细胞生物学课后练习题及答案.pdf

实 验 一 细胞膜的渗透性一、实验目的了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。二、实验原理将红细胞放入数种等渗溶液中，由于红细胞对各种溶质的透性不同，有的溶质可以渗入，有的溶质不能渗入，渗入的溶质能够提高红细胞的渗透压，所以促使水分进入细胞，引起溶血。由于溶质透入速度互不相同，因此溶血时间也不相同。三、实验用品一、器材50m l小烧杯，10ml移液管，试 管(110cm),试管架。二、试剂0.17mol/L 氯化钠、0.17mol/L 氯化镀、0.17mol/L 醋酸胺、0.17mol/L 硝酸钠、0.12mol/L 草酸铉、0.12mol/L 硫酸钠、0.32mol/L 葡萄糖、0.32mol/L 甘油、0.32mol/L 乙醇、0.32mol/L 丙酮。三、材料鸡血四、实验方法一、鸡血细胞悬液取50m l小烧杯一只，加1份鸡血和10份0.17mol/L氯化钠溶液，形成一种不透明的红色液体，此即稀释的鸡血。二、低渗溶液取试管一支，加 入10ml蒸储水，再加 入1ml稀释的鸡血，注意观察溶液颜色的变化，由不透明的红色逐渐澄清，说明红细胞发生破裂造成100%红细胞溶血，使光线比较容易透过溶液。三、羊红细胞的渗透性1 取试管一支，加入0.17mol/L氯化钠溶液10m l,再 加 入1m l稀释的鸡血，轻轻摇动，注意颜色有无变化？有无溶血现象？为什么？2、取试管一支，加入0.17mol/L氯化钠溶液10m l,再 加 入1m l稀释的鸡血，轻轻摇动，注意颜色有无变化？有无溶血现象？若发生溶血，记下时间(自加入稀释鸡血到溶液变成红色透明澄清所需时间)。3、分别在另外8种等渗溶液中进行同样实验。步骤同2。五、实验结果将观察到现象列入下表，对实验结构进行比较和分析。不同低渗溶液下的溶血现象试管编号是否溶血溶血时间结 果 分 析1、10mL氯化钠+1mL稀释的鸡血2、10mL氯化钠+lmL稀释的鸡血3、10mL醋酸镂+ImL稀释的鸡血4、10mL硝酸钠+lmL稀释的鸡血5、10mL草酸铉+lmL稀释的鸡血6、10mL硫酸钠+lmL稀释的鸡血7、10mL葡萄糖+lmL稀释的鸡血8、10mL甘油+lmL稀释的鸡血9、10mL乙 醇+lmL稀释的鸡血10、10mL丙酮+1mL稀释的鸡血六、思考题：1.在进行本实验时，你观察到的是一些细胞的碎片，而不是完整的细胞，请问是什么原因导致的？2.都是等渗溶液，为什么不同溶液的摩尔浓度不一样？实验二烟草愈伤组织的诱导与增殖（培养基配制、外植体的处理与愈伤组织的诱导）（设计、开放性实验）一、实验目的与意义掌握利用叶片作为外植体进行无性繁殖的方法。烟草是重要的经济作物和工业原料作物，其体内所含的烟碱等生物碱是非常宝贵的医药及化工原料，最近证实可利用烟草细胞悬浮培养物获得细胞分裂素类物质。有关烟草的组织培养体系的建立报道很多，利用本试验建立的烟草组培快繁体系，可以为利用农杆菌的遗传转化来改良烟草品种和利用烟草细胞培养物进行烟碱等次生物质的生产奠定基础。二、实验器材超净工作台、镶子、解剖刀、酒精灯、棉球、烧杯、广口瓶、培养皿三、实验药品及材料0.1%升汞、酒精、次氯酸钠、无菌水、培养基母液、2,4-D、N A A、KTo四、实验步骤1、培养基配置诱导烟草愈伤组织的培养基为：MS+2,4-Dl.O mg/L（单位F同）+NAA2.0+KT0.5,pH 5.8。2 .接种室的清洁和消毒：接种前半小时.，可用7 5%酒精或新洁尔灭喷洒或开电子灭菌器半小时;地板用湿拖把拖刷。超净工作台在接种前用7 5 对酉精揩抹工作台面和有关用具，并先开机鼓风1 5 分钟后才能使用。3 .外植体的选择、分离：选择无病害的健壮叶片或茎段若干（平均每人3-5 段）。先用漂白粉清洗，置流水下冲洗上1.5 小时。4 .外植体的灭菌在超净工作台上用7 5%的酒精溶液浸泡1 5 秒一用1 0%次氯酸钠溶液浸泡1 5 分钟+吐温3-4 滴 无 菌 水 冲 洗 4-5 次f置滤纸匕吸水5 .外植体的接种与培养在无菌条件下，用经过灭菌的解剖刀将茎段切割成若干小段，或将叶片切成1 c m，大小，打开培养瓶盖子（或试管塞子）用经过灭菌的镀子将外植体种植于培养容器内，然后盖上盖子并拧紧（或塞上塞子），每班统一写上接种日期和外植体名称即转入培养室内培养，室内温度2 3 2 5 ,光强为1 0 0 0 2 0 0 0 L ux,每天光照约1 4 小时。注意：植物生长调节剂是诱导愈伤组织形成的极为重要的因素，研究具体问题要设置一定的浓度梯度，以寻找最佳浓度。约 2-3 d 后，叶片外植体卷曲、增厚、膨胀，1 5d 后外植体脱分化形成疏松絮状浅黄绿色的愈伤组织。五.思考题1、观察接种的外植体在接种1周后产生愈伤组织的颜色和质地，计算愈伤组织诱导率。