间： 2013年4月18日初探两种方法提取短翅豆芫菁体内斑蝥素含量 摘要：斑蝥在我国很早以前就被发现并使用，最早于公元前168年，斑蝥虫就在我国作为药材应用，且有非常高的药用价值，距今已经2200年的历史。研究表明，短翅豆芫菁体内含有大量的斑蝥素。为了摸清哪种方法更适用于提取短翅豆芫菁体内的斑蝥素，作者亲自下田捕捉短翅豆芫菁数天、进行人工饲养并使用了两种不同方法对短翅豆芫菁含量的提取并测定。方法：索式提取法、冷浸提取法提取斑蝥，采用高相液相色谱测定斑蝥中斑蝥素的含量，结果表明索式提取法提取的斑蝥，斑蝥素含量高。结论，索式提取法提取效率高，并且简单、稳定、可行。关键词：斑蝥、斑蝥素、短翅豆芫菁、索式提取法、高相液相色谱Two methods for extraction of Epicauta aptera Kaszab cantharidin in contentAbstract：The beetle have been found and used very early in our country , as early as 168 B.C. cantharis as a medicinal application in our country , the medicinal value is very high, it has been the history of 2200 years. Research shows that, Epicauta aptera Kaszab body contains a lot of cantharidin.In order to find out what kind of method is more suitable for the extraction of Epicauta aptera Kaszab in vivo cantharidin, the author personally went into the fields to capture Epicauta aptera Kaszab days in captivity, and use two different methods for determination of Epicauta aptera Kaszab content.Methods: the application of Soxhlet extraction method, extraction of cantharidin cold invasion, and using the method of HPLC determinate cantharidin in Mylabris, the result is that Soxhlet extraction method extracted cantharidin cantharidin content high.Conclusion that the extraction, Soxhlet extraction method with high efficiency, and simple, stable, feasible.Keywords：Cantharidin,cantharidinEpicauta aptera Kaszab,Soxhlet extraction method, HPLC引言 随着社会的飞速发展，人类的生活水平不断提高。与此同时，很多疾病也伴随着出现，不仅仅是以前常见的那些症状，而更常见的，是很多医学专家都素手无策的疾病如癌症、很多皮肤性溃烂等疑难杂症，医学家们不得不把目光转向传统的医学宝库。