套式PCR结合基因测序鉴定象科动物物种的研究.doc

套式PCR结合基因测序鉴定象科动物 物种的研究学 院：专 业：姓 名：指导老师：材料与环境学院生物工程张嘉欣学 号：职 称：160504104042马文英、罗宝正教授、研究员中国·珠海二二年五月北京理工大学珠海学院2020届本科生毕业论文诚信承诺书本人郑重承诺：本人承诺呈交的毕业论文套式PCR结合基因测序鉴定象科动物物种的研究是在指导教师的指导下，独立开展研究取得的成果，文中引用他人的观点和材料，均在文后按顺序列出其参考文献，设计使用的数据真实可靠。本人签名： 张嘉欣 日期： 2020 年 05 月 10 日套式PCR结合基因测序鉴定象科动物物种的研究摘 要为建立一种能准确鉴别象科动物物种的技术方法，本研究针对象科动物基因保守序列，设计并筛选出2对特异性引物，建立了以象科动物物种为对象的套式PCR结合测序的鉴定方法。并且通过用不同样品及不同浓度样品对该法进行了特异性和灵敏度检验，最后使用本实验中所建立的体系与程序对技术中心的3份象牙样品进行了三次重复检测。特异性结果表明该方法可以检测出现代象、猛犸象象牙DNA样品，对其他有类似牙、骨构造的动物物种DNA样品不扩增；灵敏度试验结果表明套式PCR对象科动物物种DNA样品的检测灵敏度高于荧光PCR10倍；3份临床样品能得到较好的测序结果，测序结果对现代象、猛犸象的物种鉴别较为清晰。本研究建立的套式PCR方法能对象牙及象牙制品进行有效、准确的鉴定，对国内关于象牙及象牙制品贸易的监管有一定的帮助。关键词：套式PCR；荧光PCR；基因测序；象科动物Identification of Elephant Species by Nested PCR and Gene SequencingAbstractIn order to establish a technical method that can accurately identify elephant species, this study designed and screened two pairs of specific primers for the conserved sequences of elephant species, and established nested PCR combined sequencing for elephant species. Identification method. And by using different samples and samples of different concentrations to test the method for specificity and sensitivity, and finally using the system and procedure established in this experiment, the three ivory samples of the technical center were tested three times repeatedly. After specificity and sensitivity tests and clinical sample testing, the following relevant results were obtained.The specific results show that the method can only detect DNA samples of modern elephant and mammoth ivory, and does not amplify DNA samples of other animal species with similar teeth and bone structures;The sensitivity test results show that the detection sensitivity of the nested PCR target animal species DNA samples is 10 times higher than that of fluorescent