GB 31656.14-2022 食品安全国家标准 水产品中27种性激素残留量的测定 液相色谱-串联质谱法.pdf

中华人民共和国国家卫生健康委员会食品安全国家标准水产品中27种性激素残留量的测定液相色谱-串联质谱法20中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准备案号：XXXX-XXXX67.120.30X31656.142022National food safety standardDetermination of 27 sex hormones residues in fishery productsby liquid chromatography-tandem mass spectrometricGB2022?09?20发布2023?0?01实施发 布国 家 市 场 监 督 管 理 总 局中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部CCSG B 前言本文件按照G B/T 标准化工作导则第部分:标准化文件的结构和起草规则 的规定起草.本文件系首次发布.G B 食品安全国家标准水产品中 种性激素残留量的测定液相色谱串联质谱法范围本文件规定了水产品中 种性激素残留量检测的制样和液相色谱串联质谱测定方法.本文件适用于鱼、虾和蟹可食部分中己二烯雌酚、己烯雌酚、雌酮、己烷雌酚、雌二醇、雌三醇、炔雌醇、苯甲酸雌二醇、群勃龙、诺龙、雄烯二酮、勃地酮、睾酮、炔诺酮、美雄酮、甲基睾酮、康力龙、苯丙酸诺龙、丙酸睾酮、孕酮、羟基孕酮、羟基孕酮、甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲羟孕酮和左炔诺孕酮残留量的测定.规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件.G B/T 分析实验室用水规格和试验方法G B/T 水产品抽样规范术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义.原理试样中残留的性激素用乙酸乙酯甲基叔丁基醚混合溶剂和乙酸乙酯依次提取,提取液经浓缩、C 固相萃取柱净化,用液相色谱串联质谱仪测定,内标法定量.试剂与材料以下所用的试剂,除特别注明外均为分析纯;水为符合G B/T 规定的一级水.试剂 甲醇(CHOH):色谱纯.正己烷(CH):色谱纯.甲基叔丁基醚(CH O):色谱纯.乙酸乙酯(CHO):色谱纯.冰乙酸(CHC OOH).三水乙酸钠(CHN a O HO).氨水(NHHO).溶液配制 乙酸乙酸钠缓冲溶液:取三水乙酸钠 g、冰乙酸 m L,加水适量使溶解并稀释至 m L,混匀.氨水:取氨水 L于 m L水中,混匀.临用前配制.乙酸乙酯甲基叔丁基醚溶液:取乙酸乙酯和甲基叔丁基醚等体积混合.标准品 性激素:己二烯雌酚、己烯雌酚、雌酮、己烷雌酚、雌二醇、雌三醇、炔雌醇、苯甲酸雌二醇、群勃龙、G B 诺龙、雄烯二酮、勃地酮、睾酮、炔诺酮、美雄酮、甲基睾酮、康力龙、苯丙酸诺龙、丙酸睾酮、孕酮、羟基孕酮、羟基孕酮、甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸甲羟孕酮和左炔诺孕酮:含量,具体见附录A.内标:己烯雌酚 D、雌酮 D、雌二醇 C、甲基睾酮 D、孕酮 D、左炔诺孕酮 D和甲羟孕酮 D:含量,具体见附录A.标准溶液制备 标准储备液:取性激素类标准品各 m g,精密称定,分别用甲醇适量使溶解并定容于 m L棕色容量瓶,配制成浓度均为 g/m L的标准储备液.以下保存,有效期年.混合标准中间液:准确量取各标准储备液适量,于 m L棕色容量瓶,用甲醇稀释配制成己二烯雌酚、己烯雌酚、雌酮、群勃龙、诺龙、雄烯二酮、勃地酮、睾酮、美雄酮、甲基睾酮、苯丙酸诺龙、丙酸睾酮、孕酮、羟基孕酮、羟基孕酮、甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲羟孕酮浓度均为g/m L;己烷雌酚、雌二醇、左炔诺孕酮、炔诺酮、苯甲酸雌二醇和康力龙浓度均为g/m L;雌三醇和炔雌醇浓度均为g/m L的混合标准中间液.以下保存,有效期个月.混合标准工作液:准确量取混合标准中间液 m L,于 m L棕色容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,配制成己二烯雌酚、己烯雌酚、雌酮、群勃龙、诺龙、雄烯二酮、勃地酮、睾酮、美雄酮、甲基睾酮、苯丙酸诺龙、丙酸睾酮、孕酮、羟基孕酮、羟基孕酮、甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲羟孕酮浓度均为 g/m L;己烷雌酚、雌二醇、左炔诺孕酮、炔诺酮、苯甲酸雌二醇和康力龙浓度均为 g/m L;雌三醇和炔雌醇浓度均为 g/m L的混合标准工作液.以下保存,有效期个月.内标标准储备液:取同位素内标物各 m g,精密称定,分别用甲醇适量使溶解并定容于 m L棕色容量瓶,配制成浓度为 g/m L的内标单标储备溶液.以下保存,有效期年.