此时，利用我国传统的医学药方也就势在必行。斑蝥素是我国经典药方的配方之一，是我国宝贵的医学宝库的组成部分，然而我国斑蝥素的需求远远是供不应求的，人类合成的斑蝥素是否具有预期的药用价值，目前还在探索之中，此时，从短翅豆芫菁体内提取斑蝥素便是得到斑蝥素的途径之一。随着资源的不断匮乏，怎样选择高效的提取方法是目前解决这个难题的唯一途径！1 概述1.1 斑蝥素的历史斑蝥虫在我国作为药材应用已经有很悠久的历史了，最早是见于五十二病方（公元前168年，1972年出土于马王堆汉墓）1，距今已经达到2200年。短翅豆芫菁体内有利用价值的成分为即为斑蝥素，足以知道斑蝥在中国发迹史时间较早，而且运用广泛。在后来的本草经疏一书中曾经提到；斑蝥：近人肌肉则溃烂，毒可知矣。性能伤肌肉，蚀死肌，故主鼠瘘疽疮疥癣。辛寒能走散下泄，故主破石癃血积及堕胎也。甄权主瘰疬，通利水道，以其能追逐肠胃垢腻，复能破结走下窍也。斑蝥，性有大毒，能溃烂人肌肉，惟瘰疬、癫犬咬或可如法暂施，此物若煅之存性，犹能啮人肠胃，发泡溃烂致死，即前二证亦不若用米同炒，取气而勿用质为稳，余证必不可饵2。 19世纪采集斑蝥的情况古希腊时期，医学家希波克拉底早在记载西班牙苍蝇的药效，而斑蝥的翅亦会用作研制消退水泡的膏布，并用作抗刺激药。在古代的中国，曾出现世上首个有记录的臭弹，就是以这些斑蝥昆虫类，混合砒霜、附子和人类的粪便而成。在桑特利亚，这些斑蝥则会用作制香。1.2 斑蝥资源现状 在我国的很多地方，都存在着不同类型的斑蝥虫，主要产于河南、广西、安徽、江苏、湖南、贵州等省3，分布不同，体型也不太一致，所以名称也不相同，在贵州山村，就有一种黑身红头的甲虫（即短翅豆芫菁），是治疗“庥子”的药方，因此又叫庥子虫，也就是短翅豆芫菁，它是昆虫纲的芫菁科昆虫，体长13.5-20mm，体宽5-8mm，身体呈黑色，头部呈暗红色。头部刻点细小而稀；触角基部有一对光滑的瘤，身体颜色相同。触角呈丝状，长度大约是身体的一半。前胸的长度和宽度大致相等。喜欢群体生活在半湿半干、通风、水草丰富的农田里面，而且喜欢晴天出行，易于捕捉。1.3 斑蝥素的应用价值 庥子是一种皮肤细胞失控变异后生成的肿瘤，不易医治。但用短翅豆芫菁的体液敷在挑破出血的庥子上，庥子干枯脱落，其他正常细胞不受影响，病变皮肤细胞完全恢复正常。整个治疗过程只有失控变异的细胞被杀死，而正常细胞不受半点影响4。这说明斑蝥虫的体液对失控变异的皮肤细胞有“靶向治疗”的效果。就因为有这一效果，所以斑蝥素对癌症有很好的治疗作用主要用于肝癌、乳腺癌、肺癌、食管癌、结肠癌等治疗。癌症，这被视为不治之症的疾病，其实只要用对药也是可以治疗的。现在随着各类疾病的增加，人类对斑蝥素的需求却日益迫切，从斑蝥虫体内提取斑蝥素成为取得斑蝥素的主要途径。然而斑蝥素本身对人体剧毒，对人的致死量为10mg/人，这又对使用斑蝥素对疾病进行治疗有了更高的要求。因为对于斑蝥服用过多，可能导致呕吐，腹泻等症状，更严重者会出现心脏、肾衰竭现象5。 医学报告表明：斑蝥素对人体有很大的刺激作用，吞服以后，它就去到膀胱并且随尿液排出，当它流过时，使得膀胱和尿道产生一种如焚如烧的感觉，由于反射作用而刺激了性器官。另外，斑蝥素属剧毒药，如果滥用、超量应用、与酒蒜同用、生用(或泡制不当)、外用面积过大、蓄积、肝肾功能不全、冲服会引起中毒，中毒剂量为0.6g，致死剂量为1.5g；斑蝥素0.14ug能诱发皮肤起泡，10mg可产生严重中毒或致死，给临床应用带来麻烦6。所以对斑蝥素的利用要求又有了很大的提高，所以只能提取较为纯净的斑蝥素，才能合理估计作为药物的用量。