愈伤组织诱导率（）=（形成愈伤组织的材料数/总接种材料数）X100%2、分析影响愈伤组织诱导和分化的主要原因。附(一)培养基配制(以IL MS培养基为例)1、计量根据配制培养基的量和母液的浓度计算需要吸取母液的量，计算公式：吸 取 量 ml=培养基中物质的含量(mg/L)X 1000ml/母液浓度(mg/L)2、移液取医用瓷缸一只，按照计算吸取母液的量依次吸取各母液置于医用瓷量杯中备用。注意：在使用提前配制的母液时，应在量取各种母液之前，轻轻摇动盛放母液的瓶子，如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染，应立即淘汰这种母液，重新进行配制。用量筒或移液管量取培养基母液之前，必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗2 次。量取母液时，最好将各种母液按将要量取的顺序写在纸上，量 取 1种，划 掉 1种，以免出错；移液管不能混用。3、称取称取8g琼脂，30g蔗糖备用4、融化用搪瓷量杯量取600 700ml的蒸僧水放在电炉上，加入琼脂，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状将其取下，加入蔗糖。注意：在加热琼脂、制备培养基的过程中，操作者千万不能离开，否则沸腾的琼脂外溢，就需要重新称量、制备。此外，如果没有搪瓷量杯，可用大烧杯代替。但要注意大烧杯底的外表面不能沾水，否则加热时烧杯容易炸裂,使溶液外溢，造成烫伤。5 混合将融化的琼脂和母液充分混合，用蒸储水定容到1000ml,来回混合几次。6、调 pH用滴管吸取物质的量浓度为1 mol/L的 NaOH或 HC1溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用精密的pH试纸(5.4-7.0)测培养基的pH,直到培养基的pH达到要求为止(在调制时要比目标pH值偏高 0.20.5 个单位，因为培养基在灭菌过程中由于糖等物质的降解，pH值会下降0.20.5 个单位左右)。注意：调至时要用玻璃棒不停的搅拌，使其充分混合。7、分装溶化的培养基应该趁热分装。分装时，先将培养基倒入烧杯中，然后将烧杯中的培养基倒入锥形瓶(50 ml或 100 ml)中。注意不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上。锥形瓶中培养基的量约为锥形瓶容量的1/5 1/4。每1L培养基，可分装25 30瓶。8、包扎用封口膜封口，外边可加一层牛皮纸，扎好绳子，用铅笔或碳素墨水笔在牛皮纸上写上培养基的代号。注意：培养基中的部分成分在高温灭菌时易发生化学变化，致使培养基p H 值降低，从而使琼脂凝固力下降，发生培养基灭菌前凝固，灭菌后不凝固现象。避免此现象发生的方法是:调整培养基p H 值，一般不低于5.6,若需酸性较强培养基，可适当增加琼脂用量。附(二)培养基的灭菌培养基中含有大量的有机物质，特别含糖量较高，是各种微生物滋生、繁殖的好场所。而接种材料需要在无菌条件下培养很长时间，如果培养基被污染，则达不到培养的预期结果。因此，培养基的灭菌，是植物组织培养中十分重要的环节 常用的灭菌方法是高压灭菌和过滤除菌。1、高压蒸汽灭菌法把分装好的培养基及所需灭菌的各种器具、蒸储水等，放入高压蒸汽灭菌锅的消毒桶中，外层锅内加水,水位高度不超过支架高度。盖好锅盖，上好螺丝，注意上螺丝要对角线上。加热后，锅上压力表指针开始移动,当指针移至O.S k g/c n?时，扭开放气阀排除冷空气，使压力表指针回复零位。当指针移至1 1.2k g/c m 2时，即 121时，维持一定的时间。由于容器的体积不同，瓶壁的厚度不同，所以灭菌的时间也要适当考虑，具体可以参考表1。灭菌后要趁热取出三角瓶，不可久不放汽，让压力锅自行冷却，这样易将棉塞等闷得太湿，引起后来长霉污染。培养基自然冷却凝固。放 置 1 d 后再使用。表 1 培养基高压蒸汽灭菌所必须的最少时间注意:容器的体积(ml)在 12 C 卜.最少灭菌时间(min)20-50157515020250 50025100030150035200040(1)锅内冷空气必须排尽，否则压力表指针虽达到一定压力，但由于锅内冷空气的存在事实上达不到应有的温度，因而影响灭菌效果。当达到一定压力后，注意在保持压力过程中，严格遵守灭菌时间，时间过长会使一些化学物质遭到破坏，影响培养基成分，时间短则达不到灭菌效果。对蒸储水，各种器具灭菌时，灭菌时间要适当延长，压力也要提高，一般在126 维持一个小时。另外三角瓶中的液体不超过总体积的7 0他 否 则当温度超过100时，培养基会喷溢，造成培养瓶壁和封口膜的污染。(2)消毒后的培养基不能立即用于接种，而应放置24-7 2h。放置后如果培养基中没有出现菌落，则说明培养基是无菌的，才可以用于接种。