PCR;Three clinical samples can get better sequencing results, which can clearly identify the species of modern elephants and mammoths. The nested PCR method established in this study can effectively and accurately identify ivory and ivory products, which is helpful for the supervision of domestic trade in ivory and ivory products.When there are ivory and its products in circulation, it can be identified according to this method.Keywords: Gene sequencing; Quantitative Real-time PCR; Elephantidae目 录1 前言12材料与方法32.1材料32.1.1样品32.1.2试剂32.1.3仪器42.2方法42.2.1引物设计与合成42.2.2样品的提取42.2.3套式PCR反应条件优化52.2.4特异性试验52.2.5灵敏度试验52.2.6样品检测62.2.7序列测序验证63结果与分析83.1内外引物设计与合成83.2套式PCR反应条件优化83.3特异性试验103.4灵敏度试验113.5 临床样品检测124结论14参考文献16谢辞1818北京理工大学珠海学院2020届本科生毕业论文1 前言大象，是人们并不陌生的一种动物。如今世界上的象科动物分为两个属，分别是非洲象属和亚洲象属。其中，非洲象属又有非洲森林象和非洲草原象，而亚洲象则是亚洲象属的唯一一个物种。同时，在12万年前已灭绝的猛犸象亦同属于长鼻目。象牙指的是雄性象或猛犸象的獠牙。由于象牙的颜色洁白细润、纹理天然高雅、质地坚硬又具韧性的特点，成为雕刻品的优等原料。象牙制品常以其高贵独特的颜色与滑润纯净的质地与光泽受到人们的喜爱与追捧。象牙雕刻技术在中国传统艺术的历史中占据十分重要的地位，技艺十分精湛，象牙制品有实用器具、首饰、装饰摆件等分类。但随着象牙雕刻技术的发展与象牙制品日渐受到越来越多人的追捧，促进了人们对大象的猎杀，从而获取象牙以牟得极高的利润。象科动物的生存因此受到了极大的威胁，其所生活的环境与状态亦被破坏，这导致了近百年来象种群数量持续下降，非洲象被列为濒危动物。为了保护野生象群，对象牙制品的国际贸易进行规范并严格控制，濒危野生动植物种国际贸易公约(CITES)在二十几年内先后将亚洲象和非洲象的所有种群列入附录，也禁止了现代象牙的国际贸易。全球象种群的数量也因此有所回升，其生存情况得到一定的改善，甚至一度非洲象的种群数量还超过了居住地的土地承载能力。于是从1997年开始，CITES在管理之下从非洲定向输出象牙。我国也经过对象牙相关的监管措施不断进行完善之后，于2008年成为非洲合法象牙的贸易伙伴国。后来，我国通过拍卖从非洲引进了60余吨非洲象牙原料，这成为1989年至今中国唯一合法获得的象牙原材。直到2018年1月1日，我国全面禁止象牙贸易1。虽然现在已经禁止了象牙的贸易往来，但由于我国曾进口过一批象牙原料，且在象牙制品受到管制之后，也出现了一些替代品，如塑料、骨制品、树脂类等2，而已灭绝的猛犸象牙不受CITES公约管制，这对市场上流通的象牙制品的真伪及物种鉴别增加了许多难度。许多仿象牙制品仅凭肉眼从外观上看并无太大区别，而猛犸象牙与现代象牙虽有所区别，但结构特征仍具有相似性。象牙制品已改变了象牙原本的形状，仅从它们的结构上看并不能准确鉴别象牙物种。因此，对于象牙及象牙制品分为以下几种较有针对性的检测、鉴别方法。（1）紫外荧光法象牙、象牙制品及其替代品等在紫外光的辐照下，会受到激发从而发出可见光。在天然的象牙及制品、替代品中，因其含有羟基磷灰石成分，可在波长为365nm的紫外灯照射下呈现荧光反应，从而对象牙、象牙制品及其替代品进行甄别。（2）红外光谱分析法 在红外线照射下，与其分子振动频率一致的红外光会被牙、骨类物品所吸收。