此次试验正是为了提取纯度更高的斑蝥素，进一步分析斑蝥素的药用价值，以期待斑蝥素在各方面都发挥着重要的作用为最终目标7。2 短翅豆芫菁的野外捕捉及养殖2.1 短翅豆芫菁的野外捕捉 捕捉条件：应在晴朗的天气，水草丰富的地方。工具：大型矿泉水瓶数个，应先打好数十个小孔使之很好的透气，但孔不应过大，防止斑蝥虫从里面爬出，应在矿泉水瓶里面加入适当的马兰头。一、是为了让短翅豆芫菁有足够的食物，不至于饿死。二、是为了使每只短翅豆芫菁尽可能地分开，不至于相互挤压而死。除此之外，每瓶放置的斑蝥虫不应多过100只，是为了让每只斑蝥虫都有足够的空间。 应准备保护自己的工具，口罩、手套、雨伞。捕捉地点：花溪区春江科技园附近稻田、花溪区北极熊矿泉水厂附近稻田、青岩。 图21隐藏在草丛里面的短翅豆芫菁 图22正在取食的短翅豆芫菁2.2 短翅豆芫菁的分布调查 调查地点：织金县普翁乡调查方法：作者对织金县普翁乡各村进行调查，得出以下数据表表2.1 织金县普翁乡各村斑蝥虫分布调查表（只数/天） 天数村 别 第一天第二天第三天总和白岩脚村17101946普纳翁村1418941杨柳河村26203177五星村118928白泥坡村0000新峰村6039大街村6151435龙潭村139729化落村714324新民村0000小龙场村0000狗场坝村0112 在普翁乡，也有不同形式的地势情况，也有的地方水草丰富，有的地方几乎常年干旱，如白泥坡村、新民村、小龙场村和狗场坝村就是农村所说的“高山”，水源极其少，农民生活用水尚且困难，更本没有多余的水作为稻田用水，而且山势相当高主要以岩石山为主，农作物主要是玉米，作者在这些地方三天几乎都没有捉到短翅豆芫菁，短翅豆芫菁数目极其少，说明短翅豆芫菁不喜欢生活在这些水草不丰富、没有稻田地方。另一方面在杨柳河村、大街村、白岩脚村等地，水草丰富，马兰、西红柿长得好的地方，有相对多的短翅豆芫菁出没，而且主要以群体方式出现，这一现象表明短翅豆芫菁比较喜欢生活在水草丰富、食物充足的稻田附近。第三，在普纳翁村、五星村、龙潭村、化落村一带，这些地方水草一般，稻田也不是很多，但是大部分地方阳光并不充分，只有小部分稻田，且大部分被村落的竹林、树林遮住阳光，有部分短翅豆芫菁。三种现象说明，短翅豆芫菁生活条件是，不只要食物充足，水草丰富，还应有足够的阳光。2.3 短翅豆芫菁的人工养殖我们将捕捉回来的短翅豆芫菁放在实验室的养殖箱内（如图23），养殖箱内的土壤则是来自花溪区春江科技园附近稻田附近，我们取来之后将其消毒，在进行短翅豆芫菁的饲养，食物则是来源校园内外的马兰，我们每天都会向养殖箱内放入新鲜、洗净的马兰（如图24），而且每隔6小时换一次，结果发现，斑蝥虫的取食习惯，都是从较嫩的马兰尖端开始取食，后面才会去吃那些比较老化的马兰叶子。而水则是来自重点实验室的自来水，自来水是每六个小时换一次，根据实验室条件考察每天温度、食物对斑蝥虫生活的的影响。结果发现，七八月份的时候，短翅豆芫菁生活的很好，很少有死亡现象，但每天都会发现，在养殖箱里面，光线强的一面，斑蝥虫总是多于另一面，而且交配数目也相对比另一面多得多。每天都有不同数量的短翅豆芫菁死去，但是我们可以发现，九月份以前，短翅豆芫菁的死亡现象还是很少的，九月中旬以后，死亡率大大增加，十月份上旬，斑蝥虫已经全部死完8。 图23正在求偶的短翅豆芫菁 图24洗净的马兰2.4 短翅豆芫菁生活习性的探究 根据2.2中的数据显示斑蝥虫在普翁乡分布较少，并从表格得出，凡是斑蝥虫食物丰富、水草充足、阳光明媚的地方（见图25），斑蝥虫就会相对多一些，所以得出结论，斑蝥虫喜欢在水草丰富、食物充足、阳光明媚的地方。