另外做好的培养基一般应在1-2周内用完，短时间可存放于室温条件，如不能尽快用完，应放在4 0c 条件下。附(三)MS培养基配方MS培养基含有近3 0 种营养成分，为了避免每次配制培养基都要对这儿十种成分进行称量，可将培养基中的各种成分，按原量的20倍或2 0 0 倍分别称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫做培养基母液。这样每次使用时，取其总量的1/2 0(5 0 m L)或 1/2 0 0(5 m L),加水稀释，制成培养液。现将制备培养基母液所需的各类物质的量列出，供配制时使用。大量元素(母液I)mg/L(20X)N H 4 N Q 3 3 3 0 0 0 K N 0 3 3 8 0 0 0 Ca C1 2-2 H2 O 8 8 0 0 Mg S O4-7 H2 O 7 4 0 0 KH2 PO4 3 4 0 0微量元素(母液II)(1 0 0 X)KI 166 H3BO3 1 240 MnSO4-4H2O 4 460 ZnSO4-7H2O 1 720 Na2MoO4-2H2O 50 CuSO4-5H2O 5CoC12-6H2O 5铁盐（母液W）（100X）FeSO4-7H2O 5 560 Na2-EDTA-2H2O 7 460有机成分（母液IV）WA（100X）M M 20 000 IVBfflM 100 盐酸毗哆醇（维生素B6）100 盐酸硫胺素（维生素BI）100 甘 氨 酸 400以上各种营养成分的用量，除 了 母 液I为20倍浓缩液外，其 余 的 均 为100倍浓缩液。实验三 叶绿体的分离与荧光观察叶绿体是植物细胞所特有的能量转换细胞器，光合作用就是在叶绿体中进行的。由于具有这一重要功能，所以它一直是细胞生物学、遗传学和分子生物学的重要研究对象。叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，利用低速离心即可分离集中进行各种研究。一、实验目的一、通过植物细胞叶绿体的分离。了解细胞器分离的一般原理和方法。二.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光.并熟悉荧光显微镜的使用方法。二、实验原理将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法，一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速度不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均-悬浮中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部.分批收集即可获得各种亚细胞组分。叶绿体的分离应在等渗溶液（0.35mol/L氯化钠或0.4moJ/L蔗糖溶液）中进行，以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。将 匀 浆 液 在l000r/min的条件下离心2m in,以去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞。然后，在3000r/min的条件下离心5m ia,即可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。分离过程最好在05的条件下进行：如果在室温下，要迅速分离和观察。荧光显微术是利用荧光显微镜对可发荧光的物质进行观察的一种技术。某些物质在一定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光就称为荣光.若停止供能荧光现象立即停止。有些生物体内的物质受激发光照射后直接发出荧光，称为自发荧光（或直接荧光），如叶绿索的火红色荧光和水质素的黄色荧光等。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光称为次生荧光（或间接荧光），如叶绿体吸附口丫咤橙后可发桔红色荧光。利用荧光显微镜对可发荧光物质进行检测时，将受到许多因素的影响，如温度、光、淬灭剂等。因此在荧光观察时应抓紧时间，有必要时立即拍照。另外，在制作荧光显微标本时最好使用无荧光载玻片一,盖玻片和无荧光油。三、实验用品一、器材1、主要设备：普通离心机、组织捣碎机，粗天平、荧光显微镜。2、小型器材，500ml烧 杯2个，250ml量 筒1个，滴 管1 0支，10ml刻度离心管2 0支,纱布若干，无荧光载片和盖片各4片。二、材料新鲜菠菜。三、试剂O.35mol/L 氯化钠溶 0.01%口丫咤橙(acridine orange)0四、实验方法1、选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗及粗脉，称30g于150ml 0.35mol/LNaCI溶液中，装入组织捣碎机。