【高中生物】蛋白质工程的原理和应用课件 高二下学期生物人教版选择性必修3.pptx

第4节：蛋白质工程的原理和应用三级结构一级结构四级结构二级结构【从社会中来】你见过用细菌画画吗？右图是用发出不同颜色荧光的细菌“画”的美妙图案。这些细菌能够发出荧光，是因为它们体内导入了荧光蛋白的基因。最早被发现的荧光蛋白是绿色荧光蛋白，科学家通过改造它，获得了黄色荧光蛋白等。这些荧光蛋白在细胞内生命活动的检测、肿瘤的示踪研究等领域有着重要应用。那么，科学家是怎样对蛋白质分子进行设计和改造的呢？对蛋白质分子的设计和改造是通过蛋白质工程 来实现的知识点回顾：基因工程知识点回顾：基因工程按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。从技术操作层面看，由于基因工程是在看，由于基因工程是在DNADNA分子水平上进行设计和施工的，因此又分子水平上进行设计和施工的，因此又叫作重组叫作重组DNADNA技术。技术。操作对象及环境操作对象及环境操作水平操作水平操作操作原理原理结果结果生物体外生物体外基因基因DNADNA分子水平分子水平按照人类的需要定向改造生物的遗传特性按照人类的需要定向改造生物的遗传特性基因重组基因重组优点：优点：能克服远缘杂交不亲和的障碍；能克服远缘杂交不亲和的障碍；定向改造生物的遗传特性。定向改造生物的遗传特性。一、蛋白质工程崛起的缘由1.缘由基因工程原则上只能生产自然界已存在的蛋白质(天然蛋白质)天然蛋白质不一定完全符合人类生产和生活的需要需要对天然蛋白进行改造产生更符合人类需要的蛋白质实质：将一种生物的基因转移到另一种生物体内，使后者可以产生它原本不能产生的蛋白质，进而表现出新性状。结构和功能符合特定物种生存的需要蛋白质工程崛起玉米中赖氨酸的含量比较低，原因是赖氨酸合成过程中的两种关键酶：天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸合成酶的活性，受细胞内赖氨酸浓度的影响较大。赖氨酸达到一定浓度就会抑制这两种酶的活性，所以赖氨酸含量很难提高。如果我们将天冬氨酸激酶中第352位的苏氨酸变成异亮氨酸，将二氢吡啶二羧酸合成酶中第104位的天冬酰胺变成异亮氨酸，就可以使玉米叶片和种子中游离赖氨酸的含量分别提高5倍和2倍。天然蛋白质不一定完全符合人类生产和生活的需要需要对天然蛋白进行改造产生更符合人类需要的蛋白质2.实例2.实例改造的天冬氨酸激酶异亮氨酸（352位）变为变为玉米赖氨酸含量提高5倍赖氨酸天冬氨酸激酶_（含量低）二氢吡啶二羧酸合成酶天冬酰胺（104位）苏氨酸（352位）玉米异亮氨酸（104位）改造二氢吡啶二羧酸合成酶变为变为玉米赖氨酸含量提高2倍蛋白质工程的概念蛋白质工程是指以 及其与 作为基础,通过 或 ,来改造 或 蛋白质,以满足 。蛋白质分子的结构规律生物功能的关系改造合成基因现有蛋白质制造一种新的人类生产和生活的需求基础：蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系；操作对象：改造或合成基因结果：改造现有蛋白质或制造一种新的蛋白质与基因工程的关系：目的：以满足人类生产和生活的需求在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程理论和技术：分子生物学、晶体学和计算机技术基因工程产生的蛋白质是否完全基因工程产生的蛋白质是否完全符合人类生产和生活的需要？符合人类生产和生活的需要？