生物化学--绪论、蛋白质.ppt

食 品 生 物 化 学Food Biochemistry食品生物化学讲授内容n n第一章 绪论 n n第二章 蛋白质n n第三章 核酸的化学n n第四章 维生素n n第五章 酶n n第六章 生物氧化n n第七章 糖类代谢n n第八章 脂类代谢n n第九章 含氮小分子代谢n n第十章 核酸及蛋白质的生物合成n n第十一章 物质代谢的关系与调节控制 n n第十二章 基因工程简介n n生物化学的概念：生物化学是在分子水平上研究生物体的化学本质及生命活动中化学变化规律的科学n n生物化学分类：n n按照研究对象：动物、植物、微生物，总称为普通生物化学(general biochemistry)n n按照应用领域：医学、食品、农业、工业等n n按照研究领域：免疫、分化、进化等第一章第一章 绪论绪论n n生物化学的研究内容n n静态生化：各种生命物质（糖、脂、蛋白质、核酸、酶、维生素、激素等）的组成、结构、性质等n n动态生化：生命物质代谢与能量代谢n n功能生化：生命物质的结构与功能的关系及对代谢的影响n n生物化学与其它学科的关系n n生物化学是一门交叉学科，从化学、营养学、生理学、微生物学、遗传学、细胞生物学等发展起来，并促进了这些学科的发展n n生物化学也是一门独立的科学，主要研究生物分子的结构、反应，如酶和生物催化过程、代谢途径及其控制、生命信息传递等过程的化学作用机理，揭示了生物分子作用的本质规律n n生物化学的学科地位和重要性n n生物化学揭示了生物分子作用的本质规律n n生物化学是生命科学的基础与核心n n生物化学是生物学革命的新工具n n生物化学就不只是一门理论科学，而更是一门实验科学 生物化学的发展生物化学的发展 在这些分子中在这些分子中在这些分子中在这些分子中,对脂类的研究最早对脂类的研究最早对脂类的研究最早对脂类的研究最早,19,19,19,19世纪上半世纪上半世纪上半世纪上半叶对其结构就有了较深入的理解。对糖的结构的叶对其结构就有了较深入的理解。对糖的结构的叶对其结构就有了较深入的理解。对糖的结构的叶对其结构就有了较深入的理解。对糖的结构的认识多半要归功于认识多半要归功于认识多半要归功于认识多半要归功于Emil FischerEmil FischerEmil FischerEmil Fischer从从从从1884188418841884年开始的年开始的年开始的年开始的研究工作。而发酵工业的发展研究工作。而发酵工业的发展研究工作。而发酵工业的发展研究工作。而发酵工业的发展,使酶学和代谢学有使酶学和代谢学有使酶学和代谢学有使酶学和代谢学有了发展了发展了发展了发展,化学与医学、生理学的结合则导致了维化学与医学、生理学的结合则导致了维化学与医学、生理学的结合则导致了维化学与医学、生理学的结合则导致了维生素生素生素生素,激素激素激素激素,必需氨基酸和必需脂肪酸的发现。对必需氨基酸和必需脂肪酸的发现。对必需氨基酸和必需脂肪酸的发现。对必需氨基酸和必需脂肪酸的发现。对核酸的认识起步较晚核酸的认识起步较晚核酸的认识起步较晚核酸的认识起步较晚,在在在在1870187018701870左右才注意到其存左右才注意到其存左右才注意到其存左右才注意到其存在在在在,19,19,19,19世纪末又是世纪末又是世纪末又是世纪末又是Emil FischerEmil FischerEmil FischerEmil Fischer对嘌啉进行了较对嘌啉进行了较对嘌啉进行了较对嘌啉进行了较深入的研究深入的研究深入的研究深入的研究,成为我们对核酸结构理解的开始。成为我们对核酸结构理解的开始。成为我们对核酸结构理解的开始。成为我们对核酸结构理解的开始。生物化学在生物化学在生物化学在生物化学在1920192019201920年以后开始进入高速发展期。年以后开始进入高速发展期。年以后开始进入高速发展期。年以后开始进入高速发展期。