2、利用组织捣碎机低速(5000r/min)匀 浆35min。3、将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。4、取滤液4m l在1000r/min下离心2min。弃去沉淀。5、将上沾液在3000r/min下离心5rm in.弃去上清液，沉淀即为叶绿体(混有部分细胞陵)。6、将沉淀用0.35mol/LNaCI溶液悬浮。7、取叶绿体悬液一滴，滴于载片上，加盖片后即可在普通光镜和荧光显微镜下观察。在普通光镜下观察。在荧光显微镜下观察。取口卜绿体悬液一滴滴在无荧光载片上，再漓加一滴0.01%口丫咤橙荧光染料加无荧光盖片后即可以荧光显微镜下观察。二、菠菜口I手切片观察用剖须刀将新鲜的嫩菠菜切削一斜面置于载片上，滴 加1-2滴0.35mol/LNaCI溶液，加盖片后轻压，置显微镜下观察。在普通光镜下观察。在荧光显微镜下观察。用同样方法制片，但 滴 加1-2滴0.01%口丫喘橙染液染色Im in,洗去余液，加盖玻后即可以在荧光显微镜下观察。五、实验结果一、口卜绿体的分离和观察1、普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。2、以Olympus荧光显微镜为例，在选用B(blue)激发滤片，B双色镜和O530(orange)阻断滤片的条件下，口卜绿体发出火红色荧光。3、加入口 丫 咤橙染色后，叶绿体可发出桔红色荧光，而其中混有的细胞核则发绿色荧色。二、菠菜口卜手切片观察1、在普通光镜下可以看到三种细胞(1)表面细胞：为边缘呈锯齿形的鳞片状细胞。(2)保卫细胞：为构成气孔的成对存在的肾形细胞。(3)叶肉细胞：为排成栅状的长方形和椭圆形细胞。叶绿体呈绿色橄榄形，在高倍镜下还可以看到绿色的基粒。2、在荧光显微镜下，叶绿体发出火红色荧光，但其荧光强度要比游离叶绿体弱。气孔发绿色荧光，两保卫细胞内的火红色叶绿体则环绕气孔排列成一-圈。表皮细胞内叶绿体数量要比叶肉细胞少。3、用口丫咤橙染色后，叶绿体则发出枯红色荧光，细胞核町发出绿色荧光，气孔仍为绿色。六、作业1、在普通光镜下，用目镜测微尺和台镜测微尺测量一下叶绿体的长轴和短轴，分 别 测 重510个叶绿体，求其平均值。2、在荧光显微镜下观察叶绿体的自发荧光时，更换滤片系统，叶绿体的颜色是否有变化？3、游离叶绿体和整体细胞内的叶绿体，在荧光显微镜下，具颜色和强度合无差异？七、思考题1、口卜绿体分离的实验原理是什么?在分离叶绿体时应注意些什么问题？2、普通光镜与荧光显微镜有何异同点？实验四液泡系 的 超 活 染 色 与 观 察一、实验目的1.观察动植物活细胞内线粒体、液泡系的形态、发育和分布；2.了解细胞和细胞器的超活染色技术二、实验原理线粒体是细胞进行呼吸作用的场所，具形态和数量随不同物种、不同组织器官和不同的生理状态面发生变化。詹纳斯绿B是毒性较小的碱性染性，可专一性地对线粒体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态（即有色状态），呈蓝绿色：而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原为无色的色基（即无色状态）。中性红为弱碱性染料，对液泡系（即高尔基体）的染色有专一性，只将活细胞中的液泡系染红色，细胞核与细胞质完全不着色，这可能是与液泡中某些蛋白质有关。三、实验用品1.器材：显微镜、恒温水浴锅、剪刀、镜子、解剖刀、载玻片、盖玻片、吸管、牙签、吸水纸2.试齐（J：Ringer液、1/5000詹纳斯绿B、1/3000中性红3.材料：人口腔上皮细胞、蚕豆幼根根尖四、实验步骤（一）线粒体的超活染色与观察1 .口腔上皮细胞线粒体的超活染色（1）取清洁载玻片放在37恒温水溶锅的金属板上，滴2滴1/5000詹纳斯绿B染液。（2）实验者用牙签宽头在自己口腔颊粘膜处梢用力刮取上皮细胞，将刮下的粘液状物放入载玻片的染液滴中，染 色10-15min（注意染液不可干燥，必要时可再加滴染液），盖上盖玻片，用吸水纸吸去四周溢出的染液，置显微镜下观察。（3）在低倍镜下，选择平展的口腔上皮细胞，换高倍镜进行观察。可见扁平状上皮细胞的核周围胞质中，分布着一些被染成蓝绿色的颗粒状或短棒状的结构，即是线粒体。（二）蚕豆幼根根尖液泡系的中性红染色观察（1）实验前，把蚕豆培养在培养皿内潮湿的滤纸上，使具发芽，胚根伸长到1cm以上.（2）用双面刀得把初生的蚕豆幼苗根尖（l-2cm）小心切一纵切面，放入载玻片上的1/3000中性红染液滴中，染色5 lOmin。（3）吸去染液，滴一滴Ringer液，盖上盖玻片，并用镶子轻轻地下压盖玻片，使根尖压扁，利于观察。