1 1基因工程的局限性：基因工程的局限性：a、基因工程在原则上、基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质只能生产自然界已存在的蛋白质b、天然蛋白质不一定完全符合人类生产和生活的需要、天然蛋白质不一定完全符合人类生产和生活的需要2 2蛋白质工程的目的：蛋白质工程的目的：生产符合人类生产和生活需要的、并非自然界已存在生产符合人类生产和生活需要的、并非自然界已存在的蛋白质的蛋白质.天然蛋白质是生物长期进化过程中形成的，它天然蛋白质是生物长期进化过程中形成的，它们的结构和功能们的结构和功能符合符合特定物种特定物种生存的需要，却生存的需要，却不一定完全符合不一定完全符合人类生产和生活人类生产和生活的需要。的需要。可以创造自然界不存在的蛋白质！可以创造自然界不存在的蛋白质！你知道人类蛋白质组计划吗?它与蛋白质工程有什么关系?我国科学家承担了什么任务?人类蛋白质组计划是继人类基因组计划之后,生命科学乃至自然科学领域重大的国际 合作科研项目。2001年,国际人类蛋白质组组织宣布成立。2003年,该组织正式提出启动两项重大国际合作项目:一项是由中国科学家牵头执行的“人类肝脏蛋白质组计划”;另一项是由美国科学家牵头执行的“人类血浆蛋白质组计划”,由此拉开了人类蛋白质组计划的帷幕。对天然蛋白质进行改造，你认为应该直接对蛋白质对天然蛋白质进行改造，你认为应该直接对蛋白质分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？答：毫无疑问应该从答：毫无疑问应该从对基因的操作对基因的操作来实现对天然蛋白来实现对天然蛋白 质改造质改造,主要原因如下：主要原因如下：蛋白质的合成蛋白质的合成遗传遗传容易操作容易操作1.蛋白质工程的目标：根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行设计改造。2.改造蛋白质的方法：改造或合成基因3.天然蛋白质合成过程：按照中心法则进行基因表达形成具有特定氨基酸序列的多肽链形成具有高级结构的蛋白质行使生物功能转录、翻译4.基因工程的思路基因mRNA转转录录翻翻译译具有特定氨基酸序列的多肽链具有高级结构的蛋白质行使生物功能思考：蛋白质工程的思路如何？预期的蛋白质功能设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因获得所需蛋白质预期功能生物功能设计推测改造或合成行使折叠目的基因 转录mRNA翻译多肽链 蛋白质(三维结构)5.蛋白质工程的思路发黄色荧光的蛋白质黄色荧光蛋白黄色荧光蛋白多肽链黄色荧光蛋白的基因mRNA设计推测改造或合成行使折叠翻译转录5.蛋白质工程的思路是否合成新的基因蛋白质工程是否对原有基因进行改造是否是否蛋白质工程基因工程看蛋白质看基因是否为天然蛋白质是否蛋白质工程基因工程如何区分？项目蛋白质工程基因工程操作对象操作起点操作水平操作流程结果实质联系基因基因DNA分子水平DNA分子水平预期蛋白质功能设计蛋白质结构推测氨基酸序列找到并改变对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新基因获得所需要的蛋白质目的基因的筛选与获取构建基因表达载体将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定可生产自然界没有的蛋白质生产自然界已有的蛋白质通过改造或合成基因来定向改造现有蛋白质或制造新的蛋白质将一种生物的基因转移到另一种生物体内，后者可以产生它本不能产生的蛋白质，进而表现出新的性状蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程；蛋白质工程离不开基因工程，其包含基因工程的基本操作。预期蛋白质功能目的基因蛋白质工程和基因工程的比较（练习册答案23页）思考思考讨论讨论蛋白质工程基本思路的应用蛋白质工程基本思路的应用 某多肽链的一段氨基酸序列是：丙氨酸苯丙氨酸色氨酸谷氨酸赖氨酸1.