要进行观察是否为象牙或象牙制品，可以使用傅里叶变换红外光谱仪、红外显微镜来达到目的。（3）施氏角观察法象牙横截面上具有施氏结构（Schreger pattern），这是一种特别的呈网状的三维空间结构模式。通过对施氏角的角度的观察，可以初步判断象牙的物种。通过许多研究进行证明，外援施氏角的平均值可以作为认定猛犸象牙和现代象牙的初步条件，其中，猛犸象为<100°，现代象牙为>115°3。（4）分子生物学法 利用DNA检测技术对象牙、象牙制品的遗传物质进行检测，可进行鉴定真伪及其分类。能够鉴别非洲象牙与亚洲象牙。 本实验采用分子生物学法，利用套式PCR结合基因测序，对现代象牙和猛犸象牙的物种种类进行研究。套式PCR由普通的PCR反应变化而来，其使用两对不同的PCR引物来对完整片段进行两次扩增。第二对引物的结合处于第一轮PCR的产物内部，因此被称为“巢式引物”。不同于一般的PCR反应，由于套式PCR进行了两次扩增，第二轮PCR的扩增片段的长度与第一轮的扩增片段相比，不如第一段的扩增片段长。与普通的PCR相比较，套式PCR具有一定的优点。由于很少有序列能够和两轮反应的两套引物都进行互补，当在第一次扩增的过程中有错误的片段产生时，那么在第二轮反应中，在第一轮产生的错误片段上再进行引物的配对并且扩增的概率是极低的。因此套式PCR进行两次扩增的程序及操作能够保证整个反应的准确性、可行性。当模板DNA的含量比较低的时候，仅通过一轮PCR难以得到比较满意的结果。但是用套式PCR进行扩增便可以避免这样的情况，得到较好的结果。因此，套式PCR常应用于模板DNA含量较低的情况下。套式PCR在与常规的PCR所需条件大致相同的情况下，其特异性与灵敏性与后者相比都有所提高，在生物医学、微生物学、生物信息学等方面有着十分广泛的应用，常用于流行病学的调查和临床常规检测。刘婷婷等针对H3亚型禽流感病毒建立巢式PCR检测方法，以此对检测的敏感性、准确性进行提高4；陈绍品等根据LSmL蛋白在细胞内转录及表达水平较低的特点，利用了巢式PCR方法对Marcl45细胞源LSmL基因进行扩增5；李志强等对糙皮侧耳和阿魏侧耳的拓扑异构酶部分基因序列的扩增采用了常规PCR、降落PCR及套式PCR，结果表明套式PCR的灵敏度和准确性都优于常规PCR与降落PCR，且灵敏度超过常规PCR的100倍，说明其更适合于扩增兼并引物6。除常规的套式PCR外，套式PCR还有如半巢式PCR、反转录巢式PCR等的其他扩增形式。奉彬等根据鸡细小病毒（ChPV）的保守基因NS1设计了3条特异性引物，针对ChpV建立了能快速进行检测的半巢式PCR方法，并且对其进行了优化7。实时荧光定量PCR在DNA扩增反应的过程中能够通过荧光信号的积累对整个PCR进程的变化进行监测。其可以通过SYBRGreen法和荧光探针法两种方法来进行检测。其中，“荧光探针法”在PCR反应体系中加入了荧光标记探针或染料，这可以帮助其实现定量功能。在本实验中，使用了荧光探针法对不同浓度的象牙DNA样品进行检测。在荧光PCR反应进行的过程中，反应产物不断积累，荧光信号强度也等比增加，从而能够得到一条对应的荧光扩增曲线图。荧光PCR可于分子生物学研究及医学研究领域得到应用 。徐婷婷对荧光定量PCR的应用进行了总结，其在兽医学、畜牧业、动物检测、食品安全、水产动物研究、医学与药物开发均得到应用8。任名等建立 TaqMan 探针法荧光定量 PCR 检测方法对非洲猪瘟病毒（ASFV）进行检测，其使用方便快捷，且具有较高的灵敏度9。 本研究结合套式PCR与基因测序的方法，对象牙及其制品的所属动物物种进行鉴定，同时通过套式PCR与荧光PCR对不同浓度的象牙DNA样品的扩增结果进行两种方法的灵敏度对比，从而对套式PCR的灵敏度进行说明。