实验五血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳分离精品文稿.ppt

实验五血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳分离1第1页，本讲稿共19页 电泳技术电泳技术电泳技术电泳技术-电泳的基本概念和原理电泳的基本概念和原理电泳的基本概念和原理电泳的基本概念和原理 一、概念：电泳是指带电质点在电场中向本身所带电荷一、概念：电泳是指带电质点在电场中向本身所带电荷一、概念：电泳是指带电质点在电场中向本身所带电荷一、概念：电泳是指带电质点在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。相反的电极移动的现象。相反的电极移动的现象。相反的电极移动的现象。二、原理：在一定二、原理：在一定二、原理：在一定二、原理：在一定PHPHPHPH条件下，不同的物质具有不同的条件下，不同的物质具有不同的条件下，不同的物质具有不同的条件下，不同的物质具有不同的等电点就带不同性质的电荷，因而在一定的电场中它们的等电点就带不同性质的电荷，因而在一定的电场中它们的等电点就带不同性质的电荷，因而在一定的电场中它们的等电点就带不同性质的电荷，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，因此，可使它们分离。移动方向和移动速度也不同，因此，可使它们分离。移动方向和移动速度也不同，因此，可使它们分离。移动方向和移动速度也不同，因此，可使它们分离。质点在电场中的移动方向决定于颗粒所带电荷的种类：质点在电场中的移动方向决定于颗粒所带电荷的种类：质点在电场中的移动方向决定于颗粒所带电荷的种类：质点在电场中的移动方向决定于颗粒所带电荷的种类：带正电荷的颗粒向电场的负极移动；带负电荷的颗粒向正极带正电荷的颗粒向电场的负极移动；带负电荷的颗粒向正极带正电荷的颗粒向电场的负极移动；带负电荷的颗粒向正极带正电荷的颗粒向电场的负极移动；带负电荷的颗粒向正极移动；净电荷为零的颗粒在电场中不移动。移动；净电荷为零的颗粒在电场中不移动。移动；净电荷为零的颗粒在电场中不移动。移动；净电荷为零的颗粒在电场中不移动。颗粒在电场中移动的速度主要决定于颗粒带电荷颗粒在电场中移动的速度主要决定于颗粒带电荷颗粒在电场中移动的速度主要决定于颗粒带电荷颗粒在电场中移动的速度主要决定于颗粒带电荷的量，同时受颗粒形状和颗粒相对分子质量的大小的的量，同时受颗粒形状和颗粒相对分子质量的大小的的量，同时受颗粒形状和颗粒相对分子质量的大小的的量，同时受颗粒形状和颗粒相对分子质量的大小的影响。影响。影响。影响。2第2页，本讲稿共19页 在电场中，颗粒的移动速度，通常用泳动度（或迁移率）来表示。在电场中，颗粒的移动速度，通常用泳动度（或迁移率）来表示。在电场中，颗粒的移动速度，通常用泳动度（或迁移率）来表示。在电场中，颗粒的移动速度，通常用泳动度（或迁移率）来表示。泳动度是带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度即：泳动度是带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度即：泳动度是带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度即：泳动度是带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度即：v d/t d Lv d/t d Lv d/t d Lv d/t d L -=-=-=-=-=-=-=-=-E V/L V t E V/L V t E V/L V t E V/L V t 