怎样得出决定这一段肽链的脱氧核苷酸序列?请把相应的碱基序列写出来。提示：丙氨酸（GCU、GCC、GCA、GCG)、色氨酸(UGG)、赖氨酸(AAA、AAG）、谷氨酸（GAA、GAG）、苯丙氨酸（UUU、UUC）。mRNA序列为：GCU（或C或A或G）UGG AAA（或G）GAA（或G）UUU（或C）DNA序列为：CGA（或G或T或C）ACC TTT（或C）CTT（或C）AAA（或G）GCT（或C或A或G）TGG AAA（或G）GAA（或G）TTT（或C）共共 32 种可能序列种可能序列【思考讨论】蛋白质工程基本思路的应用某多肽链的一段氨基酸序列是：丙氨酸苯丙氨酸色氨酸谷氨酸赖氨酸2.确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或改造目的基因？确定目的基因的碱基序列后，可以人工合成目的基因或从基因文库中获取目的基因。对基因的改造经常会用到基因定点突变技术来进行碱基的替换、增添等。学科交叉蛋白质工程经常要借助计算机来建立蛋白质的三维结构模型；要制备蛋白质晶体，然后通过X射线衍射技术，分析晶体结构；要用到基因的定点突变技术来进行碱基的替换。重叠延伸PCR大引物PCR补充：基因的定点突变技术1-重叠PCR技术该过程需要_种引物；PCR1的产物AB是引物_和引物_扩增的结果；PCR2的产物CD是引物_和引物_扩增的结果；产物AD的形成需要引物吗？_需要改变的碱基位于引物_和引物_上引物b和引物c之间有什么关系？_PCR3中突变产物AD的扩增需要引物_和引物_4abcdbc引物b和引物c应有部分碱基互补的关系ad不需要，但需要耐高温的DNA聚合酶 该过程需要三种引物，第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条链作为下游大引物，与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。补充：基因的定点突变技术2-大引物PCR技术2023/5/11思考P95：能不能根据人类需要的蛋白质的结构，设计相应的基因，导入合适的宿主细胞中，让宿主细胞生产人类所需要的蛋白质食品呢？理论上讲可以，但目前还没有真正成功的例子。利用改造后的动物细胞、微生物细胞等可以生产人类需要的蛋白质，但这些蛋白质往往都是自然界中已经存在的蛋白质，并非完全是人工设计出来的、自然界中不存在的蛋白质。主要原因是蛋白质的高级结构非常复杂，人类对大多数蛋白质的高级结构和蛋白质在生物体内如何行使功能了解得还不够，很难设计出一个全新的而又具有功能的蛋白质。即使设计并获得了一个全新的蛋白质，它的生理生化特性、用它生产的蛋白质食品的安全性等都需要长期深入的研究。拓展延伸拓展延伸根据改造蛋白质的部位的多少，对蛋白质的改造可分为三类：（1 1）大改：设计并制造出自然界中不存在的全新蛋白质（2 2）中改：在蛋白质分子中替换某一个肽段或某一个特定的结构域。（3 3）小改：改造蛋白质分子中的几个氨基酸残基 下图为蛋白质工程操作的基本思路，请据图回答下列问题：(1)代表蛋白质工程操作思路的过程是_；代表中心法则内容的是_。(填写数字)(2)写出图中各数字代表的生物学过程的名称或内容：_ _；_；_；_。(3)蛋白质工程的目的是_ _，通过_实现。(4)从图中可以看出蛋白质工程的基本途径与中心法则是_的。转录翻译折叠推测改造合成根据人们对蛋白质功能的特定需求，基因改造或基因合成相反对蛋白质的结构进行分子设计习题巩固三、蛋白质工程的应用三、蛋白质工程的应用1.