2材料与方法2.1材料2.1.1样品现代大象象牙、猛犸象牙及象牙制品；犀牛、牛、穿山甲、驴、猪DNA提取物2.1.2试剂 表2.1 试剂生厂商与规格试剂生产公司规格TL BufferOMEGA60mLOB Protease Solution1.4mLBL Buffer60mLHBC Buffer80mLDNA Wash Buffer20mLElution Buffer120mL2×Superstart Premix plus-UNG珠海宝锐科技有限公司2×（接上表）试剂生产公司规格5×Sequencing BufferApplied Biosystems5×BigDye2×20mL2× Taq PCR MixTIANGEN2×2.1.3仪器 表2.2 仪器生产商与型号仪器生产公司型号台式冷冻离心机eppendorf5424R干浴器IKADry Block Heater 4手掌型离心机QILINBEIERLX-100多头PCR仪BIO-RADC1000 Touch凝胶成像仪Alpha InnotechAlphaimager HP电泳仪JUNYIJY600C基因分析仪HITACHI35002.2方法2.2.1引物设计与合成根据GenBank中的象牙基因序列，用DNAMAN8软件进行比对。筛选出保守序列后，利用OLIGO7软件进行特异性引物设计，并通过BLAST验证。引物均由上海辉睿生物科技有限公司合成。2.2.2样品的提取1)取样:用75%酒精棉仔细擦拭象牙表面，用电钻小心刮磨象牙表面，于不同位置取30mg左右的样品粉末于1.5mL离心管中2)脱钙:加入1mL 0.5 mol/L的EDTA溶液，常温过夜3)提取:加入200L TL Buffer; 加入25L OB Protease Solution；置于干浴器55加热2小时4)12000r/min进行5分钟离心,将上清液转移至1.5mL离心管中，加入220L BL Buffer,干浴器70加热10分钟5)加入220L无水乙醇，取DNA微柱置于2mL收集管上，待溶液混匀后转移至DNA微柱中，12000r/min离心1分钟，滤于2mL收集管中6)往滤液中加入500L HBC Buffer，于12000r/min进行30秒离心后弃去滤液7)将微柱和1.5mL离心管于12000r/min离心30秒，弃去滤液及收集管8)将微柱置于1.5mL离心管中，往微柱中加入50L Elution Buffer,于12000r/min离心1分钟9)弃去微柱，样品于-20保存2.2.3套式PCR反应条件优化两轮PCR扩增体系均采用25L反应体系，将第一轮PCR反应的扩增产物作为第二轮PCR反应的模板。 表2.3 套式PCR反应体系组分组分名称加入量2×Taq PCR Master Mix12.5L上、下游引物(10 pmol/L)各加入0.5L模板DNA2LRNase free water补充至25L通过所设计引物的Tm值对PCR扩增的退火温度进行探究，在45-55做温度梯度试验，最后确定本实验中套式PCR的最佳反应体系及反应程序。2.2.4特异性试验利用前面的实验所确定的套式PCR反应体系及程序，同时扩增现代象、猛犸象、穿山甲、犀牛、牛的DNA提取样品，以1份现代象牙的DNA提取物作为阳性对照，以驴的DNA提取物作为阴性对照，以蒸馏水作为空白对照，扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测其特异性。2.2.5灵敏度试验将象牙样品进行10倍倍比稀释，使其浓度为原浓度的1x10-1至1x10-9倍。分别用本研究确定的套式PCR体系及程序以及荧光PCR对1x10-1至1x10-9倍数稀释的样品进行扩增，对照与前相同，比较2种方法的灵敏度。荧光PCR的体系为20L，见表 表2.4 荧光PCR体系 组分名称加入量2xSuperstart Premix plus-UNG12.5L上下游引物及探针2.5L模板DNA2LRNase free water补至20L荧光PCR程序见下表 表2.5 荧光PCR程序步骤温度时间循环消化502分钟5个预循环40个循环热启动955分钟变性9530秒退火4530秒延伸7230秒变性9515秒退火/延伸5530秒2.2.6样品检测将技术中心的3份象牙样品的DNA提取物应用本研究所建立的套式PCR体系及程序进行检测，重复3次，保证试验的准确性。2.2.7序列测序验证1)PCR产物纯化在经过套式PCR反应扩增的产物中加入300L Binding Buffer, 于60干浴器放置5分钟加热。于2mL收集管中放置微柱，倒入溶液离心1分钟过柱，弃去滤液。再次加入300L Binding Buffer，重复离心过柱操作，弃去滤液。往微柱中加入700L SPW Buffer，离心1分钟过柱，弃去滤液。