1897189718971897年年年年 Buchner Buchner Buchner Buchner 发现酵母细胞质能使糖发酵发现酵母细胞质能使糖发酵发现酵母细胞质能使糖发酵发现酵母细胞质能使糖发酵1902190219021902年年年年 Fischer Fischer Fischer Fischer 肽键理论肽键理论肽键理论肽键理论1926192619261926年年年年 SumnerSumnerSumnerSumner结晶得到了脲酶结晶得到了脲酶结晶得到了脲酶结晶得到了脲酶,证明酶就是蛋白质证明酶就是蛋白质证明酶就是蛋白质证明酶就是蛋白质1935193519351935年年年年 SchneiderSchneiderSchneiderSchneider将同位素应用于代谢的研究将同位素应用于代谢的研究将同位素应用于代谢的研究将同位素应用于代谢的研究 1944194419441944年年年年 AveryAveryAveryAvery等人证明遗传信息在核酸上等人证明遗传信息在核酸上等人证明遗传信息在核酸上等人证明遗传信息在核酸上 1953195319531953年年年年 SangerSangerSangerSanger的胰岛素氨基酸序列测定的胰岛素氨基酸序列测定的胰岛素氨基酸序列测定的胰岛素氨基酸序列测定 Waston-CrickWaston-CrickWaston-CrickWaston-Crick提出提出提出提出DNADNADNADNA双螺旋模型双螺旋模型双螺旋模型双螺旋模型 1958195819581958年年年年 PerutzPerutzPerutzPerutz等解明肌红蛋白的立体结构等解明肌红蛋白的立体结构等解明肌红蛋白的立体结构等解明肌红蛋白的立体结构 1970197019701970年年年年 发现了发现了发现了发现了DNADNADNADNA限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶 1972197219721972年年年年 DNADNADNADNA重组技术的建立重组技术的建立重组技术的建立重组技术的建立 1978197819781978年年年年 DNADNADNADNA双脱氧测序法的成功双脱氧测序法的成功双脱氧测序法的成功双脱氧测序法的成功1990199019901990年年年年 人类基因组计划的实施人类基因组计划的实施人类基因组计划的实施人类基因组计划的实施,2001,2001,2001,2001年完成年完成年完成年完成,进入进入进入进入 后基因组时代后基因组时代后基因组时代后基因组时代生物化学重大发展年代表生物化学重大发展年代表我国生物化学重大发展年代表我国生物化学重大发展年代表l l1965年年 我国首次人工合成牛胰岛素我国首次人工合成牛胰岛素l l1981年年 我国合成酵母丙氨酸我国合成酵母丙氨酸tRNAl l1982年年 我国合成脑啡肽我国合成脑啡肽Recommended Readingl l沈同.生物化学.高等教育出版社.l l李庆章.生物化学.中国农业出版社.l l王镜岩.生物化学.高等教育出版社.l l现代生物学精要速览-生物化学（英文-影印版）.科学出版社.第二章第二章 蛋白质蛋白质n n第一节 蛋白质通论n n第二节 氨基酸n n第三节 肽n n第四节 蛋白质结构与功能n n第五节 蛋白质的性质第一节 蛋白质通论n n一 蛋白质概述n n1 蛋白质(protein)(protein)：18831883年命名，来源于希腊语n n2 重要性：凡有生命必有蛋白质，蛋白质是生命的体现者。蛋白质是结构功能最多、最活跃的分子，几乎在一切生命活动中起关键作用。n n 3 元素组成n n蛋白质主要元素组成：蛋白质主要元素组成：C C、H H、OO、N N、S S 及及 P P、FeFe、CuCu、ZnZn、MnMn、I I、SeSe 等微量元素等微量元素 n n n n 6.256.25为蛋白质系数为蛋白质系数 蛋蛋白白质质平平均均含含N N量量为为1616,这这是是凯凯氏氏 (Kjeldahl)(Kjeldahl)定定氮氮法法测测蛋蛋白白质质含含量量的的理理论论依据：依据：蛋白质含量蛋白质含蛋白质含量蛋白质含N N量量6.256.25n n二 蛋白质的分类n n1 分类依据：蛋白质不能按化学结构分类（尽管结构与功能关系密切，但已知结构少）n n2 三种分类方法（根据蛋白质分子形状、根据蛋白质组成、根据蛋白质的溶解性质）：按组成分类是常用的分类方法n n （1 1）根据分子形状）根据分子形状n n球状蛋白球状蛋白(globular protein)globular protein)：轴比小于：轴比小于1010，易溶解，如血红蛋白、刀豆蛋白，易溶解，如血红蛋白、刀豆蛋白n n纤维状蛋白纤维状蛋白(fibrous protein)fibrous protein)：轴比大于：轴比大于1010，不易溶解，如角蛋白、丝蛋白，不易溶解，如角蛋白、丝蛋白n n（2 2）根据溶解度）根据溶解度n n（3）根据组成n n单纯蛋白质单纯蛋白质(simple protein)simple