医药工业方面产生速效胰产生速效胰岛素岛素产生易保存产生易保存的干扰素的干扰素生产人鼠嵌生产人鼠嵌合抗体合抗体行使功能设计结构天然胰岛素易形成二聚体或六聚体预期结构改造B28位脯氨酸替换为天冬氨酸或将它与B29位的赖氨酸交换位置新胰岛素基因mRNA折叠预期功能降低胰岛素的聚合作用改变B链第2029位氨基酸组成推测 序列翻译多肽链有效抑制胰岛素的聚合转录产生速效胰岛素产生易保存的干扰素天然干扰素（体外保存困难）改造后的干扰素（-70可保存半年）半胱氨酸丝氨酸干扰素在体外保存相当困难将干扰素分子上的一个半胱氨酸变成丝氨酸在-70下干扰素可保存半年医学问题：小鼠单克隆抗体会使人体产生免疫反应，从而导致治疗效果大大降低解决办法：通过改造基因，将小鼠抗体上结合抗原的区域（即可变区）“嫁接”到人的抗体（即恒定区）上，经过这样改造的抗体诱发免疫反应的强度就会减低很多。生产人鼠嵌合抗体三、蛋白质工程的应用1.医药工业方面产生速效胰岛素产生易保存的干扰素生产人鼠嵌合抗体通过基因定点突变一个氨基酸的改变或两个氨基酸位置互换通过基因定点突变一个氨基酸的改变通过基因片段的拼接两条多肽片段拼接三、蛋白质工程的应用2.工业方面的应用枯草杆菌蛋白酶突变体枯草杆菌蛋白酶突变体枯草杆菌蛋白酶具有水解蛋白质的作用，因此常被用于洗涤剂工业、丝绸工业等。广泛用于改进酶的性能或开发新的工业用酶利用蛋白质工程获得的该酶的突变体已有上百种，从中可能筛选出一些符合工业化生产需求的突变体，从而提高这种酶的使用价值。三、蛋白质工程的应用3.农业方面的应用改造某些参与调控光合作用的酶改造某些参与调控光合作用的酶科学家正在尝试改造某些参与调控光合作用的酶，以提高植物光合作用的效率，增加粮食的产量。还有科学家将蛋白质工程作为设计优良微生物农药的新思路，通过改造微生物蛋白质的结构，使它防治病虫害的效果增强。改造微生物蛋白质结构，防治害虫改造微生物蛋白质结构，防治害虫蛋白质工程是一项难度很大的工程。主要原因：蛋白质发挥功能必须依赖于正确的高级结构，而这种高级结构往往十分复杂。由计算机建立的血红由计算机建立的血红蛋白三维结构模型蛋白三维结构模型前景展望：科学家要设计出更加符合人类需要的蛋白质，还需要不断地攻坚克难。随着科技的深入发展，蛋白质工程将会给人类带来更多的福祉三级结构一级结构四级结构二级结构习题巩固习题巩固Exercises to consolidate1.蛋白质工程可以说是基因工程的延伸，判断下列相关表述是否正确。(1)基因工程需要在分子水平对基因进行操作，蛋白质工程不需要对基因进行操作。()(2)蛋白质工程需要改变蛋白质分子的所有氨基酸序列。()(3)蛋白质工程可以改造酶，提高酶的热稳定性。()习题巩固习题巩固Exercises to consolidate2.蛋白质工程是在深入了解蛋白质分子的结构与功能关系的 基础上进行的，它最终要达到的目的是 ()A.分析蛋白质的三维结构B.研究蛋白质的氨基酸组成C.获取编码蛋白质的基因序列信息D.改造现有蛋白质或制造新的蛋白质，满足人类的需求D习题巩固习题巩固Exercises to consolidate3.水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。研究人员发现，用赖氨酸替换水蛭素第47位的天冬酰胺可以提高它的抗凝血活性。在这项替换研究中，目前可行的直接操作对象是()A.基因 B.氨基酸 C.多肽链 D.蛋白质A习题巩固习题巩固Exercises to consolidate4.T4溶菌酶是一种重要的工业用酶，但是它在温度较高时容易失去活性。为了提高为了提高T4溶菌酶的耐热性溶菌酶的耐热性，科学家首先对影响T4溶菌酶耐热性的一些重要结构进行了研究。然后以此为依据对相关基因进行改造，使使T4溶菌酶的第溶菌酶的第3位异亮氨酸变为半胱位异亮氨酸变为半胱氨酸氨酸。