（4）在高倍镜下，先观察根尖部分的生长点的细胞，可见细胞质中散在很多大小不等的染成玫瑰红色的圆形小泡，这是初生的幼小液泡。然后，由生长点向延长区观察，在一些已分化长大的细胞内，液泡的染色较浅，体积增大，数目变少。在成热区细胞中，一般只有一个淡红色的巨大液泡，占据细胞的绝大部分，将细胞核挤到细胞-侧贴近细胞壁处。五、作业1.绘出人口腔上皮细胞示线粒体的形态与分布并简要分析。2.绘出蚕豆幼根根尖组织液泡系的形态与分布并简要分析。活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无害毒的一种染色方法。它的目的是显示生活细胞内的某些结构。而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。活染技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理.病理状态。根据所用染色剂的性质和染色方法的不同，通过把活体染色分为体内活染与体外活染两类。体内活染是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的目的。体外活染乂称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是染料的“电化学”特性起重要作用。碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表现带有阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，它们彼此之间就发生了吸引作用。但不是任何染料皆可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料，而且总是要配成稀淡的溶液来使用。一般是以碱性染料最为适用，可能因为它具有溶解在类脂质（如卵磷脂、胆固醇等）的特性，易于被细胞吸收。詹纳斯绿B（Janus peen B）和中性红（neutral red）两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体和液泡系的染色各有专一性。液泡系是指由内膜所包围的小泡和液泡，除线粒体和质体外，都属于液泡系。液泡的类型可分为以下几种：高尔基液泡，溶酶体，圆 球 体（植物细胞所特有），微体，自噬小体，吞噬泡，胞饮液泡，糊 粉 粒（植物的种子中产生的一种特异的液泡），收缩泡，动、植物液泡都是由一层单位膜包围而成。实验五植物组织培养n-一芽的诱导实验目的：熟悉组织培养的原理，掌握芽诱导的方法实验原理：了解愈伤组织再分化原理，学习诱导愈伤组织分化的方法。愈伤组织在离体培养过程中，组织和细胞的潜在发育能力可以在某种程度上得到表达，伴随着反复的细胞分裂，又开始新的分化。将脱分化的细胞团或组织重新分化而产生出新的具有特定结构和功能的组织或器官的一种现象，称为再分化。在一定的培养条件下，愈伤组织通过分化可以形成苗或根的分生组织甚至是胚状体,继而发育成完整的植株。实验用品：超净工作台、镜子、酒精灯、棉球、三角瓶、培养皿、解剖刀MS培养基母液、多种激素、蔗糖、琼脂、酒精培养的愈伤组织（烟草）实验步骤：1.按实验二的步骤配制培养基并灭菌2.将培养瓶用酒精棉擦拭干净3.将培养的愈伤组织转移到分化培养基上诱导分化.将愈伤组织转接到分化培养基上，15d后，从疏松愈伤组织上分化出许多浅黄绿色芽点。40d后，从愈伤组织上分化出越来越多幼芽。附：芽增殖培养基（烟草）:MS+KT2.0+IAA0.5（mg/L）培养温度：25OC,蔗糖:3%琼脂 06-0.8%pH 值5 8实验六、细胞培养用具的清洗与消毒一、培养用具的清洗（-）玻璃器皿的清洗玻璃器皿在培养过程中用量大，重复使用频率高，要求严格清洗，特别是与细胞直接接触的各种培养器皿，即使含有微量的化学物质，都会对细胞生长不利。有害物质包括：解体的微生物、细胞残留物以及非营养成分的化学物质玻璃器皿的清洗一般包括浸泡、刷洗、泡酸和冲洗四个步骤。1.浸泡目的：软化器皿表面附着的物质，同时清除玻璃因为生产工艺而残留的碱性物质和其他有害物质。方法：-般是在清水（或加有洗涤剂）中浸泡数小时，再经简单的刷洗，然后在5%稀盐酸溶液中浸泡1 2 h以上。注意：污染的瓶子或者培养肿瘤细胞的瓶子，要 在2%来苏尔中浸泡过夜。2.刷洗目的：去除表面杂质方法：使用软毛刷，将浸泡后的器皿在洗涤剂中反复刷洗，用力要轻。忌用粗糙的工具抠刮器皿的表面，以免损伤表面并且造成划痕。刷洗不要留下死角。刷洗结束后，用自来水充分冲洗，晾干。3.泡 酸（浸酸）目的：利用洗液的强氧化性，去除器皿表面可能存在的有机物。新的或者重复使用的器皿一般都需要泡酸，一些无法用毛刷刷洗的物品（如吸管等）通常也主要靠泡酸来去除污物。方法：将干燥的器皿完全浸入洗液中，培养瓶、试剂瓶等容器要完全充满酸液。