式中：式中：式中：式中：泳动度（即迁移率），泳动度（即迁移率），泳动度（即迁移率），泳动度（即迁移率），cmcmcmcm2 2 2 2/（V V V V s s s s）；）；）；）；v v v v泳动速度，泳动速度，泳动速度，泳动速度，cm/scm/scm/scm/s；E E E E电场强度，电场强度，电场强度，电场强度，V/cmV/cmV/cmV/cm；d d d d颗粒泳动距离，颗粒泳动距离，颗粒泳动距离，颗粒泳动距离，cmcmcmcm；V V V V实际电压，实际电压，实际电压，实际电压，V V V V（伏特）；伏特）；伏特）；伏特）；t t t t通电时间，通电时间，通电时间，通电时间，s s s s（秒）；秒）；秒）；秒）；L L L L介质的有效长度（介质的有效长度（介质的有效长度（介质的有效长度（cmcmcmcm）。）。）。）。通过测量通过测量通过测量通过测量d d d d、L L L L、V V V V、t t t t即可计算出颗粒的泳动度。即可计算出颗粒的泳动度。即可计算出颗粒的泳动度。即可计算出颗粒的泳动度。在一定条件下，任何带电颗粒都具有自己特定的泳动度，它是胶体在一定条件下，任何带电颗粒都具有自己特定的泳动度，它是胶体在一定条件下，任何带电颗粒都具有自己特定的泳动度，它是胶体在一定条件下，任何带电颗粒都具有自己特定的泳动度，它是胶体颗粒的一个物质常数，可用其鉴定蛋白质等物质。颗粒的一个物质常数，可用其鉴定蛋白质等物质。颗粒的一个物质常数，可用其鉴定蛋白质等物质。颗粒的一个物质常数，可用其鉴定蛋白质等物质。3第3页，本讲稿共19页 三、影响电泳泳动度的因素：三、影响电泳泳动度的因素：三、影响电泳泳动度的因素：三、影响电泳泳动度的因素：1 1 1 1、颗粒性质：颗粒的直径、形状及所带静电荷量对泳动速度有较、颗粒性质：颗粒的直径、形状及所带静电荷量对泳动速度有较、颗粒性质：颗粒的直径、形状及所带静电荷量对泳动速度有较、颗粒性质：颗粒的直径、形状及所带静电荷量对泳动速度有较大影响。一般来说颗粒带净电荷量越多，或其形状越接近球形，在电大影响。一般来说颗粒带净电荷量越多，或其形状越接近球形，在电大影响。一般来说颗粒带净电荷量越多，或其形状越接近球形，在电大影响。一般来说颗粒带净电荷量越多，或其形状越接近球形，在电场中的泳动速度就越快。反之则越慢。场中的泳动速度就越快。反之则越慢。场中的泳动速度就越快。反之则越慢。场中的泳动速度就越快。反之则越慢。2 2 2 2、电场强度：电场强度是指每一厘米的电位降。又称为电位梯度、电场强度：电场强度是指每一厘米的电位降。又称为电位梯度、电场强度：电场强度是指每一厘米的电位降。又称为电位梯度、电场强度：电场强度是指每一厘米的电位降。又称为电位梯度或电势梯度。它对泳动速度起着十分重要的作用。电场强度越高，带或电势梯度。它对泳动速度起着十分重要的作用。电场强度越高，带或电势梯度。它对泳动速度起着十分重要的作用。电场强度越高，带或电势梯度。它对泳动速度起着十分重要的作用。电场强度越高，带电颗粒的泳动速度越快。反之，则越慢。根据电场强度（电压的高低）电颗粒的泳动速度越快。反之，则越慢。根据电场强度（电压的高低）电颗粒的泳动速度越快。反之，则越慢。根据电场强度（电压的高低）电颗粒的泳动速度越快。反之，则越慢。根据电场强度（电压的高低）大小，又可将电泳分为常压电泳（大小，又可将电泳分为常压电泳（大小，又可将电泳分为常压电泳（大小，又可将电泳分为常压电泳（100100100100500500500500V V V V）和高压电泳（和高压电泳（和高压电泳（和高压电泳（50050050050010000100001000010000V V V V）。）。）。）。前者电场强度为前者电场强度为前者电场强度为前者电场强度为2 2 2 210101010伏特伏特伏特伏特/厘米，后者为厘米，后者为厘米，后者为厘米，后者为70707070200200200200伏特伏特伏特伏特/厘米。