于是，在该半胱氨酸与第97位的半胱氨酸之间形成了一个二硫键，T4溶菌酶的耐热性得到了提高。这项工作属于什么工程的范畴?在该实例中引起T4溶菌酶空间结构发生改变的根本原因是什么?如果要将该研究成果应用到生产实践，还需要做哪些方面的工作?习题巩固习题巩固Exercises to consolidate 这项工作属于这项工作属于蛋白质工程蛋白质工程的范畴。引起的范畴。引起T4溶菌酶空间结构溶菌酶空间结构发生改变的发生改变的根本原因是基因的碱基序列发生了变化根本原因是基因的碱基序列发生了变化。如果要将。如果要将改造后的改造后的T4溶菌酶应用于生产实践溶菌酶应用于生产实践,还有很多工作需要做。例如还有很多工作需要做。例如,由于改造后酶的空间结构发生了变化由于改造后酶的空间结构发生了变化,因此它的一些基本特性需因此它的一些基本特性需要重新明确要重新明确,包括它能耐受的温度范围、催化反应的最适温度、包括它能耐受的温度范围、催化反应的最适温度、酶活力的大小等酶活力的大小等;需要建立规模化生产该酶的技术体系需要建立规模化生产该酶的技术体系,评估生产评估生产成本等。成本等。习题巩固习题巩固Exercises to consolidate1.某动物体内含有研究者感兴趣的目的基因，研究者欲将该基因导入大肠杆菌的质粒中保存。该质粒含有氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、LacZ 基因及一些酶切位点,其结构和简单的操作步骤如下图所示。习题巩固习题巩固Exercises to consolidate请根据以上信息回答下列问题。（1）在第步中,应怎样选择限制酶？应选择用应选择用相同的限制酶相同的限制酶或或切割能产生相同末端的限制酶切割能产生相同末端的限制酶切切割质粒和含有目的基因的割质粒和含有目的基因的DNA 片段，并且注意限制酶的切割片段，并且注意限制酶的切割位点不能位于目的基因的内部，以防破坏目的基因，限制酶也位点不能位于目的基因的内部，以防破坏目的基因，限制酶也不能破坏质粒的启动子、终止子、标记基因、复制原点等结构。不能破坏质粒的启动子、终止子、标记基因、复制原点等结构。（2）在第步中，为了使质粒DNA与目的基因能连接，还需要在混合物中加入哪种物质？加入加入DNA连接酶连接酶习题巩固习题巩固Exercises to consolidate（3）选用含有 AmpR 和 LacZ 基因的质粒进行实验有哪些优势？该质粒便于进行双重筛选。标记基因该质粒便于进行双重筛选。标记基因 AmpR 基因可用于基因可用于检测质粒是否导入了大肠杆菌，一般只有导入了质粒的大肠检测质粒是否导入了大肠杆菌，一般只有导入了质粒的大肠杆菌才能在添加了青霉素的培养基上生长。而由于杆菌才能在添加了青霉素的培养基上生长。而由于 LacZ 基基因的效应，这些生长的菌落可能出现两种颜色：含有空质粒因的效应，这些生长的菌落可能出现两种颜色：含有空质粒(没有连接目的基因的质粒没有连接目的基因的质粒)的大肠杆菌菌落呈蓝色；含有重的大肠杆菌菌落呈蓝色；含有重组质粒的大肠杆菌菌落呈白色。组质粒的大肠杆菌菌落呈白色。习题巩固习题巩固Exercises to consolidate（4）含有重组质粒的大肠杆菌菌落将呈现什么颜色？为什么？含有重组质粒的大肠杆菌菌落呈白色。含有重组质粒的大肠杆菌菌落呈白色。因为目的基因的插入破坏了因为目的基因的插入破坏了 LacZ基因的结构，使其不能基因的结构，使其不能正常表达，形成正常表达，形成 B-半乳糖苷酶，底物半乳糖苷酶，底物 X-gal也就不会被分解。也就不会被分解。2.科学家将 Or3/4、Sox2、c-Myc 和 KIf4 基因通过逆转录病毒转入小鼠成纤维细胞中，然后在培养ES细胞的培养基上培养这些细胞。