重组体克隆筛选和鉴定.pptx

pBR322第1页/共45页（1）四环素：（2）氨苄青霉素抗性基因：2.pBR322抗菌素标记选择产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色。抑制细菌生长，但不杀死细菌。杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。（3）环丝氨酸：第2页/共45页3.选择过程：如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素抗性基因失活，可用四环素加环丝氨酸平板培养基选择重组克隆。Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。（1）四环素抗性插入失活第3页/共45页无环丝氨酸培养基第4页/共45页（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。第5页/共45页二、-半乳糖苷酶显色反应选择法-半乳糖苷酶乳糖半乳糖葡萄糖Xgal半乳糖5-溴-4-氯靛蓝+深蓝色1.原理：载体上有一段-半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（Lac ZLac Z）的）的 片段片段（氨基端），其上有外源（氨基端），其上有外源DNADNA的插入位点。的插入位点。受体菌基因组受体菌基因组中有突变的中有突变的-半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（片片段缺失）。可以被段缺失）。可以被IPTGIPTG诱导表达。诱导表达。载体和受体菌基因组可以载体和受体菌基因组可以互补互补形成完整有功能的形成完整有功能的-半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。第6页/共45页假阴性：如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有中止密码；（不破坏 肽）。2.选择过程第7页/共45页-半乳糖苷酶使半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。第8页/共45页利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。（只在特定条件下）。转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。一、原理：第二节 根据插入基因的表型选择1.弥补缺陷his-his+受体菌：外源基因：在不含组氨酸的培养基中生长第9页/共45页小鼠的二轻叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二氨嘧啶有抗性。DHFR载体连接转化受体菌三甲氧苄二氨嘧啶培养基平板含DHFR的克隆才能生长例：使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。2.增加新性状第10页/共45页利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。一、直接电泳检测法从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。第三节 DNA电泳检测法 分子量Marker载体重组克隆第11页/共45页二、酶切电泳筛选法1.原理：根据已知的外源DNA序列的限制性酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计的结果。第12页/共45页ABA或B第13页/共45页第14页/共45页筛选过程第15页/共45页三、PCR扩增检测法1.原理PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断。2.过程（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。（2）用外源DNA插入片断引物作PCR。（3）电泳PCR产物。（4）检查是否有PCR产物。（5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。第16页/共45页2500bp2000bp1500bp1000bp500bp300bp1 2 3 4 5 6 7 8从含有100ug/mL氨苄青霉素抗性的LB固体培养基平板上，挑取白色菌落做菌落PCR。第17页/共45页第四节 核酸杂交检测法 一、原理：具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下（适宜的温度及离子强度等），可按碱基互补配对原则退火形成双链，此杂交过程是高度特异性的。杂交的双方是待测的核酸序列和用于检测的已知核酸片段（核酸探针）。将待测核酸变性后，用一定的方法将其固定在硝酸纤维膜上，用经标记示踪的特异核酸探针与之杂交，该探针只能与互补的特异核酸牢固结合，而其他的非特异结合将被洗去。最后，示踪标记将指示待测核酸中能与探针互补的特异 DNA 片段所在的位置。第18页/共45页二、核酸杂交检测方法根据待测核酸的来源以及将其分子结合到固相支持物上方法的不同，可将该方法分为菌落印迹原位杂交、斑点印迹杂交、Southern 印迹杂交和 Northern 印迹杂交四类，这四类方法的主要技术路线如图所示 第19页/共45页第20页/共45页原位杂交筛选特点：对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。第21页/共45页R-环检测法DNA-RNA杂交。1）原理：2）选择过程在70%甲酰胺中，把DNA双链变性，复性的时候，DNA-RNA杂交分子比DNA-DNA双链更稳定。电镜下可见一种R-环形结构。用外源基因的mRNA与重组载体杂交。第22页/共45页缺点：需要电镜！第23页/共45页利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性质可分为几种作用方式：一、放射性抗体检测法一、放射性抗体检测法第五节 免疫化学检测法 1.抗体与产物的结合方式对表达产物的检测。蛋白蛋白“杂交”第24页/共45页待测基因产物蛋白一抗二抗125I 标记的二抗结合蛋白固相支持滤膜待测基因产物蛋白一抗125I标记的二抗固相支持滤膜待测基因产物蛋白一抗固相支持滤膜固相支持滤膜待测基因产物蛋白一抗二抗125I 标记的二抗结合蛋白125I标记的二抗第25页/共45页2.放射性抗体检测法过程第26页/共45页二、免疫沉淀检测法把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体反应形成“沉淀圈”。1.原理抗原抗体凝集反应。检测分泌型产物。2.方法第27页/共45页对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。第28页/共45页三、酶联免疫吸附测定（ELISA）Enzyme-linked immunosorbant assay1.原理：一抗（primary antibody）:与目标分子的特异结合。二抗（secondary antibody）：与一抗的特异性结合。酶连（enzyme-linke）：二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。第29页/共45页待测基因产物蛋白一抗二抗酶待测基因产物蛋白一抗二抗无色的底物有色的产物比色观察酶19第30页/共45页2.ELISA检测的一般步骤（1）固定样品将待测样品加入96孔微量滴定板（microtiter plate）的孔中，干燥后就被固定在孔底。孔底第31页/共45页加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。（2）一抗结合一抗第32页/共45页加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉。二抗只识别一抗。二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物酶、脲酶等）。（3）二抗结合二抗第33页/共45页加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物质（或发光）。（4）显色反应第34页/共45页第35页/共45页在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打印出结果。（5）比色第36页/共45页3.ELISA的局限性有效，但准确性稍差（主要取决于一抗的特异性）。必须与其他方法一起综合考虑。最好用单克隆抗体（monoclonal antibody）第37页/共45页临床检验常用的单抗第38页/共45页四、免疫印迹（western blotting）法 在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测胶上的蛋白质泳带。第39页/共45页1.原理：与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。第40页/共45页 Blotting原理与ELISA相同。待测蛋白硝酸纤维素膜一抗二抗辣根过氧化物酶底物产物，并发出光PAGE胶待测蛋白底片曝光辣根过氧化物酶：HRPO第41页/共45页第42页/共45页1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与 膜上的蛋白结合。2）洗去未结合的一抗。3）用二抗与一抗结合（二抗上带有HRPO）。4）清洗掉未结合的二抗。5）用HRPO的底物浸泡膜。6）暗室里曝光，冲洗胶片。Blotting过程第43页/共45页第六节 DNA的序列分析已讲，不多做解释第44页/共45页感谢您的观看！第45页/共45页