protein)：清蛋白、球：清蛋白、球蛋白、谷蛋白、精蛋白、组蛋白、硬蛋白等蛋白、谷蛋白、精蛋白、组蛋白、硬蛋白等n n结合蛋白结合蛋白(complex protein)complex protein)n n核蛋白（核蛋白（nucleoproteinsnucleoproteins，含核酸），含核酸）n n磷蛋白（磷蛋白（phosphoproteinsphosphoproteins，含磷酸），含磷酸）n n脂蛋白（脂蛋白（lipoproteinslipoproteins，含脂类构成膜），含脂类构成膜）n n糖蛋白（糖蛋白（glycoproteinsglycoproteins，含糖），含糖）n n色蛋白（色蛋白（chromoproteinschromoproteins，含色素），含色素）n n金属蛋白金属蛋白(metalloproteinsmetalloproteins)n n黄素蛋白黄素蛋白(flavoproteinsflavoproteins)血红蛋白n n三 蛋白质的生物学功能n n（一）蛋白质功能的多样性l l1 1 催化功能：酶催化功能：酶l l2 2 控制生长和分化：激素控制生长和分化：激素 l l3 3 转化和贮存功能：酪蛋白、卵蛋白转化和贮存功能：酪蛋白、卵蛋白 l l4 4 运动功能：肌动蛋白、肌球蛋白运动功能：肌动蛋白、肌球蛋白l l5 5 结构支持作用：胶原蛋白结构支持作用：胶原蛋白l l6 6 免疫保护作用：免疫球蛋白免疫保护作用：免疫球蛋白 l l7 7 代谢调节功能：钙调蛋白代谢调节功能：钙调蛋白 l l8 8 接受和传递信息：受体接受和传递信息：受体 l l9 9 生物膜功能：膜蛋白生物膜功能：膜蛋白l l10 10 感染和毒性作用：蓖麻毒蛋白感染和毒性作用：蓖麻毒蛋白 l l11 11 运输功能：载脂蛋白、血红蛋白运输功能：载脂蛋白、血红蛋白l l（二）蛋白质功能的复杂性：如酶催化作用中表现（二）蛋白质功能的复杂性：如酶催化作用中表现的竞争性、可调节性等的竞争性、可调节性等第二节 氨基酸l l蛋白质的基本单位-氨基酸（amino acid）l l蛋白质分子量：蛋白质分子量：10KDa10KDa以上，有的在几百以上，有的在几百KDaKDa以上以上l l蛋白质蛋白质无论多大，经酸、碱、酶无论多大，经酸、碱、酶彻底水解后彻底水解后，均只得到一类成分均只得到一类成分各种各种-氨基酸氨基酸l l氨基酸是组成蛋白质的基本结构单位氨基酸是组成蛋白质的基本结构单位n n一 氨基酸的结构特征n n氨基酸：含有氨基的羧酸，羧酸中-碳原子上的H被NH2取代n n-氨基和-羧基连在同一碳原子上，统称-氨基酸（唯一的例外脯氨酸）脯氨酸n n氨基酸两性离子形式（解离形式，常在溶液和反应中存在）的结构式 n n除甘氨酸以外，其余氨基酸的碳原子都是不对称(手性)碳原子，因而氨基酸具有旋光性，并且每一种氨基酸都有D-型和L-型两种构型 甘氨酸n n天然蛋白质中的所有氨基酸都是L-型氨基酸（例外：某些微生物和植物体中含有D-型氨基酸，如短杆菌肽中含有D-苯丙氨酸；细菌细胞壁中含有D-丙氨酸和D-谷氨酸），并且这些L-型氨基酸大多具有右旋性，少数左旋。n n二 常见氨基酸20种构成蛋白质的基本氨基酸n n中文名称、符号（3字母、单字母）、中文简称必须记住n n20种基本氨基酸以外的稀有氨基酸：羟脯氨酸、羟赖氨酸、胱氨酸。它们没有遗传密码，是在蛋白质生物合成以后，经有关酶的催化修饰而形成的。n n三 氨基酸的分类n n（一）根据酸碱性质 酸性氨基酸酸性氨基酸 2 2种种 A Asp sp GluGlu-1-1氨基、氨基、2 2羧基羧基 碱性氨基酸碱性氨基酸 3 3种种 His Lys His Lys ArgArg-1-1羧基、多氨基羧基、多氨基 中性氨基酸中性氨基酸 15 15种种-1-1氨基、氨基、1 1羧基以及酰胺羧基以及酰胺n n（二）根据R-基的化学结构 芳香族氨基酸芳香族氨基酸 3 3种种 PhePhe Try Tyr-Try Tyr-芳香环芳香环 杂环氨基酸杂环氨基酸 1 1种种 His His 咪唑基咪唑基 杂环亚氨基酸杂环亚氨基酸 1 1种种 Pro Pro 氨基氨基H H被被R R基取代基取代 脂肪族氨基酸脂肪族氨基酸 1515种种n n（三）根据R-基的极性 非非极极性性氨氨基基酸酸RR基基含含脂脂肪肪烃烃或或芳芳香香环环 （8 