然而，斑蝥虫生活和繁殖的季节也是相当讲究，大约于七月份至九月中旬，经常发现短翅豆芫菁是群体生活在一起，而这段时间，是阳光最充足的时间段，也是马兰、西红柿、何首乌等短翅豆芫菁食物长得最好的时间。根据实验室观察到的情况，这段时间里，短翅豆芫菁交配的次数平凡（见图26），且产卵很快，所以作者认为，在这段时间里，应是短翅豆芫菁生活和繁殖后代的最佳时节9。 实验室结果也表明，其他条件相同的情况下，九月中旬以后，随着天气的逐渐变冷，每天死亡的短翅豆芫菁数目逐步增多。可见，短翅豆芫菁对季节的要求相当严格，对温度相当敏感。 图25在稻草叶上的短翅豆芫菁 图26验室混合饲养的短翅豆芫菁 3 使用不同方法测定短翅豆芫菁体内斑蝥素的含量3.1 短翅豆芫菁中斑蝥素提取方法的选定3.1.1 从短翅豆芫菁体内提取斑蝥素的方法 测定短翅豆芫菁的方法有很多，作者从不同文献资料中查阅到，索氏提取法、超声波提取法、冷浸提取法等多种不同的方法10、11。作者认为，使用什么方法并不是一定的，方法的好与不好，不是方法有多先进，效率有多高，更重要的是要实际、可行。根据不同的实验环境可酌情选用不同的试验方法。作者查阅过大量的从短翅豆芫菁体内提取斑蝥素的文献12，结合实验室条件，分别选用了冷浸提取法、索氏提取法对短翅豆芫菁体内的斑蝥素进行提取。3.1.2 选用索氏提取法的原因1、选择性好，索式萃取法13的选择性主要取决于目标物质和溶剂性质的相似性。萃取剂可用二硫化碳、苯、甲醇等。通常的做法是将萃取剂按照极性不同的顺序进行多级萃取。从而提高了产品的萃取纯度；将不同类的物质分别萃取出来。2、能耗低，由于索式萃取是直接对萃取剂进行加热，选用的萃取剂一般沸点都较低，从根本上保证了能量的快速传导和充分利用。而且萃取剂是在索式萃取器中循环利用的，这既减少了溶剂用量，又缩短了操作时间，大大降低了能耗。3、设备简单、操作简便不同的分离方法有不同的操作方法，对应的实验设备也各有不同。但索式萃取的设备简单、操作简便。且其造价低，体积小，适于实验室应用。3.1.3 选用冷浸法的原因 冷浸提取法14方法简单。试验时间又不过长，试验不受空间和规模的限制，萃取剂主要用丙酮。通常的做法是将萃取剂按照极性不同的顺序进行多级萃取。从而提高了产品的萃取纯度，将不同类的物质分别萃取出来。但是由于实验室的条件和本身时间的影响，我们只采用了一级萃取；3、设备简单、操作简便不同的分离方法有不同的操作方法，对应的实验设备也各有不同。但索式萃取的设备简单、操作简便。且其造价低，体积小，适于实验室应用。2、能耗低，由于冷浸法是直接将待萃取物用纸包好之后用萃取剂使之浸没，从而使斑蝥素被提取出来，溶解在甲醇里面，耗能小。且选用的丙酮沸点较低，蒸去丙酮时方便快捷，而且耗能不会太大。 3.2 使用冷浸法提取短翅豆芫菁体内的斑蝥素 实验原理：斑蝥素物理性质为斜方形鳞状晶体，难溶于水，易溶于丙酮、氯仿、乙醚及醋酸乙酯斑蝥素易溶于有机物，使之溶于丙酮之后易于分离，丙酮易挥发，从而可以得到斑蝥素，斑蝥素化学名称为：六氢-3a,7a-二甲基-4,7-环氧异苯并呋喃-1,3-二酮， 斑蝥素的化学结构为： 图31斑蝥素的化学结构 使用仪器：电子天平、小号滤纸、锥形瓶、量筒、漏斗、圆底烧瓶、旋蒸仪。实验步骤：1、 斑蝥素标准品：准确称取斑蝥素标准品10mg于10mL容量瓶中，用分析纯甲醇定容至刻度，得到1mg/mL的斑蝥素标准样品。 2、样品制备 （1）取1克干燥的短翅豆芫菁，将其完全捣碎，准确称取其质量。 （2）将准确称取好的短翅豆芫菁粉末全部倒入150ml的锥形瓶中，再用量筒量取40ml的丙酮，将其倒入锥形瓶中，使之完全浸没。 （3）用手连续摇动锥形瓶大约30min，这时候发现丙酮颜色开始由无色变为浅黄色，接着再由浅黄色逐渐变为深黄色。 （4）将其静置6小时。 （5）静置6小时后，其静置液体将变成深黄色，过滤，洗涤锥形瓶数次，并进行过滤。 （6）过滤完全之后，使用旋蒸蒸发仪蒸发样品（70），蒸发至剩余液体总量大约在1ml2ml时。 （7）将其液体转移到5ml的容量瓶中，使用甲醇少量多次地洗涤圆底烧瓶，并将每次的洗涤液都转移到5ml的圆底烧瓶中，再使用甲醇准确定容。 （8）将上述实验做三次平行试验，分别编号，备用。3.3 使用索氏提取法提取短翅豆芫菁体内的斑蝥素 实验原理：斑蝥素易溶于有机物，使之溶于丙酮之后易于分离，丙酮易挥发，从而可以得到斑蝥素. 使用仪器：电子天平、滤纸、脂肪提取器、恒温水箱、圆底烧瓶、旋蒸仪。实验步骤： 1、取1克干燥的短翅豆芫菁，将其完全捣碎，准确称取其质量。 2、将称量好的短翅豆芫菁粉末用滤纸包好，然后将其放在索式提取器中。 3、取丙酮70ml，氯仿7ml，加一滴浓HCI于150ml的烧瓶中，连接装置。 4、水浴连续加热12小时。 5、回流结束后，过滤。6、将滤液转移至旋转蒸发仪，在70将样品旋蒸至1-2ml，将剩下的液体过柱（柱子的成分：硫酸钠和碳酸钠）。过柱的目的：除去样品中的盐酸和水。 7、将样品再次转移到旋转蒸发仪上旋蒸至1-2ml，将剩下的液体转移到5ml的量瓶内，用极少量的甲醇洗涤烧瓶，最后用甲醇定容。 8、将上述实验做三次平行试验，分别编号，备用。3.4 两种方法提取斑蝥素的含量比较3.4.1 索氏提取法提取得到的斑蝥素含量计算色谱条件：Waters公司Symmetry C18柱（5um 4.6×250mm），柱温：30，流速1ml/min，甲醇：水=28:72 ；检测波长：230nm。现将我们准备好的标准试液进样到高效液相色谱仪，打出相应的谱图。 再根据3.2实验所得试验样品6份，将样品分别进样到高效液相色谱仪，得出色谱图，并与标准谱图相比对照，计算出峰面积之比，从而计算出含量。根据实验得到的结果，得出结论，见下表1。提取方法 编 号干燥虫体质量（g）索氏提取法得到斑蝥素的质量（mg）斑蝥素占总体的含量%10.9675191221.9821.0427207301.9931.0108193381.9141.0580217302.0550.9984208502.0961.1085214361.93平均1.0309205341.99表1索氏提取法提取短翅豆芫菁体内斑蝥素含量3.4.2 冷浸提取法提取得到的斑蝥素含量计算我们使用标准图谱进行比较，使用上述的方法，根据3.3实验所得试验样品6份，分别进样于高效液相色谱仪，可以得出下列结论，见下表2。提取方法 编 号干燥虫体质量（g）冷浸提取法得到斑蝥素的质量（mg）斑蝥素占总体的含量%10.988996910.9821.1008221262.0131.1837208331.7641.0911175501.6050.9583129371.3561.0528196421.87平均1.0626171301.61 表2冷浸提取法提取短翅豆芫菁体内斑蝥素含量 3.4.3 两种方法提取斑蝥素的含量比较 从上面的所得的实验数据，我们已经可以知道：相同的实验条件下，使用索氏提取法提取的到的斑蝥较冷浸提取法提取得到的斑蝥素含量要多，而且从图表我们可以观察到，相同几次平行试验中，索氏提取法提取得到的斑蝥素量变化不大，较冷浸提取法相对稳定些。