常压电泳多用于分离大分子物质。高压电泳常需要冷却厘米。常压电泳多用于分离大分子物质。高压电泳常需要冷却厘米。常压电泳多用于分离大分子物质。高压电泳常需要冷却厘米。常压电泳多用于分离大分子物质。高压电泳常需要冷却装置。高压电泳时间短，有时仅需数分钟，多用于分离小分子物装置。高压电泳时间短，有时仅需数分钟，多用于分离小分子物装置。高压电泳时间短，有时仅需数分钟，多用于分离小分子物装置。高压电泳时间短，有时仅需数分钟，多用于分离小分子物质。质。质。质。4第4页，本讲稿共19页 3 3 3 3、溶液的性质：主要是指电极溶液（缓冲溶液）和蛋白质样品溶液、溶液的性质：主要是指电极溶液（缓冲溶液）和蛋白质样品溶液、溶液的性质：主要是指电极溶液（缓冲溶液）和蛋白质样品溶液、溶液的性质：主要是指电极溶液（缓冲溶液）和蛋白质样品溶液的的的的pHpHpHpH值、离子强度和粘度等。值、离子强度和粘度等。值、离子强度和粘度等。值、离子强度和粘度等。（1 1 1 1）pHpHpHpH值：溶液值：溶液值：溶液值：溶液pHpHpHpH值决定带电颗粒的解离程度，也即决定其带净电荷值决定带电颗粒的解离程度，也即决定其带净电荷值决定带电颗粒的解离程度，也即决定其带净电荷值决定带电颗粒的解离程度，也即决定其带净电荷的量。对蛋白质而言，溶液的的量。对蛋白质而言，溶液的的量。对蛋白质而言，溶液的的量。对蛋白质而言，溶液的pHpHpHpH值离其等电点越远，则其带净电荷量就值离其等电点越远，则其带净电荷量就值离其等电点越远，则其带净电荷量就值离其等电点越远，则其带净电荷量就越多，从而泳动速度就越快。反之，则越慢。当越多，从而泳动速度就越快。反之，则越慢。当越多，从而泳动速度就越快。反之，则越慢。当越多，从而泳动速度就越快。反之，则越慢。当pHpHpHpH值等于其值等于其值等于其值等于其PIPIPIPI时，净电时，净电时，净电时，净电荷为荷为荷为荷为0 0 0 0，也为也为也为也为0 0 0 0。因此电泳时应选择适宜的。因此电泳时应选择适宜的。因此电泳时应选择适宜的。因此电泳时应选择适宜的PHPHPHPH值，并需采用缓冲溶液，值，并需采用缓冲溶液，值，并需采用缓冲溶液，值，并需采用缓冲溶液，使溶液的使溶液的使溶液的使溶液的pHpHpHpH值恒定。值恒定。值恒定。值恒定。（2 2 2 2）离子强度：溶液的离子强度一般在）离子强度：溶液的离子强度一般在）离子强度：溶液的离子强度一般在）离子强度：溶液的离子强度一般在0.020.020.020.020.20.20.20.2之间时，电泳较之间时，电泳较之间时，电泳较之间时，电泳较合适。若离子强度过高，则会降低颗粒的泳动速度。其原因是，带电合适。若离子强度过高，则会降低颗粒的泳动速度。其原因是，带电合适。若离子强度过高，则会降低颗粒的泳动速度。其原因是，带电合适。若离子强度过高，则会降低颗粒的泳动速度。其原因是，带电颗粒能把溶液中与其电荷相反的离子吸引在自己周围形成离子扩散层。颗粒能把溶液中与其电荷相反的离子吸引在自己周围形成离子扩散层。颗粒能把溶液中与其电荷相反的离子吸引在自己周围形成离子扩散层。颗粒能把溶液中与其电荷相反的离子吸引在自己周围形成离子扩散层。若离子强度过低，则缓冲能力差，往往会因溶液若离子强度过低，则缓冲能力差，往往会因溶液若离子强度过低，则缓冲能力差，往往会因溶液若离子强度过低，则缓冲能力差，往往会因溶液PHPHPHPH值变化而影响泳值变化而影响泳值变化而影响泳值变化而影响泳动的速率。动的速率。动的速率。动的速率。