8种种）：丙丙氨氨酸酸、亮亮氨氨酸酸、异异亮亮氨氨酸酸、缬缬氨氨酸酸、脯脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸（甲硫氨酸）氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸（甲硫氨酸）极极性性不不带带电电的的氨氨基基酸酸RR基基含含不不解解离离极极性性基基团团与与水水形形成成氢氢键键（7 7种种）：丝丝氨氨酸酸、苏苏氨氨酸酸、酪酪氨酸、天冬酰氨、谷氨酰氨、半胱氨酸、甘氨酸氨酸、天冬酰氨、谷氨酰氨、半胱氨酸、甘氨酸 极极性性带带正正电电荷荷的的氨氨基基酸酸即即碱碱性性氨氨基基酸酸 （3 3种）：种）：His Lys His Lys ArgArg 极极性性带带负负电电荷荷的的氨氨基基酸酸即即酸酸性性氨氨基基酸酸 （2 2种）：种）：Asp Asp GluGlu l l非蛋白质氨基酸l l约约180180种，多是种，多是L-L-型氨基酸衍生物。也有生物活型氨基酸衍生物。也有生物活性，不参与蛋白质的组成，以游离状态存在于性，不参与蛋白质的组成，以游离状态存在于生物体中，多为生物体中，多为-氨基酸的衍生物，也有氨基酸的衍生物，也有-、-、-氨基酸。如：氨基酸。如：-氨基丁酸氨基丁酸-，鸟，鸟AAAAl l必需氨基酸必需氨基酸（essential amino acid）l l指人（或其它脊椎动物）自己不能合成，必需指人（或其它脊椎动物）自己不能合成，必需从食物中获得的氨基酸，包括缬、亮、异亮、从食物中获得的氨基酸，包括缬、亮、异亮、苯丙、色、苏、甲硫、赖苯丙、色、苏、甲硫、赖n n四 氨基酸的性质l l氨基酸的物理性质l l构型与旋光性：构型与旋光性：多多L-L-型型，除甘氨酸均，除甘氨酸均有旋光性有旋光性l l溶解度：溶解度：无色晶体无色晶体，均，均溶于水、稀酸、稀碱溶于水、稀酸、稀碱中，中，但溶解度差异很大；但溶解度差异很大；不溶于有机溶剂不溶于有机溶剂，酒精可，酒精可将其从溶液中析出将其从溶液中析出l l呈味呈味性：性：酸、甜、苦、鲜、咸。有些氨基酸为酸、甜、苦、鲜、咸。有些氨基酸为其盐的味，必需氨基酸多显苦味。谷氨酸、天其盐的味，必需氨基酸多显苦味。谷氨酸、天门冬氨酸的钠盐为鲜味门冬氨酸的钠盐为鲜味n n（一）两性性质-氨基酸是弱两性电解质n n氨基酸分子既含有酸性的羧基氨基酸分子既含有酸性的羧基(-COOH)(-COOH)，又，又含有碱性的氨基（含有碱性的氨基（-NH2-NH2），因此，），因此，氨基酸是氨基酸是两性电解质两性电解质(ampholyteampholyte)n n其中的其中的-COOH-COOH能放出质子能放出质子(H+)(H+)，而变成，而变成-COO-COO-；其中的；其中的-NH-NH2 2能接受质子，而变成能接受质子，而变成-NHNH3 3+。此时。此时氨基酸为同一分子上带有正负两氨基酸为同一分子上带有正负两种电荷的偶极离子或称兼性离子种电荷的偶极离子或称兼性离子，这是水中，这是水中或结晶态的主要形式或结晶态的主要形式 。n n等电点等电点等电点等电点（isoelectricisoelectric point point，pIpI）：对）：对某种氨某种氨基酸在某一特定的基酸在某一特定的pHpH时时，氨基酸，氨基酸以两性离子以两性离子的形式的形式存在，正负电荷相等，净电荷为零存在，正负电荷相等，净电荷为零，在电场中不在电场中不向任何一方向任何一方移动移动。此时此时溶液溶液的的pHpH值值，称，称为为该氨基酸的该氨基酸的等电点等电点，用，用pIpI来表示。来表示。pH=pI 净电荷净电荷=0位置不动位置不动 pH pI净电荷为负净电荷为负移向正极移向正极CHRCOOHNH3+CHRCOONH2CHRCOONH3+H+OH+H+OH+(pK1)(pK2)n n不同的氨基酸，由于不同的氨基酸，由于R R基结构的不同，而基结构的不同，而有不同的等电点。在有不同的等电点。在一定一定的实验的实验条件下条件下，等电点是氨基酸的特征常数等电点是氨基酸的特征常数。n n当当氨基酸处于等电点氨基酸处于等电点状态状态时时，由于静电引，由于静电引力的作用，其力的作用，其溶解度最小溶解度最小，容，容易易发生发生沉淀沉淀；利用这一特性利用这一特性可可以从各种氨基酸的混合物以从各种氨基酸的混合物溶液中溶液中分离制取分离制取某种氨基酸某种氨基酸n npIpI=1/2(pK=1/2(pK1 1+pK+pK2 2)。