混合内标工作液:分别准确量取内标储备液适量,于 m L棕色容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,配制成雌二醇 C浓度为g/m L;己烯雌酚 D、雌酮 D、甲基睾酮 D、孕酮 D、甲羟孕酮 D和左炔诺孕酮 D浓度均为g/m L的混合内标工作液.以下保存,有效期个月.材料 C 固相萃取柱:m g/m L,或相当者.微孔尼龙滤膜:m.仪器和设备 高效液相色谱串联质谱仪:配电喷雾离子源(E S I).分析天平:感量 g和 g.高速离心机:r/m i n.涡旋混合器.均质机.旋转蒸发仪.固相萃取装置.梨形瓶:m L.超声波清洗器.塑料离心管:m L和 m L.试样的制备与保存 试样的制备按G B/T 附录B的要求制样.G B a)取均质的供试样品,作为供试试样;b)取均质的空白样品,作为空白试样;c)取均质的空白样品,添加适宜浓度的标准溶液,作为空白添加试样.试样的保存 以下保存.测定步骤 提取取试料g(准确至 g),于 m L离心管中,准确加入 L混合内标工作液和乙酸乙酸钠缓冲液 m L,涡旋 s,加乙酸乙酯甲基叔丁基醚溶液 m L,涡旋m i n,超声 m i n,涡旋混合m i n,于 r/m i n离心m i n,取上层有机相于 m L梨形瓶;残渣用乙酸乙酯 m L重复提取次,有机相合并至梨形瓶中,于 水浴旋转蒸发至干.对蒸干后有油脂残留的样品,用氮气或空气将残留在油脂中的乙酸乙酯吹除干净.加入正己烷m L溶解残留物,备用.净化取C 固相萃取柱,依次用甲醇、正己烷各m L活化.取备用液,过柱,控制流速不超过滴/s;用正己烷 m L淋洗,吹干;用甲醇 m L洗脱,收集洗脱液,于 水浴旋转蒸发至干.准确加入甲醇 m L,涡旋混合m i n,再准确加入水 m L,混合 s,r/m i n,离心m i n,上清液用 m尼龙滤膜过滤,供液相色谱串联质谱测定.基质匹配标准工作曲线的制备分别取 L、L、L、L、L、L混合标准工作溶液于m L玻璃离心管中,分别加混合内标工作液 L,吹干,加入经 和 步骤处理所得的基质空白溶液 m L,混合m i n,配制成激素浓度为n g/m L n g/m L系列基质匹配标准工作液,上机测定.以标准物质特征离子色谱峰的峰面积与内标物特征离子色谱峰的峰面积比值为纵坐标、相应的浓度为横坐标,绘制基质标准工作曲线.求回归方程和相关系数.测定 液相色谱参考条件a)色谱柱:X B r i d g eS h i e l dR P 柱(mm mm,m),或相当者;b)流速:m L/m i n;c)进样量:L;d)柱温:;e)流动相A为甲醇;流动相B为 氨水,梯度洗脱程序见表.表梯度洗脱条件时间,m i nA,B,质谱参考条件a)离子源:E S I;b)喷雾电压:k V;c)离子传输管温度:;G B d)鞘气流速:L/m i n;e)辅助气流速:L/m i n;f)碰撞气压:P a;g)检测方式:多反应监测(MRM),种激素及内标物多反应监测母离子、子离子、碰撞能量和扫描方式见表.表 种性激素及内标物母离子、子离子、碰撞能量和扫描方式序号化合物名称扫描方式母离子m/z锥孔电压V子离子m/z碰撞能量e V内标物己二烯雌酚E S I 己烯雌酚E S I 己烯雌酚 D己烷雌酚E S I 雌酮E S I 雌酮 D雌二醇E S I 雌三醇E S I 炔雌醇E S I 雌二醇 C苯甲酸雌二醇E S I 羟基孕酮E S I 羟基孕酮E S I 醋酸甲羟孕酮E S I 醋酸氯地孕酮E S I 醋酸甲地孕酮E S I 甲羟孕酮E S I 炔诺酮E S I 康力龙E S I 甲羟孕酮 D 孕酮E S I 孕酮 D 左炔诺孕酮E S I 左炔诺孕酮 D 诺龙E S I 苯丙酸诺龙E S I 睾酮E S I 勃地酮E S I 甲基睾酮 DG B 表(续)序号化合物名称扫描方式母离子m/z锥孔电压V子离子m/z碰撞能量e V内标物 群勃龙E S I 甲基睾酮E S I 雄烯二酮E S I 美雄酮E S I 丙酸睾酮E S I 甲基睾酮 D 甲基睾酮 DE S I 孕酮 DE S I 己烯雌酚 DE S I 雌酮 DE S I 左炔诺孕酮 DE S I 甲羟孕酮 DE S I 雌二醇 CE S I 注:为定量离子.测定法 定性测定在同样的测试条件下,试料溶液中激素类药物的保留时间与标准工作液中激素类药物的保留时间之比偏差在 以内;且检测到的离子的相对丰度,应当与浓度相当的校正标准溶液的离子相对丰度一致.其允许偏差应符合表的要求.表定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差单位为百分号相对离子丰度允许偏差 定量测定取试料溶液和基质匹配标准工作液,作单点或多点校准,按内标法定量.基质匹配标准工作液及试料溶液中目标物的响应值均应在仪器检测的线性范围内.在上述色谱质谱条件下,标准溶液特征离子质量色谱图见附录B.空白试验取空白试样,除不加药物外,采用完全相同的测定步骤进行平行操作.