5第5页，本讲稿共19页 离子强度的计算公式为：离子强度的计算公式为：离子强度的计算公式为：离子强度的计算公式为：I I I I1/2m1/2m1/2m1/2mi i i iz z z zi i i i2 2 2 2=1/2(m=1/2(m=1/2(m=1/2(m1 1 1 1z z z z1 1 1 12 2 2 2+m+m+m+m2 2 2 2z z z z2 2 2 22 2 2 2+m m m mn n n nz z z zn n n n2 2 2 2)I I I I溶液的离子强度；溶液的离子强度；溶液的离子强度；溶液的离子强度；m m m mi i i i离子的摩尔浓度；离子的摩尔浓度；离子的摩尔浓度；离子的摩尔浓度；z z z zi i i i离子的价数离子的价数离子的价数离子的价数 1 1 1 1，2 2 2 2，n n n n代表各种离子。代表各种离子。代表各种离子。代表各种离子。（3 3 3 3）溶液粘度：溶液粘度：溶液粘度：溶液粘度：泳动度与溶液粘度是成反比关系。因此，粘度过大或过泳动度与溶液粘度是成反比关系。因此，粘度过大或过泳动度与溶液粘度是成反比关系。因此，粘度过大或过泳动度与溶液粘度是成反比关系。因此，粘度过大或过小，必然影响泳动度。小，必然影响泳动度。小，必然影响泳动度。小，必然影响泳动度。4 4 4 4、电渗：当支持物不是绝对惰性物质时，常常会有一些离子基团如羧、电渗：当支持物不是绝对惰性物质时，常常会有一些离子基团如羧、电渗：当支持物不是绝对惰性物质时，常常会有一些离子基团如羧、电渗：当支持物不是绝对惰性物质时，常常会有一些离子基团如羧基、磺酸基、羟基等吸附溶液中的正离子，使靠近支持物的溶液相对带基、磺酸基、羟基等吸附溶液中的正离子，使靠近支持物的溶液相对带基、磺酸基、羟基等吸附溶液中的正离子，使靠近支持物的溶液相对带基、磺酸基、羟基等吸附溶液中的正离子，使靠近支持物的溶液相对带电。在电场作用下，此溶液层会向负极移动。反之，若支持物的离子基电。在电场作用下，此溶液层会向负极移动。反之，若支持物的离子基电。在电场作用下，此溶液层会向负极移动。反之，若支持物的离子基电。在电场作用下，此溶液层会向负极移动。反之，若支持物的离子基团吸附溶液中的负离子，则溶液层会向正极移动。这种溶液层的泳动现团吸附溶液中的负离子，则溶液层会向正极移动。这种溶液层的泳动现团吸附溶液中的负离子，则溶液层会向正极移动。这种溶液层的泳动现团吸附溶液中的负离子，则溶液层会向正极移动。这种溶液层的泳动现象称为电渗。象称为电渗。象称为电渗。象称为电渗。6第6页，本讲稿共19页 因此，当颗粒的泳动方向与电渗方向一致时，则加快颗粒因此，当颗粒的泳动方向与电渗方向一致时，则加快颗粒因此，当颗粒的泳动方向与电渗方向一致时，则加快颗粒因此，当颗粒的泳动方向与电渗方向一致时，则加快颗粒的泳动速度；当颗粒的泳动方向与电渗方向相反时，则降低颗的泳动速度；当颗粒的泳动方向与电渗方向相反时，则降低颗的泳动速度；当颗粒的泳动方向与电渗方向相反时，则降低颗的泳动速度；当颗粒的泳动方向与电渗方向相反时，则降低颗粒的泳动速度。粒的泳动速度。粒的泳动速度。粒的泳动速度。ABAB/+A A A A支持物支持物支持物支持物 B B B B支持物支持物支持物支持物7第7页，本讲稿共19页 5 5 5 5、焦耳热：在电泳过程中，电流强度与释放出热量（、焦耳热：在电泳过程中，电流强度与释放出热量（、焦耳热：在电泳过程中，电流强度与释放出热量（、焦耳热：在电泳过程中，电流强度与释放出热量（Q Q Q Q）之间的之间的之间的之间的关系可列成如下公式：关系可列成如下公式：关系可列成如下公式：关系可列成如下公式：Q Q Q QI I I I2 2 2 2RtRtRtRt 式中式中式中式中R R R R为电阻；为电阻；为电阻；为电阻；t t t t为电泳时间；为电泳时间；为电泳时间；为电泳时间；I I I I为电流强度。公式表明，电泳为电流强度。公式表明，电泳为电流强度。公式表明，电泳为电流强度。公式表明，电泳过程中释放出的热量与电流强度的平方成正比。当电场强度或过程中释放出的热量与电流强度的平方成正比。当电场强度或过程中释放出的热量与电流强度的平方成正比。当电场强度或过程中释放出的热量与电流强度的平方成正比。