质粒DNA的提取与酶切鉴定.ppt
实验四实验四 质粒质粒DNADNA的提取与酶切鉴定的提取与酶切鉴定 一一.实验目的和要求实验目的和要求1 1、了解质粒DNA的特性，掌握碱裂解法从大肠杆菌细胞中分离、提取质粒DNA的方法；2、掌握限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法；通过本实验了解限制性内切酶在分子生物学研究中的意义与作用。二.实验原理1、碱裂解法小量制备质粒DNA：碱裂解法是基于线性大分子染色体DNA与小分子环形质粒DNA的变性复性的差异达到分离目的的，在的碱性环境中，线型染色体DNA和环型质粒DNA氢键会发生断裂，双链解开而变性，但质粒DNA由于其闭合环型结构，氢键仅发生部分断裂，而且其互补链不完全分离；当将pH值调节到中性并在高盐浓度下，已分开的染色体DNA互补链不能复性而交联形成不溶的网状结构，通过离心，大部分染色体DNA、不稳定的大分子RNA和蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，而部分变性的闭合环状的质粒DNA在中性条件下很快复性，恢复到原来的构型，呈可溶性状态保存与溶液中，离心后上清中便含有所需要的质粒DNA。2 2、限制性内切酶：、限制性内切酶：又称为内切酶或限制酶，是一类能识别双链又称为内切酶或限制酶，是一类能识别双链DNADNA分子特异性核酸序列的分子特异性核酸序列的DNADNA水解酶，是体外剪切基因片段水解酶，是体外剪切基因片段的重要工具，主要存在于原核生物中。的重要工具，主要存在于原核生物中。根据限制酶的识别切割特根据限制酶的识别切割特性，性，催化条件及是否具有修饰酶活性可分为催化条件及是否具有修饰酶活性可分为、IIIIII型三大类型三大类，类和类和IIIIII类限制性内切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用类限制性内切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依赖及依赖ATPATP的限制性内切酶活性。的限制性内切酶活性。类限制性内切酶结合于特定类限制性内切酶结合于特定识别位点，但却随机地切割回转到被结合处的识别位点，但却随机地切割回转到被结合处的DNADNA。类限制性类限制性内切酶在识别位点上切割，然后从底物上解离下来。故内切酶在识别位点上切割，然后从底物上解离下来。故类和类和限制酶在基因工程中基本不用，限制酶在基因工程中基本不用，II II类酶在分子克隆中使用广泛。类酶在分子克隆中使用广泛。其基本特点如下：其基本特点如下：(1)(1)、专一性地识别并切割特定的核苷酸序列，如、专一性地识别并切割特定的核苷酸序列，如EcoR IEcoR I识识别与切割序列为别与切割序列为 5GAATTC3 5GAATTC3 3CTTAAG5 3CTTAAG5 (2)(2)、识别的核苷酸数目大多数为、识别的核苷酸数目大多数为4 46 6个，少数识别个，少数识别8 81313个；个；(3)(3)、识别序列大多数为二重对称（回文序列），大多数酶、识别序列大多数为二重对称（回文序列），大多数酶产生的是具有凸出的粘性末端：产生的是具有凸出的粘性末端：(4)、有不同来源的限制性内切酶可以识别相同的序列，甚至切割的位点也相同，称为同裂酶或异源同工酶，如Hpa II与Msp I；有的识别位点不同，但对DNA切割后可产生相同的粘性末端，称为同尾酶，如BamH I与Bgl II。三实验材料与设备：超净工作台、电热恒温水浴、分光光度计、恒温培养箱、恒温振荡器、移液器、微型离心管等、台式冷冻高速离心机、旋涡震荡器、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪，凝胶成像仪、冰箱、制冰机等；与0.5mL Eppendorf 管、Tip头、烧杯、量筒试剂：试剂：LBLB培养基培养基 氨苄青霉素贮存液：浓度氨苄青霉素贮存液：浓度50-100mg50-100mgmLmL；溶液溶液I:50mmol/LI:50mmol/L葡萄糖，葡萄糖，10mmol/L EDTA(pH8.0)10mmol/L EDTA(pH8.0)，25mmol/L 25mmol/L Tris-HCl(pH8.0)Tris-HCl(pH8.0)；溶液溶液NaOH,1%SDS(NaOH,1%SDS(现配现用现配现用)；溶液溶液III:III:乙酸钾溶液乙酸钾溶液(3M,pH=4.8)(60mL(3M,pH=4.8)(60mL的的5mol/L KAc,11.5ml 5mol/L KAc,11.5ml 冰醋酸，冰醋酸，28.5mL H28.5mL H2 2O)O)；RNase ARNase A：10mg/ml 10mg/ml；TETE缓冲液缓冲液:10mmol/L:10mmol/L，Tris-HCl,1mmol/LTris-HCl,1mmol/L，EDTAEDTA，；，；5TBE5TBE缓冲液：缓冲液：TrisTris硼酸，；硼酸，；10Loading buffer10Loading buffer：1%SDS,0.05%1%SDS,0.05%溴酚兰，溴酚兰，5050的甘油；的甘油；无水乙醇；无水乙醇；7070乙醇；乙醇；标准分子量片段；标准分子量片段；核酸内切酶核酸内切酶 E EcoR I(TaKaRa)coR I(TaKaRa)；E EcoR IcoR I酶解缓冲液酶解缓冲液(10 buffer H)(10 buffer H)；琼脂糖；琼脂糖；溴化乙啶（溴化乙啶（EBEB）染色液）染色液(10mg/ml)(10mg/ml)。