2-3周后,这些细胞显示出ES细胞的形态、具有活跃的分裂能力，它们就是iPS细胞。请回答下列问题。习题巩固习题巩固Exercises to consolidate（1）在这个实验过程中，逆转录病毒的作用是什么？逆转录病毒是载体，能将外源基因逆转录病毒是载体，能将外源基因Oct3/4、Sox2、c-Myc和和KIf4送入小鼠成纤维细胞。送入小鼠成纤维细胞。（2）如何证明iPs细胞的产生不是由于培养基的作用？可以设置对照组。将转入外源基因和没有转人外源基因的可以设置对照组。将转入外源基因和没有转人外源基因的细胞分别培养在相同的培养基中，并确保其他培养条件相同。细胞分别培养在相同的培养基中，并确保其他培养条件相同。如果只有转入外源基因的细胞转化成了如果只有转入外源基因的细胞转化成了iPS细胞，就可以证明细胞，就可以证明iPS细胞的产生不是由于培养基的作用。细胞的产生不是由于培养基的作用。习题巩固习题巩固Exercises to consolidate（3）如果要了解 Or3/4、Sox2、c-Myc 和 KIf4 基因在诱导iPs细胞时，每个基因作用的相对大小，该如何进行实验？请你给出实验设计的思路。可以依次去掉可以依次去掉1个基因，将其他个基因，将其他3个基因转入小鼠成纤维细胞个基因转入小鼠成纤维细胞中，然后通过与转入中，然后通过与转入4个基因的小鼠成纤维细胞的诱导情况进行个基因的小鼠成纤维细胞的诱导情况进行比较，来推测缺失的那个基因对诱导比较，来推测缺失的那个基因对诱导iPS细胞的影响，进而判断细胞的影响，进而判断每个基因作用的相对大小。（其他合理答案均可）每个基因作用的相对大小。（其他合理答案均可）习题巩固习题巩固Exercises to consolidate（4）若将病人的皮肤成纤维细胞诱导成iPs细胞，再使它转化为需要的细胞，用这些细胞给该病人治病，这是否会引起免疫排斥反应?为什么？iPS细胞具有分裂活性，用它进行治疗时可能存在什么风险？不会引起免疫排斥反应，因为在诱导转化的过程中细胞不会引起免疫排斥反应，因为在诱导转化的过程中细胞的遗传物质没有发生变化，理论上产生的还是的遗传物质没有发生变化，理论上产生的还是“自体自体”细胞。细胞。iPS细胞拥有分化为各种细胞的潜能，因此存在分化成肿瘤细细胞拥有分化为各种细胞的潜能，因此存在分化成肿瘤细胞的风险。胞的风险。习题巩固习题巩固Exercises to consolidate3.水稻根部一般没有根瘤菌，在种植时常需要施加氮肥。科学家想利用基因工程技术来减少施用氮肥的生产成本及可能造成的环境污染，他们提出了以下两种方案。方案一把根瘤菌的固氮相关基因导入水稻根系微生物中，使微生物能在根系处固氮，从而减少氮肥的施用量。方案二直接将固氮相关基因导入水稻细胞中，建立水稻的“小型化肥厂”，让水稻直接固氮，这样就可以免施氮肥了。习题巩固习题巩固Exercises to consolidate(1)请评估这两种方案哪种更容易实现。从亲缘关系的远近来看，固氮相关基因可能更容易在水稻根从亲缘关系的远近来看，固氮相关基因可能更容易在水稻根系微生物中稳定存在和表达，进而使其具有固氮的能力。系微生物中稳定存在和表达，进而使其具有固氮的能力。(2)如果两个方案都实现的话，你认为哪种更值得推广？请说出你的理由。此题不要求有唯一的答案，学生可从便捷性、安全性、经济此题不要求有唯一的答案，学生可从便捷性、安全性、经济性等角度进行分析，言之成理即可。例如，从便捷性角度认为能性等角度进行分析，言之成理即可。例如，从便捷性角度认为能固氮的水稻新品种更值得推广；或从转基因安全性角度认为能固固氮的水稻新品种更值得推广；或从转基因安全性角度认为能固氮的水稻根系微生物更值得推广等。氮的水稻根系微生物更值得推广等。