当电场强度或电极缓冲液中离子强度增高时，电流强度会随着增大。这不仅电极缓冲液中离子强度增高时，电流强度会随着增大。这不仅电极缓冲液中离子强度增高时，电流强度会随着增大。这不仅电极缓冲液中离子强度增高时，电流强度会随着增大。这不仅降低分辨率，而且在严重时会烧断滤纸或熔化琼脂糖凝胶支持降低分辨率，而且在严重时会烧断滤纸或熔化琼脂糖凝胶支持降低分辨率，而且在严重时会烧断滤纸或熔化琼脂糖凝胶支持降低分辨率，而且在严重时会烧断滤纸或熔化琼脂糖凝胶支持物。物。物。物。6 6 6 6、分子筛（筛孔）：支持物琼脂和聚丙烯酰胺凝胶都有大小不等的筛、分子筛（筛孔）：支持物琼脂和聚丙烯酰胺凝胶都有大小不等的筛、分子筛（筛孔）：支持物琼脂和聚丙烯酰胺凝胶都有大小不等的筛、分子筛（筛孔）：支持物琼脂和聚丙烯酰胺凝胶都有大小不等的筛孔孔孔孔-分子筛，在筛孔大的凝胶中溶质颗粒泳动速度快。反之，则泳分子筛，在筛孔大的凝胶中溶质颗粒泳动速度快。反之，则泳分子筛，在筛孔大的凝胶中溶质颗粒泳动速度快。反之，则泳分子筛，在筛孔大的凝胶中溶质颗粒泳动速度快。反之，则泳动速度慢。动速度慢。动速度慢。动速度慢。除上述影响泳动速度的因子外，温度和仪器装置等因子的影响除上述影响泳动速度的因子外，温度和仪器装置等因子的影响除上述影响泳动速度的因子外，温度和仪器装置等因子的影响除上述影响泳动速度的因子外，温度和仪器装置等因子的影响也应考虑。也应考虑。也应考虑。也应考虑。8第8页，本讲稿共19页四、电泳的分类四、电泳的分类四、电泳的分类四、电泳的分类 目前，电泳（目前，电泳（目前，电泳（目前，电泳（electrophoresiselectrophoresiselectrophoresiselectrophoresis）方法大致可分为三类显微电泳、方法大致可分为三类显微电泳、方法大致可分为三类显微电泳、方法大致可分为三类显微电泳、自由界面电泳（没有支持物）及区带电泳。以区带电泳应用比较广泛。自由界面电泳（没有支持物）及区带电泳。以区带电泳应用比较广泛。自由界面电泳（没有支持物）及区带电泳。以区带电泳应用比较广泛。自由界面电泳（没有支持物）及区带电泳。以区带电泳应用比较广泛。显微电泳是用显微镜直接观察细胞等大颗粒物质电泳行为的过程。目前显微电泳是用显微镜直接观察细胞等大颗粒物质电泳行为的过程。目前显微电泳是用显微镜直接观察细胞等大颗粒物质电泳行为的过程。目前显微电泳是用显微镜直接观察细胞等大颗粒物质电泳行为的过程。目前已用于研究膜结构及癌细胞和正常细胞的差异性等方面。已用于研究膜结构及癌细胞和正常细胞的差异性等方面。已用于研究膜结构及癌细胞和正常细胞的差异性等方面。已用于研究膜结构及癌细胞和正常细胞的差异性等方面。自自自自由由由由界界界界面面面面电电电电泳泳泳泳是是是是被被被被分分分分离离离离的的的的溶溶溶溶质质质质颗颗颗颗粒粒粒粒经经经经电电电电泳泳泳泳后后后后与与与与缓缓缓缓冲冲冲冲溶溶溶溶液液液液之之之之间间间间形形形形成成成成界界界界面面面面的的的的电电电电泳泳泳泳过过过过程程程程。利利利利用用用用适适适适当当当当的的的的光光光光学学学学系系系系统统统统可可可可观观观观察察察察到到到到界界界界面面面面的的的的移移移移动动动动。在在在在电电电电泳泳泳泳过过过过程程程程中中中中，每每每每个个个个移移移移动动动动界界界界面面面面（峰峰峰峰）相相相相当当当当于于于于某某某某一一一一特特特特定定定定的的的的蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质。如如如如：用用用用于于于于血血血血浆蛋白成分的电泳。浆蛋白成分的电泳。浆蛋白成分的电泳。浆蛋白成分的电泳。