酸性酸性AAAA的的pIpI小（小（2-32-3），），碱性碱性AAAA的的pIpI大（大（9-119-11）n n（二）紫外吸收-芳香族AA具有特征性紫外（UltravioletUltraviolet，UV）吸收l l参与蛋白质组成的参与蛋白质组成的2020种氨基酸在可见光区都种氨基酸在可见光区都没有光吸收；在没有光吸收；在紫外光区只有色氨酸、酪氨紫外光区只有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸有吸收光的能力。其最大吸收酸和苯丙氨酸有吸收光的能力。其最大吸收波长波长()()分别为分别为279279、278278、259nm259nm。l l酪氨酸和色氨酸的光吸收特性酪氨酸和色氨酸的光吸收特性也也是利用紫外是利用紫外分光光度计（在波长分光光度计（在波长280nm280nm处）测定蛋白质处）测定蛋白质浓度的基础浓度的基础。TryTry、TyrTyr、PhePhe的紫外吸收光谱的紫外吸收光谱的紫外吸收光谱的紫外吸收光谱摩摩尔尔吸吸收收系系数数波长波长l l凯氏定氮法凯氏定氮法l l样品与硫酸一同加热消化样品与硫酸一同加热消化,分解有机质，释分解有机质，释放出的放出的NHNH3 3与硫酸结合成硫酸铵留在溶液中。与硫酸结合成硫酸铵留在溶液中。在定氮消化瓶中，用氢氧化钠中和硫酸铵在定氮消化瓶中，用氢氧化钠中和硫酸铵生成氢氧化铵，加热又分解生成氢氧化铵，加热又分解NHNH3 3，用硼酸吸，用硼酸吸收收,用标定过的盐酸或硫酸滴定，从而计算用标定过的盐酸或硫酸滴定，从而计算出总氮量，换算为蛋白质量出总氮量，换算为蛋白质量 l lUVUV法法l l在在280nm280nm波长下，直接测蛋白含量。根据波长下，直接测蛋白含量。根据WarburgWarburg公式公式 ，将吸光值转换为样品浓度，将吸光值转换为样品浓度信息栏-蛋白质定量l lLowry法l l蛋白质与蛋白质与CuCu2+2+反应，产生蓝色的反应物。反应，产生蓝色的反应物。根据根据Lowry-kalckarLowry-kalckar公式计算公式计算l lBCA法l l蛋白在碱性溶液里与蛋白在碱性溶液里与CuCu2+2+反应产生反应产生CuCu+，后，后者与者与BCABCA螯合，形成紫色化合物的吸收峰螯合，形成紫色化合物的吸收峰在在562nm562nml lBradford法l l蛋白质与考马斯亮兰结合反应，产生的有蛋白质与考马斯亮兰结合反应，产生的有色化合物吸收峰在色化合物吸收峰在595nm595nmn n（三）化学性质氨基酸的一些特殊反应用于定性与定量n n1 1 由由-氨基参与的反应氨基参与的反应l l（1 1）与亚硝酸反应：）与亚硝酸反应：产生氮气，其中一产生氮气，其中一半来自氨基酸半来自氨基酸用来氨基酸定量和蛋白质用来氨基酸定量和蛋白质水解程度测定水解程度测定l l（2 2）与甲醛反应：）与甲醛反应：甲醛将氨基保护，碱甲醛将氨基保护，碱滴定羧基滴定羧基从而给氨基酸定量从而给氨基酸定量l l（3 3）与）与,-二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFBDNFB）反应）反应（SangerSanger反应）：反应）：-NH-NH2 2端反应端反应，生成黄，生成黄色产物色产物鉴定氨基酸或蛋白结构测定鉴定氨基酸或蛋白结构测定l l（4 4）酰化反应）酰化反应l l（5 5）成盐反应：）成盐反应：生成氨基酸盐酸盐生成氨基酸盐酸盐l l（6 6）形成西夫碱反应：形成西夫碱反应：引起食品非酶促引起食品非酶促褐变褐变l l（7 7）脱氨基反应）脱氨基反应n n2 2 由由-羧基参与的反应羧基参与的反应l l（1 1）成盐反应成盐反应l l（2 2）成酯反应：）成酯反应：曲酒酿造中，不同氨基曲酒酿造中，不同氨基酸所成的酯，具有不同香味酸所成的酯，具有不同香味l l（3 3）酰化反应）酰化反应l l（4 4）脱羧基反应：脱羧基反应：生成有生物作用的胺生成有生物作用的胺l l（5 5）叠氮反应）叠氮反应 n n3 3 由由-氨基和氨基和-羧基共同参与的反应羧基共同参与的反应l l（1 1）茚三酮反应茚三酮反应茚三酮反应茚三酮反应：（：（ninhydrinninhydrin reactionreaction）：在加热条件下，氨基酸或肽）：在加热条件下，氨基酸或肽与茚三酮反应生成紫色（与脯氨酸和羟脯与茚三酮反应生成紫色（与脯氨酸和羟脯氨酸反应生成黄色）化合物的反应氨酸反应生成黄色）化合物的反应 l l反应灵敏，反应灵敏，0.5g0.5g就能显色就能显色l l570nm570nm处比色，用于定性、定量检测处比色，用于定性、定量检测氨基酸和蛋白质氨基酸和蛋白质l l（2 