结果计算和表述试样中待测药物的残留量按标准曲线或公式()计算.XAA iSCSCiSVAiSASC iSm()式中:X 试样中待测物残留量的数值,单位为微克每千克(g/k g);G B A 试样溶液中待测物的峰面积;AiS 试样溶液中内标的峰面积;AS 标准溶液中待测物的峰面积;A iS 标准溶液中内标的峰面积;CiS 试样溶液中内标浓度的数值,单位为微克每升(g/L);CS 标准溶液中待测物浓度的数值,单位为微克每升(g/L);C iS 标准溶液中内标浓度的数值,单位为微克每升(g/L);V 定容体积的数值,单位为毫升(m L);m 供试试样质量的数值,单位为克(g).方法灵敏度、准确度和精密度 灵敏度本方法己二烯雌酚、己烯雌酚、雌酮、群勃龙、诺龙、雄烯二酮、勃地酮、睾酮、美雄酮、甲基睾酮、苯丙酸诺龙、丙酸睾酮、孕酮、羟基孕酮、羟基孕酮、甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲羟孕酮检测限为 g/k g,定量限为 g/k g;己烷雌酚、雌二醇、左炔诺孕酮、炔诺酮、苯甲酸雌二醇和康力龙的检测限为 g/k g,定量限为 g/k g;雌三醇和炔雌醇的检测限为 g/k g,定量限为 g/k g.准确度本方法己二烯雌酚、己烯雌酚、雌酮、群勃龙、诺龙、雄烯二酮、勃地酮、睾酮、美雄酮、甲基睾酮、苯丙酸诺龙、丙酸睾酮、孕酮、羟基孕酮、羟基孕酮、甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲羟孕酮在 g/k g g/k g添加浓度范围内回收率为 ;己烷雌酚、雌二醇、左炔诺孕酮、炔诺酮、苯甲酸雌二醇和康力龙在 g/k g g/k g添加浓度范围内回收率为 ;雌三醇和炔雌醇在 g/k g g/k g添加浓度范围内回收率为 .精密度本方法的批内相对标准偏差,批间相对标准偏差.G B 附录A(资料性)性激素类药物中英文名称、化学式和C A S号性激素类药物中英文名称、化学式和C A S号见表A .表A 性激素类药物中英文名称、化学式和C A S号中文名称英文名称化学式C A S号己二烯雌酚D i e n e s t r o lC H O 己烯雌酚D i e t h y l s t i l b e s t r o lC H O 己烷雌酚H e x e s t r o lC H O 雌酮E s t r o n eC H O 雌二醇 E s t r a d i o lC H O 雌三醇E s t r i o lC H O 炔雌醇E t h i n y lE s t r a d i o lC H O 苯甲酸雌二醇 E s t r a d i o l b e n z o a t eC H O 羟基孕酮 A a c e t o x y p r o g e s t e r o n eC H O 羟基孕酮D e s o x y c o r t i c o s t e r o n eC H O 醋酸甲羟孕酮M e d r o x y p r o g e s t e r o n eA c e t a t eC H O 醋酸氯地孕酮C h l o r m a d i n o n eA c e t a t eC H C l O 醋酸甲地孕酮M e g e s t r o lA c e t a t eC H O 左炔诺孕酮L e v o n o r g e s t r eC H O 甲羟孕酮M e d r o x y p r o g e s t e r o n eC H O 诺龙N a n d r o l o n eC H O 苯丙酸诺龙N a n d r o l o n ep h e n y l p r o p i o n a t eC H O 睾酮T e s t o s t e r o n eC H O 勃地酮B o l d e n o n eC H O 孕酮P r o g e s t e r o n eC H O 群勃龙T r e n b o l o n eC H O 甲基睾酮 M e t h y l t e s t o s t e r o n eC H O 雄烯二酮A n d r o s t e n e d i o n eC H O 美雄酮M e t h a n d r o s t e n o l o n eC H O 炔诺酮N o r e t h i n d r o n eC H O 康力龙S t a n o z o l o lC H NO 丙酸睾酮T e s t o s t e r o n ep r o p i o n a t eC H O 己烯雌酚 DD i e t h y l s t i l b e s t r o l DC H DO 雌酮 DE s t r o n e DC H DO 雌二醇 CE s t r a d i o l C CC H O 甲羟孕酮 DM e d r o x y p r o g e s t e r o n e DC H DO 孕酮 DP r o g e s t e r o n e DC H DO 左炔诺孕酮 DL e v o n o r g e s t r e l DC H DO甲基睾酮 DM e t h y l t e s t o s t e r o n e DC H DO G B 附录B(资料性)标准溶液及种内标特征离子质量色谱图(g/L)见图B .图B 标准溶液及种内标特征离子质量色谱图(g/L)