9第9页，本讲稿共19页10第10页，本讲稿共19页 区区区区带带带带电电电电泳泳泳泳（zone zone zone zone electrophoresiselectrophoresiselectrophoresiselectrophoresis）是是是是由由由由于于于于在在在在支支支支持持持持物物物物上上上上电电电电泳泳泳泳时时时时各各各各组组组组分分分分因因因因迁迁迁迁移移移移速速速速度度度度不不不不同同同同分分分分布布布布成成成成区区区区带带带带而而而而得得得得名名名名。区区区区带带带带电电电电泳泳泳泳按按按按其其其其支支支支持持持持物物物物性性性性状状状状（物理性状）不同可以分为四类：（物理性状）不同可以分为四类：（物理性状）不同可以分为四类：（物理性状）不同可以分为四类：1 1 1 1、滤纸和薄膜电泳：如醋酸薄膜电泳、聚酰胺薄膜电泳、滤纸和薄膜电泳：如醋酸薄膜电泳、聚酰胺薄膜电泳、滤纸和薄膜电泳：如醋酸薄膜电泳、聚酰胺薄膜电泳、滤纸和薄膜电泳：如醋酸薄膜电泳、聚酰胺薄膜电泳 2 2 2 2、粉粉粉粉末末末末电电电电泳泳泳泳：支支支支持持持持介介介介质质质质是是是是淀淀淀淀粉粉粉粉、纤纤纤纤维维维维素素素素粉粉粉粉、硅硅硅硅胶胶胶胶粉粉粉粉等等等等，粉粉粉粉末末末末与与与与适适适适当的溶剂调和，铺成平板。当的溶剂调和，铺成平板。当的溶剂调和，铺成平板。当的溶剂调和，铺成平板。3 3 3 3、细丝电泳：如尼龙丝、人造丝电泳。此为微量电泳。、细丝电泳：如尼龙丝、人造丝电泳。此为微量电泳。、细丝电泳：如尼龙丝、人造丝电泳。此为微量电泳。、细丝电泳：如尼龙丝、人造丝电泳。此为微量电泳。4 4、凝凝凝凝胶胶胶胶电电电电泳泳泳泳：最最最最常常常常用用用用的的的的支支支支持持持持介介介介质质质质有有有有：聚聚聚聚丙丙丙丙烯烯烯烯酰酰酰酰胺胺胺胺、琼琼琼琼脂脂脂脂糖糖糖糖凝凝凝凝胶胶胶胶，凝胶可制作成平板或柱子。凝胶可制作成平板或柱子。凝胶可制作成平板或柱子。凝胶可制作成平板或柱子。11第11页，本讲稿共19页 按仪器装置形式可分为：按仪器装置形式可分为：按仪器装置形式可分为：按仪器装置形式可分为：1 1、平平平平板板板板电电电电泳泳泳泳：将将将将支支支支持持持持物物物物质质质质铺铺铺铺在在在在平平平平板板板板上上上上（玻玻玻玻璃璃璃璃或或或或有有有有机机机机玻玻玻玻璃璃璃璃）进进进进行行行行电电电电泳泳泳泳，此法最为常用。此法最为常用。此法最为常用。此法最为常用。2 2、垂直板电泳：将支持物铺在平板上，作垂直装置后进行电泳。、垂直板电泳：将支持物铺在平板上，作垂直装置后进行电泳。、垂直板电泳：将支持物铺在平板上，作垂直装置后进行电泳。、垂直板电泳：将支持物铺在平板上，作垂直装置后进行电泳。3 3、垂垂垂垂直直直直柱柱柱柱形形形形电电电电泳泳泳泳：将将将将支支支支持持持持物物物物质质质质装装装装在在在在垂垂垂垂直直直直的的的的圆圆圆圆形形形形玻玻玻玻璃璃璃璃柱柱柱柱内内内内进进进进行电泳。行电泳。行电泳。行电泳。（圆圆圆圆盘盘盘盘电电电电泳泳泳泳：将将将将支支支支持持持持物物物物质质质质装装装装入入入入同同同同一一一一规规规规格格格格的的的的玻玻玻玻璃璃璃璃管管管管内内内内，在在在在一一一一不不不不连续系统中进行电泳，样品分离后的区带类似圆盘。）连续系统中进行电泳，样品分离后的区带类似圆盘。）连续系统中进行电泳，样品分离后的区带类似圆盘。）连续系统中进行电泳，样品分离后的区带类似圆盘。）12第12页，本讲稿共19页血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳法分离血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳法分离实验目的实验目的:掌握醋酸纤维薄膜电泳法分离蛋白质掌握醋酸纤维薄膜电泳法分离蛋白质 的原理和方法。的原理和方法。