2）成肽反应成肽反应：一个氨基酸的氨基与另：一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基缩合，除去一分子水形一个氨基酸的羧基缩合，除去一分子水形成形成的酰胺键，即为肽键成形成的酰胺键，即为肽键氨基酸与茚三酮反应氨基酸与茚三酮反应+3H20茚三酮茚三酮(无色无色)NH3CO2 RCHO+还原性茚三酮还原性茚三酮紫色化合物紫色化合物(弱酸弱酸)加热加热+2NH3+还原性茚三酮还原性茚三酮还原性茚三酮还原性茚三酮n n4 4 侧链侧链R R基参与的反应基参与的反应l l（1 1）巯基及二硫键）巯基及二硫键(disulfidedisulfide bonds)bonds)l l巯基巯基：巯基还原性强，极微量的巯基还原性强，极微量的金属金属离子离子，如，如AgAg、HgHg2 2，即能即能与巯基反与巯基反应应，生成硫醇盐，生成硫醇盐，导致酶失活导致酶失活l l二硫键二硫键：SH+SH+SH SH SSSSl l（2 2）羟基：）羟基：与酸生成酯与酸生成酯第三节 肽n n一 肽的概念n n肽肽肽肽：氨基酸通过肽键连接形成的链状化合物就：氨基酸通过肽键连接形成的链状化合物就称为肽称为肽（peptide）l l回顾：肽键（peptide bond）：一个氨基酸的羧基与另一个的氨基的氨基缩合，除去一分子水形成的酰氨键 n n1 结构n nC-NC-N具有部分双键性质，故不能沿着具有部分双键性质，故不能沿着C-NC-N轴自轴自由转动由转动n n-CO-CO-具有部分单键性质具有部分单键性质n nO-C-N-HO-C-N-H处于同一平面内处于同一平面内n nC-NC-N键长键长1.32A1.32A，介于普通，介于普通C-NC-N单键和单键和C=NC=N双键双键之间之间n n肽链（肽链（peptide chainpeptide chain）n n氨基酸残基（氨基酸残基（amino acidamino acid residueresidue）n n氨基末端（氨基末端（N-N-末端）和羧基末端（末端）和羧基末端（C-C-末端）：末端）：从左至右的方向从左至右的方向n n寡肽寡肽(oligopeptideoligopeptide)：残基数在残基数在1010个以下个以下n n含有三个、四个、五个氨基酸的肽，分别称含有三个、四个、五个氨基酸的肽，分别称为三肽、四肽、五肽等为三肽、四肽、五肽等n n多肽多肽(polypeptidepolypeptide)：残基数在：残基数在1010个以上个以上CCCCn n2 肽与氨基酸的区别n n肽含有侧链肽含有侧链R-R-基上的可解离基团基上的可解离基团n n肽可以根据其离子化程度鉴别，大肽离子化程肽可以根据其离子化程度鉴别，大肽离子化程度比小肽低度比小肽低n n二 生物活性肽n nbioactive peptide，有称天然肽n n谷胱甘肽：谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸构成的三肽，参与体内氧化还原反应n n神经肽(nervonic peptide)：首先从脑组织中分离出来并主要存在于中枢神经系统的一类活性肽，具有镇痛作用，故称脑啡肽或内啡肽n n抗菌肽：是抗生素（antibiotic）的一种，通常由特定微生物产生第四节 蛋白质的结构与功能l初级结构 l l一级结构(primary structure)l l高级结构（空间结构）l l二级结构(secondary structure)l l三级结构(tertiary structure)l l四级结构(quaternary structure)n n一 蛋白质的一级结构n n1 一级结构一级结构：一级结构特指肽链中氨基酸的排列顺序，最小单位为氨基酸n n（1 1）蛋白质的化学结构）蛋白质的化学结构n n多肽链数目多肽链数目n n每条链中氨基酸的数目、种类、排列顺序每条链中氨基酸的数目、种类、排列顺序n n链间链内桥键的位置和数目链间链内桥键的位置和数目n n（2 2）维持一级结构的化学键）维持一级结构的化学键 ：肽键：肽键n n（3 3）一级结构的书写方式：从）一级结构的书写方式：从N-N-末端到末端到C-C-末端末端l l命名举例（甲硫脑啡肽）l l中文氨基酸残基命名法：酪氨酰甘氨酰甘氨中文氨基酸残基命名法：酪氨酰甘氨酰甘氨酰苯丙氨酰甲硫氨酸酰苯丙氨酰甲硫氨酸l l中文单字表示法：酪中文单字表示法：酪-甘甘-甘甘-苯丙苯丙-甲硫甲硫 1 2 3 4 51 2 3 4 5l