浸泡时间应该在6小时以上，最好过夜。注意安全，防止损伤皮肤、眼睛、衣物！洗液：由重铭酸钾、浓硫酸和水配制的清洁液，具有强氧化性和腐蚀性。使用过程中要注意防护，严防洗液对眼睛、皮肤和衣物的伤害和损坏。4.冲洗目的：泡酸后的器皿必须用大量自来水冲洗，以去除残留的洗液。方法：自来水流应该有一定的压力，每件器皿都要反复注满水、振荡、倾 空20次。最后用蒸储水浸洗3次。烘干后包装。（二）橡胶塞和塑料制品的清洗使用后的胶塞要先在水中浸泡，再用2%的NaOH溶液煮沸10分钟。自来水冲洗后，再 用1%稀盐酸浸泡30分钟。最后分别用自来水和双蒸水各冲洗3次，烘干后包装。塑料器皿在使用后应该及时在水中浸泡，避免附着的物质干涸而难于清理。自来水冲洗，一般不用刷洗。洗干净的器皿先在NaOH溶液中浸泡过夜，自来水冲洗后，再 用1%稀盐酸浸泡30分钟。最后分别用自来水和双蒸水个冲洗3次，烘干后包装。（三）金属器械的清洗擦去防锈油，然后用70%酒精棉球擦拭，烘干、包扎、灭菌滤器先用自来水冲净，蒸储水冲三次，70%酒精擦拭，烘干，加滤膜，包装，灭菌二、清洗后物品的包装目的：洗净烘干的物品应该及时包装，以备消毒灭菌。包装的物品便于消毒和贮存，同时可以防止消毒灭菌后再次受到污染。方法：包装常使用牛皮纸、硫酸纸、纱布、棉布、铝箔、铝盒、搪瓷杯、金属消毒筒等。三、培养用品的消毒和灭菌（）物理方法1.紫 外 线（ultraviolet）消毒原理：紫外线可以破坏微生物的蛋白质和核酸，从而杀灭多种微生物，其中革兰氏阴性菌最为敏感，其次是革兰氏阳性菌，再次是芽泡，真菌抱子抵抗力最强。用途：直接照射空气、地面、工作台表面。优点：用法简便，效果好。注意事项：紫外线的消毒效果和光源的辐射强度、照射时间成正比。灯管距离地面2米左右。用30w的紫外灯照射9平方米的房间，每次照射2 3小时。紫外线照射工作台面的距离应该小于1.5米，时间30分钟左右。紫外线照射效果的影响因素：温度和湿度空气要清洁不能穿透纸张、布等遮挡物场地和台面经过擦拭后照射效果更好紫外灯管的使用寿命2.高温干热灭菌原理：用电热烤箱内160c以上的高热，保 温90-120分钟，杀死细菌和芽抱，达到灭菌的目的。适用：不便于在蒸汽压力灭菌锅中进行灭菌且不会被高温损坏的玻璃器皿（如体积较大的培养瓶、烧杯等）、金属器械以及不能和蒸汽接触的物品（粉剂、油剂）。橡胶制品和塑料制品不能使用干热消毒法。注意事项：温度和时间要达到要求。灭菌结束，切忌不要急于开门，应等温度下降冷却后再打开,防止玻璃器皿因为温度骤变而破裂。物品之间应该留有空隙，便于热空气的流动。烧灼：也是干热灭菌的方法之一。在培养操作中，常常利用操作台上酒精灯或者煤气灯的火焰对金属器皿及玻璃瓶口进行补充消毒。3.压力蒸汽灭菌原理：通过高温高压和蒸汽良好的穿透力，使菌体蛋白质凝固变性而死亡。适用：最常用的灭菌方法，布类衣物、玻璃器皿、金属器械、胶塞、某些培养液体都可以使用该方法灭菌。注意事项：1.保证灭菌锅内有水；2.物品不要超过消毒筒体积的8 0%,物品之间要留有空隙，液体容器应该在瓶塞上插入一个5#或者7#针头，或者在玻璃塞和瓶口间夹一个纸条，以平衡内外的气压；3.水沸腾后，应该排气15分钟；4.将需要的压力维持一定的时间。5.排气要缓慢进行，尤其有液体存在时；4.过滤除菌原理：将液体或者气体用具有微孔的薄膜过滤，使大于孔径的细菌等微生物颗粒被阻留，从而达到除菌的目的。适用：用于遇热容易发生变性而失效的试剂或者培养用液，如人工培养基、小牛血清、胰蛋白酶等。分类：负压过滤和正压过滤。正压过滤具有流速高、过滤快、不易污染。避免形成气泡等优点。滤膜直径25mm的针头滤器，适合过滤100ml以下的少量液体。煮沸消毒法紧急情况下常用的方法，将金属器械、胶塞、注射器等在水中煮沸20-30分钟，趁热倒去水即可使用。5.电离辐射灭菌原理：以放射性核素（如60co）产生的Y射线或者电子加速器产生的加速粒子照射物品以达到杀灭细菌等微生物的方法。适用：金属、塑料橡胶、玻璃陶瓷、人工医学制品等。许多一次性器械和用品，如培养器皿、培养板、注射器、移液器吸头、离心管等，都可以用辐射灭菌优点：1.处理过程中不升温，对于不耐热的物品尤其适用；2.射线的穿透力强，紧密包装的物品经过灭菌后可以长期存放。需要专门的设备和专人指导、操作。（二）化学方法消毒利用化学消毒剂来对那些物理方法难以奏效的物品、场地、皮肤等进行消毒。常用的有乳酸、甲醛、环氧乙烷、乙醇、氯己定、戊二醛、碘伏等。此外市场上适用的化学消毒剂，如“84”等，均可以用于地面、台面的消毒。乳酸使用方法：关 闭 门 窗,将 乳 酸（0.03-0.04ml/m3）放入廿锅中加热熏蒸，时 间30分钟。甲 醛（methyl aldehyde）甲醛是广谱灭菌剂，水溶液和气体对于各种细菌、芽胞和真菌都有杀灭作用。使用方法：1.多聚甲醛加热法。