再次往微柱中加入700L SPW Buffer，重复离心过柱操作，弃去管中收集的滤液。将微柱置于1.5mL离心管中，往微柱中加入30L Elution Buffer，离心1分钟过柱进行洗脱。弃去微柱，收集滤液，置于-20冰箱保存。2)测序PCR测序PCR体系为20L，见表表2.6 象牙扩增产物测序上游引物体系组分名称加入量5×Sequencing Buffer3.75LBig Dye0.5L上游引物0.36L纯化后样品1LRNase free water补至20L表2.7 象牙扩增产物测序下游引物体系组分名称加入量5×Sequencing Buffer3.75LBig Dye0.5L下游引物0.36L纯化后样品1LRNase free water补至20L测序PCR程序见下表：表2.8 象牙扩增产物测序PCR程序步骤温度时间循环预变性961分钟25个循环变性9610秒退火5010秒延伸604分钟结束4-3)DNA纯化于测序PCR反应产物中加入50L 无水乙醇、2L EDTA及2L NaAc溶液，于12000r/min离心30分钟后小心弃去上清液。往管中加入100L 75%乙醇溶液，再次离心30分钟，小心弃去上清液。再次加入100L 75%乙醇溶液，重复离心30分钟，弃去上清液，烘干。4)测序将已烘干的样品置于冰盒上加入10L Hi-Di甲酰胺溶液，用小型离心机离心混匀，加热4分钟使样品溶解变性，迅速置冰盒上5min。取10L样品上样进行测序检测。5） 测序结果比对 测序结束后，将测序结果的碱基序列拷贝至NCBI网站利用BLAST进行比对。3结果与分析3.1内外引物设计与合成表3.1 内、外引物序列信息引物名称引物序列Xiang341F(上游外引物)GGACTCCTACCATGACTAATGAXiang341(下游外引物)CCAATGTGTGTGTATAGGCAGAGXiangkeF2(上游内引物)CACCCGAAAATCTCACCCXiangkeR2(下游内引物)AAAAGATAGATGCTCCGTT3.2套式PCR反应条件优化两轮PCR扩增体系都采用25L反应体系，将第一轮PCR反应的扩增产物作为第二轮PCR扩增反应的模板。表3.2 象牙DNA的套式PCR反应体系组分组分名称加入量2×Taq PCR Master Mix12.5L上、下游引物(10 pmol/L)各加入0.5L模板DNA2LRNase free water补充至25L套式PCR反应程序见下表。表3.3 象牙DNA第一轮PCR反应程序步骤温度时间循环预变性954分钟30个循环变性9515秒退火5515秒延伸721分钟延伸725分钟结束4-表3.4 象牙DNA第二轮PCR反应程序步骤温度时间循环预变性954分钟35个循环变性9515秒退火5515秒延伸721分钟延伸725分钟结束4-3.3特异性试验图3.1 套式PCR特异性试验电泳图注：M，DNA标准分子质量；1，阳性对照；2，现代象；3，现代象；4，猛犸象；5，犀牛；6，牛；7，猪；8，阴性对照；9，空白对照。特异性试验结果显示，经过套式PCR扩增，只有现代象、猛犸象象牙样品出现特异性条带，而其他样品均未有明显条带，表明该方法特异性较好。3.4灵敏度试验由图2、3可知，本实验建立的套式PCR方法对象牙样品的检测下限比荧光PCR方法对象牙样品的检测灵敏10倍，说明该方法具有较好的灵敏度。3.5 临床样品检测测序结果如下：样品1:非洲象F:AACCCCATCCAAACAATCTCAACATGATGAAATTTCGGCTCACTACTATAGAGCATGCCTAATTACCCAAATCCTAACAGGATTATTCCTAACCATACATTATACACCCGACACAATAACTGCATTTTCATCTATATCCCATATTTGCCGAGATGTGAACTACGGCTGAATTATTCGACAACTACACTCAAACGGAGCATCTATCTTTTAATCR:GTGAGCCCAAATTTCCTCATGTTGAGATGTTGGATGGGGTAGGTAGATCAATGAAGGATTTATTGATGATTTTAAGTAAGGGGTGAGATTTTCGGGTG 图3.5 