根据我们实验的得到的数据，可以作出下列柱形图进一步比较如下图32、图33图32索氏提取法法提取斑蝥素的含量图33冷浸提取法法提取斑蝥素的含量3.4.4 两种方法的总结从表1、表2，还有柱形图的比较我们可以分析到，使用索氏提取法从短翅豆芫菁体内提取斑蝥素，提取的量相对稳定，而且量较多。实验用品回收率高，减小对环境的污染，是从短翅豆芫菁体内提取斑蝥素实验中，比较合理、高效的提取方法。而使用冷浸提取法提取斑蝥素的方法得到的产品相对较少，而且产量在平行实验中相对较不稳定，不宜选用。4 展望斑蝥素具有很高的药用价值，对很多疑难杂症都很有很好的治疗作用。目前医药学界的研究，在艾滋病、癌症等疑难病症面前还是束手无策，医学专家们不得不把目光转向我国传统的医学宝库。都希望在这个医学宝库中，挖掘出新的药物来解决人类发展面临的健康问题。然而斑蝥素资源对人类的需求也是越来越不供不应求，而人工合成斑蝥素的难度又相当高，所以使用高效的提取方法对短翅豆芫菁体内斑蝥素的提取显得尤为重要。是否能够人工合成这种短翅豆芫菁体内的斑蝥素，人工合成的斑蝥素对人体皮肤恶性肿瘤细胞是否具有相同的杀灭作用？能不能根据其药物作用机理发现或启发模仿出新的药物或新的肿瘤治疗方法？这一直都是医学界面临的重大问题。在这个资源匮乏之际，我们只有尽量使用有限的资源。所以我们不得不尽量使用高效的提取方法，尽可能多的提取到有效成分，然而我们现在的提取方法还应该有效地提高。从短翅豆芫菁体内提取斑蝥素的方法还有待于进一步探讨。本人此次初步探究了使用冷浸法、索氏提取法从短翅豆芫菁体内提取斑蝥素，由于本人研究水平的局限，加上时间的限制，所以选择方法是否最佳，效果是否最好能等诸多问题，还留待以后进一步的探讨！参考文献1 谭娟杰, 邓正已,章有为等.中国药用甲虫芫菁科的资源考察与利用J.昆虫学报,1995, 38(3):324-331.2孙伟芬，黄伟贤，王惠杰，李毅俊.斑蝥酸钠注射液治疗晚期癌症的临床观察J中国医院药学杂志,2001,21:427.3李晓飞, 陈祥盛, 侯晓晖. 贵州产斑蝥素芫菁科、蜡蝉科昆虫名录与种类鉴定J. 山地农业生物学报,2008,271:79-82.4杨月伟，张培玉斑蝥的药用研究及其开发J资源开发与市场，1999，15(6)：326-327. 5赵聚山，陈璇去甲斑蝥素对体外两种肿瘤细胞生长的影响J辽宁中医杂志，2004，31(2)：157-158. 6SangJL,LiXZ,ZhangHJ.Apoptosisof breast cancer cell MCF-7 induced by norcantharidin(NCTD)J.CellResearch,2002,12(3-4):275.7杨军，丁敏，张太君，郭渝，宋自阆，曹永艳血清药理学方法观察复方斑蝥胶囊对人肝癌细胞SMMC-772增殖的影响J中国药房，2005，16：262-264. 8 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最后，我要感谢我的毕业论文伙伴罗小荣、胡志攀、陈梽、张弯弯、李岩岩、杨标、李发虎。捉虫、实验过程中都得于同学们的相互照顾，这里一并表示感谢！附图 图27 短翅豆芫菁抓捕稻田 图28 正在取食马兰的短翅豆芫菁图29 罗小荣、李岩岩正在捕捉虫体 图210 更喜欢吃花的短翅豆芫菁 图211 假死状态下的虫体 图212 虫体正在取食西红柿 图213 辣椒叶子上的庥子虫 图214 短翅豆芫菁在西红柿上图215罗小荣正在人工养殖短翅豆芫菁 图216普翁乡捕捉短翅豆芫菁稻田图217普翁乡捕捉短翅豆芫菁草丛 图218刘春志正在捕捉短翅豆芫菁14