l三字母符号表示法：三字母符号表示法：TyrTyr G1yG1y G1yG1y PhePhe MetMetl l单字母符号表示法：单字母符号表示法：YGGFMYGGFMn n2 一级结构的测定n n基本策略基本策略(basic strategy)(basic strategy)：片段重叠法：片段重叠法+氨氨基酸顺序直测法基酸顺序直测法n n要点要点 n n测定氨基酸末端的数目，确定肽链数测定氨基酸末端的数目，确定肽链数n n肽链的拆分肽链的拆分n n肽链完全水解，分析氨基酸组分肽链完全水解，分析氨基酸组分n n两次不完全水解，获得两套不同的肽链片两次不完全水解，获得两套不同的肽链片断混合物，并分别测定氨基酸顺序断混合物，并分别测定氨基酸顺序n n根据两套片断的氨基酸顺序，拼凑出整个根据两套片断的氨基酸顺序，拼凑出整个肽链的氨基酸顺序。肽链的氨基酸顺序。将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序 将肽段分离并测出顺序将肽段分离并测出顺序专一性裂解专一性裂解末端氨基酸测定末端氨基酸测定拆开二硫键拆开二硫键纯蛋白质纯蛋白质蛋蛋白白质质顺顺序序测测 定定基基本本策策略略（1）肽链末端分析 N-末端测定 DNFBDNFB法法(SangerSanger法法)：结合结合高效液相色谱高效液相色谱(High Performance Liquid(High Performance Liquid ChromaChromatographytography,HPLC)HPLC)苯异硫腈苯异硫腈(PITC)(PITC)法法(EdmanEdman法）：法）：结合结合HPLCHPLC，以实现程序自动化，广泛用于测序以实现程序自动化，广泛用于测序 二甲基氨基萘磺酰氯法二甲基氨基萘磺酰氯法(DNS)DNS)：类似：类似DNFBDNFB法法 氨肽酶法：氨肽酶是一类肽链外切酶，从氨肽酶法：氨肽酶是一类肽链外切酶，从末端末端逐个逐个向内切向内切 C-末端测定：l l肼解法肼解法l l羧肽酶法：羧肽酶专门水解并释放羧肽酶法：羧肽酶专门水解并释放C-C-末端末端（2）二硫键的拆开和肽链的分离l l二硫键拆开：氧化还原法（二硫键拆开：氧化还原法（beta-beta-巯基乙醇、巯基乙醇、二硫苏糖醇二硫苏糖醇-DTT-DTT）l l肽链分离：变性（肽链分离：变性（酸、碱、盐、尿素、盐酸酸、碱、盐、尿素、盐酸胍等胍等）（3）肽链的部分水解和肽段（peptide fragment）的分离l l溴化氰（溴化氰（CNBrCNBr）：易升华，专切）：易升华，专切MetMet羧基端羧基端l l酸水解：稀酸酸水解：稀酸-Asp-Asp-羧基端；浓酸羧基端；浓酸-羟基氨基羟基氨基酸氨基端酸氨基端l l酶水解酶水解l l胰蛋白酶：胰蛋白酶：作用于碱性作用于碱性AAAA羧基端羧基端l l胃蛋白酶：胃蛋白酶：专一性差，作用于酸性专一性差，作用于酸性AAAA和和芳香族芳香族AAAA羧基端羧基端l l胰凝乳蛋白酶：胰凝乳蛋白酶：芳香族氨基酸等的羧基端芳香族氨基酸等的羧基端l l弹性蛋白酶：弹性蛋白酶：脂肪族氨基酸羧基端脂肪族氨基酸羧基端（4）肽段的氨基酸顺序测定：Edman法为主（5）肽段在多肽链中的次序的推断牛胰岛素的结构l l含有含有5151个氨基酸，由两条肽链组成。个氨基酸，由两条肽链组成。A A链为链为2121个氨基酸，个氨基酸，B B链为链为3030个氨基酸。通过个氨基酸。通过7-77-7，20-20-1919两个位置的二硫键相连。另外，两个位置的二硫键相连。另外，A A链本身链本身6 6位位与与1111位通过二硫键相连位通过二硫键相连n n二 蛋白质的高级结构又称为又称为构象、空间结构、立体结构、三维结构构象、空间结构、立体结构、三维结构构象、空间结构、立体结构、三维结构构象、空间结构、立体结构、三维结构，指的是蛋白质分子中的所有原子在三维空间中指的是蛋白质分子中的所有原子在三维空间中的排布，分为二、三、四级结构三个不同层次的排布，分为二、三、四级结构三个不同层次n n1 概念n n（1 1）含义）含义n n二级结构二级结构二级结构二级结构(secondary structure)(secondary structure)：多肽链：多肽链借助氢键排列成沿一个方向具有周期性结借助氢键排列成沿一个方向具有周期性结构的构象，如构的构象，如alpha-alpha-螺旋、螺旋、beta-beta-折叠片等。折叠片等。二级结构不涉及氨基酸残基的侧链构象。