将多聚甲醛研成粉末，均匀铺开在金属板上，加热到150c以上就会产生甲醛气体。用量10-20g/M2,时间 12-24h2.福尔马林加热法：将40%的甲醛溶液（福尔马林）在蒸发皿中加热蒸发。用量 25ml/M2,时间 12-24h3.氧化法：将高钛酸钾（或者漂白粉）放入一个平皿内，倒入甲醛溶液，即可释放出甲醛气体。甲醛溶液的用量：40ml/M2,高镒酸钾30g/M 2,时间12-24h甲醛熏蒸注意事项：甲醛气体的穿透力差，熏蒸前应该暴露物体表面，打开橱门，摊开或者挂起物品。温度18C,湿度70%。甲醛对人有害，应该等气体散净后再进入室内工作。乙 醇（ethanol）广泛应用的消毒剂，效果可靠，对其他灭菌剂如戊二醛、碘伏、氯己定等有增效或者协同作用。挥发性好，常用于需要快速发挥作用而不必长时间等待的消毒。手、手术野、台面、物体表面等等。先将手用肥皂和流水洗3 次，用 70-75%乙醇浸泡5 分钟。操作中手或者器械等触及怀疑有污染的物品后，用酒精棉球擦拭消毒。动物的体表用碘酒消毒后，用 70%的酒精消毒2-3次，每次20-30秒钟。70%酒精可以用来消毒台面、桌面、仪器和物品的表面。乙醇不能杀死芽抱；会使长期浸泡于酒精的橡胶和塑料制品变硬；取材的物品不宜用乙醇浸泡。三、实验部分器 材：5ml枪头12支、培养瓶4 只、10ml烧杯1只、25ml烧杯1只、25ml三角瓶1只、培养皿 1套、中号镜子1 只、小镶子刀 1把、纱布1块、2ml管4 个、包装：中镇/小镜/剪刀皿瓶杯塞养瓶养烧胶培锥培口封枪头 塞好棉花2ml、1.5mlEP 管标记：饭盒、瓶大小包、组号1只、胶塞4+1只、剪刀1 把、饭盒1 个、脱脂棉少许、裁纸1.5ml管 5 个1套大 1（塞纱布），小 14+1 个（1+1放饭盒;另3 交老师）1套/包1 个 封 口1 份 1 个;5mlX51份 3 个/包单独包，然后30支一大包1份 1个（标注名称）、姓 名（1组 2 人）实验七、细胞的原代培养高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某-群细胞在体内（in vivo）的功能活动是十分困难的。如果把活细胞拿到体外（in vitro）培养进行观察和研究，则要方便得多。高等动植物细胞要求的生存条件极其严格，稍有不适就要死亡。所以细胞培养技术（cell culture）就是选用最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术。细胞培养的优点1.便于应用物理、化学、生物等外界因素探索和揭示细胞生命活动的规律；2.便于应用各种不同技术方法研究和观察细胞结构和功能的变化；3.可以长期研究和观察细胞遗传行为的改变；4.可以提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象。原代培养的概念原 代 培 养（primary culture）：从动物机体取出的进行培养的细胞群。原代培养的细胞生长比较缓慢，而且繁殖一定的代数后（一般10代以内）停止生长，需要重新更换培养基。将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶即称为传代或传代培养（Passage）0培养方式组织培养细胞培养器官培养培养基培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。（-）天然培养基：类型：有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：1.来源受限。2.成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。3.易发生支原体污染（二）合 成 培 养 基概念：是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前使用的合成培养基有 TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM 等。主要成分：氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。优点：标准化生产，组分和含量相对固定，成 本 低。缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要；人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。血 清 的 成 分血清中的成分复杂，至今尚未完全清楚。主要有以下成分：多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）；多种金属离子；激素；促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等；各种生长因子；转移蛋白；不明成分。