13第13页，本讲稿共19页相关知识相关知识l血清蛋白血清蛋白 蛋白质名称蛋白质名称等电点（等电点（pIpI）相对分子质量相对分子质量白蛋白白蛋白1 1球蛋白球蛋白2 2球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白4.84.85.065.065.065.065.125.126.856.857.57.56900069000200000200000300000300000900009000015000015600030000014第14页，本讲稿共19页 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳 一、原理：一、原理：一、原理：一、原理：采用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法称为醋酸纤维素薄膜电采用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法称为醋酸纤维素薄膜电采用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法称为醋酸纤维素薄膜电采用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法称为醋酸纤维素薄膜电泳。醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯。将泳。醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯。将泳。醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯。将泳。醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯。将它溶于有机溶剂（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂它溶于有机溶剂（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂它溶于有机溶剂（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂它溶于有机溶剂（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，厚度约为结构，厚度约为结构，厚度约为结构，厚度约为120120120120微米，有很强的通透性，对分子移动阻力很小。微米，有很强的通透性，对分子移动阻力很小。微米，有很强的通透性，对分子移动阻力很小。微米，有很强的通透性，对分子移动阻力很小。醋酸纤维素薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高，对醋酸纤维素薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高，对醋酸纤维素薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高，对醋酸纤维素薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高，对样品无拖尾和吸附现象等优点。已广泛应用于科学实验、生化产样品无拖尾和吸附现象等优点。已广泛应用于科学实验、生化产样品无拖尾和吸附现象等优点。已广泛应用于科学实验、生化产样品无拖尾和吸附现象等优点。已广泛应用于科学实验、生化产品分析和临床化验，如：血清蛋白、血红蛋白、脂蛋白、球蛋白、品分析和临床化验，如：血清蛋白、血红蛋白、脂蛋白、球蛋白、品分析和临床化验，如：血清蛋白、血红蛋白、脂蛋白、球蛋白、品分析和临床化验，如：血清蛋白、血红蛋白、脂蛋白、球蛋白、糖蛋白等的分离和鉴定。糖蛋白等的分离和鉴定。糖蛋白等的分离和鉴定。糖蛋白等的分离和鉴定。