二级结构不涉及氨基酸残基的侧链构象。n n三级结构三级结构三级结构三级结构(tertiary structure)(tertiary structure)：多肽链借：多肽链借助各种次级键盘绕成特定的不规则的球状助各种次级键盘绕成特定的不规则的球状结构的构象结构的构象n n四级结构四级结构四级结构四级结构（quaternary structurequaternary structure）：寡聚）：寡聚蛋白质中各亚基之间排布上的相互关系或蛋白质中各亚基之间排布上的相互关系或者结合方式者结合方式n n（2 2）维持蛋白质构象的化学键维持蛋白质构象的化学键n n氢键：氢键：alpha-alpha-螺旋、螺旋、beta-beta-折叠中极重要，折叠中极重要，维护三维构象维护三维构象n n离子键离子键/盐键盐键/静电引力：较强，对构象稳静电引力：较强，对构象稳定不太重要定不太重要n n范德华力：弱力，对构象稳定有一定作用范德华力：弱力，对构象稳定有一定作用n n疏水作用力：非极性基团产生，对高级结疏水作用力：非极性基团产生，对高级结构起重要作用构起重要作用n n二硫键：两个硫原子之间共价键，作用强，二硫键：两个硫原子之间共价键，作用强，对稳定构象和保持活性重要对稳定构象和保持活性重要n n（3 3）肽链的空间构象原则）肽链的空间构象原则n n肽单位肽单位肽单位肽单位：肽链主链上的重复结构：肽链主链上的重复结构n n肽单位的特征（肽链空间结构原则）肽单位的特征（肽链空间结构原则）n n肽键的键长是肽键的键长是0.1325nm0.1325nm，比，比C-NC-N单键单键(键长键长0.147nm)0.147nm)短些，比短些，比C=NC=N双键双键(键键长长0.127nm)0.127nm)长些。因此，肽键具有部长些。因此，肽键具有部分双键的性质，不能自由旋转分双键的性质，不能自由旋转n n肽单位是刚性平面结构。这就是说肽单位是刚性平面结构。这就是说,肽肽单位上的单位上的6 6个原子都位于同一个刚性平个原子都位于同一个刚性平面上，称为酰胺平面（面上，称为酰胺平面（amide planeamide plane）或肽平面或肽平面n n多肽链上绝大多数肽单位，其多肽链上绝大多数肽单位，其C=OC=O和和N-HN-H都是反式排布的。这是因为反式构都是反式排布的。这是因为反式构型的能量比顺式构型的能量低的缘故型的能量比顺式构型的能量低的缘故n n单位平面结构有一定的键长、键角单位平面结构有一定的键长、键角n n肽平面之间可旋转，但角度有限，使肽平面之间可旋转，但角度有限，使蛋白多肽链只有一种或很少几种构象蛋白多肽链只有一种或很少几种构象l l 侧链残基的结构、极性造成空间位侧链残基的结构、极性造成空间位阻阻l l 氢键也使旋转角度有限氢键也使旋转角度有限二面角二面角二面角二面角 二面角二面角 两两相相邻邻酰酰胺胺平平面面之之间间，能能以以共共同同的的C为为定定点点而而旋旋转转，绕绕C-N键键旋旋转转的的角角度度称称角角，绕绕C-C键键旋旋转转的的角角度度称称角角。和和称称作作二面角二面角，亦称构象角。，亦称构象角。n n2 二级结构：多肽链本身的折叠方式，维持结构作用力为氢键l l二级结构的主要类型二级结构的主要类型l l-螺旋l l-折叠片l l-转角（回折）l l无规卷曲常见结构单元（structure element）（1）-螺旋(-helix)：最常见二级结构每每每每一一一一圈圈圈圈包包包包含含含含3.63.6个个个个残残残残基基基基，螺螺螺螺距距距距0.540.54nmnm。每每每每个个个个氨氨氨氨基基基基酸酸酸酸上上上上升升升升0.15nm0.15nm，旋旋旋旋转转转转100100。螺螺螺螺旋旋旋旋半半半半径径径径0.230.23nmnm。表示为表示为表示为表示为3.63.613131-1-螺旋结构要点螺旋结构要点螺旋结构要点螺旋结构要点 每一个每一个每一个每一个 角等于角等于角等于角等于-57-57，每一个，每一个，每一个，每一个 角等于角等于角等于角等于-4-48 8 相相邻邻螺螺圈圈之之间间形形成成链链内内氢氢键键。即即每每个个AA残残基基的的氨氨基基与与前前面面第第4个个AA残残基基的的羰羰基基生生成成一一个个氢氢键键。氢氢键键的的取取向向与与螺螺轴轴几几乎乎平平行行。氢氢键键的的4个个原原子子位位于一条直线。于一条直线。多多多多数数数数为为为为右右右右手手手手螺螺螺螺旋旋旋旋（较较较较稳稳稳稳定定定定），亦亦亦亦有有有有少少少少数数数数左左左左手手手手螺螺螺螺旋旋旋旋（不稳定）（