样品1测序结果样品2:猛犸象F:AATGCCTAACTACCCAAATCCTAACAGGGTTATTTCTAGCCATACATTATACACCTGACACAATAACTGCATTTTCATCTATATCCCATATCTGCCGAGATGTCAACTACGGTTGAATTATTCGACAACTACACTCAAACGGAGCATCTATCTTTR:TCTCGGCAGATATGGGATATAGATGAAAATGCAGTTATTGTGTCAGGTGTATAATGTATGGCTAGAAATAACCCTGTTAGGATTTGGGTAGTTAGGCATGCTCCTAGTAGTGAGCCGAAATTTCATCATGTTGAGATGTTAGATGGGGTGGGTAGATCAATGAAGGATTTATTAAGGATTTTAAGTAGGGGGTGAGATTTTCGGGTGA 图3.6 样品1测序结果样品3:非洲森林象F:ACCCCATCCAATATCTCAGCATGATGAAATTTCGGCTCACTATTAGGAGCATGCCTGATTACCCAAATCCTAACAGGATTATTCCTAGCCATACACTACATACCCGACACAATAACCGCATTTTCATCTATATCCCATATCTGCCGAGACGTCAACTATGGCTGAATTATTCGACAACTACACTCAAACGGAGCATCTATCTTTTR:TGTAGTGTATGGCTAGGAATAATCCTGTTAGGATTTGGGTAATCAGGCATGCTCCTAGTAGTGAGCCGAAATTTCATCATGCTGAGATATTGGATGGGGTAGGTAGATCAATAAAAGATTTATTGATAATTTTAAGTAGAGGGTGAGATTTTCGGGTGA 图3.7 样品3测序结果由图3.5、图3.6、图3.7表明本实验建立的套式PCR对象牙DNA样品的扩增效果较好，经测序后的序列分析发现，样品1为非洲象，样品2为猛犸象，样品3为非洲森林象。测序结果一致性均达到96%左右或以上，设计的引物能有效地用于现代象牙与猛犸象牙的区分，能较为准确地对象牙所属物种进行鉴定。 4结论象科动物之所以成为濒危动物，很大部分是由于人类对于象牙及象牙制品的追捧从而导致的对大象的大肆猎杀。为加强对象牙及象牙制品的国际贸易、走私行为的管理，保护野生象群，维护象群良好的生存环境，便需要能够对象牙及象牙制品、替代品、仿冒品等进行准确鉴定的有效的方法。因此，建立一种能够区分现代象牙与猛犸象牙，并能鉴定象牙物种及其来源的方法尤为重要。套式PCR通过两轮PCR对两对引物进行扩增，与一般的PCR相比，其具有诸多优点。对于经过普通PCR未能得到较好的扩增产物的样品，可通过套式PCR扩增可产生明显效果。同时，经过两轮扩增，套式PCR对于实验过程中可以对错误进行纠正，得到更为准确的结果。因此，套式PCR是一种特异性好、敏感度高且能得到准确结果的检测方法。以往对于象牙及象牙制品的检测方法无法准确地得到动物物种的信息，对物种鉴定和象牙流通的监管造成较大的困难。本研究通过设计针对象科动物的引物，并建立相关的套式PCR体系与程序，结合基因测序的方法，对象牙及其制品进行检测。检测结果表明本实验建立方法能够较有效地对设计引物进行扩增，该方法具有较好的特异性和较高的灵敏度。通过基因测序结果的比对，证明该方法能够较好地区分现代象牙与猛犸象牙，便于对象科动物物种的鉴别。利用套式PCR结合基因测序鉴定象科动物物种具有较高的特异性、灵敏度与适用性，可较为准确地鉴别象科动物物种，适合用于象牙及象牙制品的鉴定。该方法可提高对象牙制品鉴定的准确性，严格对象牙贸易的监管。但其同时也具有一些不足之处，即在提高准确度的同时，所耗费的时间较长，对检测的仪器设备要求较高，涉及的程序较为繁琐等。解决以上不足，可成为该方法在未来的发展方向。参考文献1胡红.象牙及其制品鉴定技术标准的研究D. 黑龙江哈尔滨：东北林业大学，2010.2成小林.象牙、犀角的特征与鉴定C.中国文物保护技术协会.中国文物保护技术协会第四次学术年会论文集. 北京：科学出版社，2007：430-436.3郭书林.象牙及其制品鉴定方法适用性解析J,文物鉴定与鉴赏, 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