四、碱裂解法小量制备质粒四、碱裂解法小量制备质粒DNADNA1 1、挑取转化筛选的带有目的质粒的大肠杆菌接种到液体培养基、挑取转化筛选的带有目的质粒的大肠杆菌接种到液体培养基中，中，3737震荡培养震荡培养12121616小时；小时；2 2、将菌液加入、将菌液加入EpEp离心管中，离心管中，12000 g12000 g离心离心30 Sec30 Sec，弃上清液，在，弃上清液，在吸水纸上扣干；吸水纸上扣干；离心时间不能太长，以免影响下一步的菌体悬浮离心时间不能太长，以免影响下一步的菌体悬浮3 3、加入、加入100100 L L预冷的溶液预冷的溶液I I，于涡旋振荡器上振荡悬浮细菌细胞，于涡旋振荡器上振荡悬浮细菌细胞，尽量使细胞分散；尽量使细胞分散；溶液溶液I I中的葡萄糖的作用是增大让一让的粘度，减少提取过程中的葡萄糖的作用是增大让一让的粘度，减少提取过程中的机械剪切力，防止染色体中的机械剪切力，防止染色体DNA DNA 的断裂；的断裂；EDTAEDTA的作用是与的作用是与二价离子（二价离子（CaCa2 2）结合，降低）结合，降低DNaseDNase对对DNADNA的降解的降解 4 4、加入、加入200200 L L新配制的溶液新配制的溶液II,II,盖紧管口盖紧管口,快速颠倒离心管快速颠倒离心管,以混以混匀内容物匀内容物,冰上放置冰上放置3 35min;5min;溶液溶液II II中的中的NaOHNaOH与与SDSSDS可裂解细胞，使可裂解细胞，使DNADNA变性以及变性以及SDSSDS使蛋白变使蛋白变性并形成交联的网状结构性并形成交联的网状结构 5 5、加入、加入150150 l l溶液溶液III,III,加盖后颠倒加盖后颠倒6-76-7次混匀，冰上放置次混匀，冰上放置2 23min3min；溶液溶液IIIIII为低为低pHpH的醋酸钾缓冲液，中和的醋酸钾缓冲液，中和NaOHNaOH，以便使部分变性的闭环，以便使部分变性的闭环质粒复性，而细菌染色体质粒复性，而细菌染色体DNADNA不能正确复性不能正确复性 6、12000 g离心6 min，将上清移入另一干净的Ep管中；7、加2倍上清体积(约1mL)的无水乙醇,振荡混匀，室温放置2min.8、12000g离心10min，弃上清液，再用70的乙醇洗涤一次，12000g离心1min，离心管倒置于吸水纸上扣干，然后在中空浓缩系统上干燥质粒；9、加入40L含50 g/mL RNase A的灭菌蒸馏水或TE 缓冲液溶解提取物，室温放置直到质粒完全溶解(约8min)，存于20或直接用于酶切。质粒图谱质粒图谱:五、五、提取质粒的酶切鉴定与琼脂糖凝胶电泳提取质粒的酶切鉴定与琼脂糖凝胶电泳 1 1、在、在1.5mL Ep1.5mL Ep管中依次加入下列溶液于离心管中管中依次加入下列溶液于离心管中 提取质粒提取质粒DNA 4.0 DNA 4.0 L L 10 buffer H 1.0 10 buffer H 1.0 l l EcoR I 1.0 EcoR I 1.0 l l（2.0 2.0 U U）dd H2O 4.0 dd H2O 4.0 L L 10 10 L L 1U:1 1U:1单位酶通常定义为，在建议缓冲液及温度下，单位酶通常定义为，在建议缓冲液及温度下，在在20 20 L L 反应液中反应反应液中反应1h1h，使，使1 1 g DNAg DNA完全消化所需的酶量完全消化所需的酶量.2 2、轻轻混匀、轻轻混匀,4000g,4000g离心离心1010秒秒 ，置于，置于3737水浴中酶解水浴中酶解2-3h2-3h。3 3、酶解完成后，电泳检测酶切结果。、酶解完成后，电泳检测酶切结果。六、实验结果报告 1、质粒浓度的计算（紫外分光光度计法）紫外分光光度法测定核酸含量双链DNA含量=OD260nm样品稀释倍数50ugml=ug/m1样品 2、质粒提取与酶切鉴定电泳结果，贴上打印实验照片并标明照片上各DNA条带的含义。七、思考题 1 1、根据、根据DNADNA限制酶的识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶限制酶的识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性可分为几种类型？其中活性可分为几种类型？其中IIII类限制性内切酶有何特性？类限制性内切酶有何特性？2 2、在用碱裂解法小量制备质粒过程中、在用碱裂解法小量制备质粒过程中I I液、液、IIII液与液与IIIIII液的作用液的作用是什么？是什么？