血清中不仅存在促细胞生长因子，同时也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。合成培养基中血清的加入量：一 般 说 来.含5%小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死.但支持细胞生长一般需加10%血清。血清质量好坏是实验成败的关键。常用血清类型：有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。血清的灭活（消除补体活性）：56 ,3 0分钟。血清的消毒：过滤除菌。无 血 清 培 养 基1975年，Sato首次成功地无血清培养基培养了垂体细胞株，近20多年来已报道用了儿十种细胞系在无血清培养基中成功地生长和增殖。应用领域：在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞。主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因子，如激素、生 长 因 子、结 合 蛋 白、贴壁和扩展 因 子 等。配制：无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。优点：无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性，减少了细胞污染,简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。无血清培养液中补加物具有独特性：适用于某种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细胞株的生长。即使同源组织的不同细胞株，所需补加物也不同。无血清培养基的目前使用情况：尚处于研究阶段，难以推广。目前，绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清抗菌素的使用抗生素的作用：在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。抗生素的使用量：通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫 升100单位。庆大霉素：每 毫 升100单位方便、广谱、稳定完全培养基的组成基础培养基血清碳酸氢钠青、链霉素80%95%5%20%2.0 g/L各100单位/毫升培 养 基 的 配 制RPMI-1640培养粉碳酸氢钠青、链霉素1袋2.0 g各100单位/毫升加三蒸水 至1000ml,过滤除菌。调节pH值至7.2,加血清至终浓度为10%。原代培养的过程取材培养材料的制备接种加培养液一培养1.取材1）准备工作：A.解剖取材器具、用品的清洗、包装、灭菌B.工作台面、工作环境的消毒C.操作者本人的消毒：肥皂水刷手，0.2%新洁尔灭浸泡前臂或者用酒精擦拭消毒，穿工作衣，戴帽、口罩D.对实验动物消毒2.取材和培养材料的制备A.切取合适大小的组织块或者器官，在平衡盐溶液或者培养液中洗涤，除去血污，剔除脂肪、被膜结缔组织以及坏死的组织。可滴加培养液或者平衡盐溶液来保持湿润；B.将组织块放置于盛有培养液的培养皿中，剪碎，（接种），组织碎块和培养液一起移到离心管中，吸去上清液；C.加入蛋白酶消化液，密封于3 7 c消 化；D.消化结束后，吸去含酶溶液，加入蛋白酶抑制剂或者含有血清的培养基，终止蛋白酶的活性;E.用吸管吹打消化液，使单个细胞游离；F.过滤离心收集单个细胞，以少量的培养液重新悬浮细胞；G.用计数板计算细胞密度，调节细胞密度，接种。3.接种与培养A.植块培养定义：将组织切割成一定大小的植块，接种到培养器皿中，加入培养液进行培养。目的：观察植块的组织学生长行为，使植块细胞迁移并在植块外分裂增殖，取出植块后得到细胞培养物。植块培养接种方法1.用湿润的吸管将植块小心吸取并轻轻吹出到培养瓶中，按照一定的形式或者间隔将植块排列好；2 力口入培养基，倒转培养一天.3.待植块贴壁后，再倒转培养加，使植块浸没在培养液中，继续培养；4.观察细胞生长情况，按照生长情况更换培养液。B分散细胞培养目的反映了单个细胞的生物学特性对单一细胞类型进行分离和纯化接种方法：1.用吸管吸取一定量的细胞悬液，加入培养器皿中，加入适量的培养液，封口2.恒温培养3.观察细胞生长状态，及时更换培养液。本次实验内容用 品 器 材1.超净工作台内：污物缸1个、酒精灯2 个、酒精棉球1瓶、大镣子1把、打火机1个、5 毫升移液器，1640培养基30毫升（方瓶，2 人共用）、Hank s 液 20毫 升（圆瓶，2 人共用）；2.饭盒1个，枪头4 支，操 作照 egg