二、操作要点二、操作要点二、操作要点二、操作要点15第15页，本讲稿共19页 （一）仪器与薄膜的准备：（一）仪器与薄膜的准备：（一）仪器与薄膜的准备：（一）仪器与薄膜的准备：1 1 1 1、醋酸纤维薄膜的润湿和选择：、醋酸纤维薄膜的润湿和选择：、醋酸纤维薄膜的润湿和选择：、醋酸纤维薄膜的润湿和选择：将醋酸纤维薄膜条浸于盛有巴比妥缓冲液的培养皿中，用镊子轻压，将醋酸纤维薄膜条浸于盛有巴比妥缓冲液的培养皿中，用镊子轻压，将醋酸纤维薄膜条浸于盛有巴比妥缓冲液的培养皿中，用镊子轻压，将醋酸纤维薄膜条浸于盛有巴比妥缓冲液的培养皿中，用镊子轻压，使它全部浸入缓冲液内，待膜完全浸透（约半小时）后取出，夹在清洁的使它全部浸入缓冲液内，待膜完全浸透（约半小时）后取出，夹在清洁的使它全部浸入缓冲液内，待膜完全浸透（约半小时）后取出，夹在清洁的使它全部浸入缓冲液内，待膜完全浸透（约半小时）后取出，夹在清洁的滤纸中间，轻轻吸去多余的缓冲液，同时分辨出光泽面和无光泽面，并用滤纸中间，轻轻吸去多余的缓冲液，同时分辨出光泽面和无光泽面，并用滤纸中间，轻轻吸去多余的缓冲液，同时分辨出光泽面和无光泽面，并用滤纸中间，轻轻吸去多余的缓冲液，同时分辨出光泽面和无光泽面，并用铅笔在无光泽面上作记号。铅笔在无光泽面上作记号。铅笔在无光泽面上作记号。铅笔在无光泽面上作记号。2 2 2 2、制作、制作、制作、制作“滤纸桥滤纸桥滤纸桥滤纸桥”。（二）点样：（二）点样：（二）点样：（二）点样：将此血清涂在将此血清涂在将此血清涂在将此血清涂在薄薄薄薄载玻片的一端截面上，然后轻轻与距纤维薄膜载玻片的一端截面上，然后轻轻与距纤维薄膜载玻片的一端截面上，然后轻轻与距纤维薄膜载玻片的一端截面上，然后轻轻与距纤维薄膜一端一端一端一端2cm2cm2cm2cm处接触，样品即呈一条带状渗透在纤维薄膜上。切不可用力过大处接触，样品即呈一条带状渗透在纤维薄膜上。切不可用力过大处接触，样品即呈一条带状渗透在纤维薄膜上。切不可用力过大处接触，样品即呈一条带状渗透在纤维薄膜上。切不可用力过大把薄膜弄破。将薄膜平贴在滤纸桥上，点样端放在阴极，加盖密封平衡十把薄膜弄破。将薄膜平贴在滤纸桥上，点样端放在阴极，加盖密封平衡十把薄膜弄破。将薄膜平贴在滤纸桥上，点样端放在阴极，加盖密封平衡十把薄膜弄破。将薄膜平贴在滤纸桥上，点样端放在阴极，加盖密封平衡十分钟。分钟。分钟。分钟。（三）电泳：（三）电泳：（三）电泳：（三）电泳：电压稳定在电压稳定在电压稳定在电压稳定在100100100100120V120V120V120V，时间，时间，时间，时间4545454560606060分钟，待电泳区带展开约分钟，待电泳区带展开约分钟，待电泳区带展开约分钟，待电泳区带展开约3 3 3 33.5cm3.5cm3.5cm3.5cm后关闭电源。后关闭电源。后关闭电源。后关闭电源。16第16页，本讲稿共19页（四）染色：四）染色：四）染色：四）染色：电泳完毕后立即取出薄膜，直接浸入染色液中，染色电泳完毕后立即取出薄膜，直接浸入染色液中，染色电泳完毕后立即取出薄膜，直接浸入染色液中，染色电泳完毕后立即取出薄膜，直接浸入染色液中，染色5 5 5 510101010分钟。然分钟。然分钟。然分钟。然后，用漂洗液浸洗，每后，用漂洗液浸洗，每后，用漂洗液浸洗，每后，用漂洗液浸洗，每10101010分钟左右换一次漂洗液，连续更换分钟左右换一次漂洗液，连续更换分钟左右换一次漂洗液，连续更换分钟左右换一次漂洗液，连续更换3 3 3 35 5 5 5次，至次，至次，至次，至背景无色为止。染色完后将薄膜夹在干净的滤纸中，吸去多余的溶液。背景无色为止。染色完后将薄膜夹在干净的滤纸中，吸去多余的溶液。背景无色为止。染色完后将薄膜夹在干净的滤纸中，吸去多余的溶液。背景无色为止。染色完后将薄膜夹在干净的滤纸中，吸去多余的溶液。（五）结果判断：（五）结果判断：（五）结果判断：（五）结果判断：一般在染色后的薄膜上可显现清楚的五条区带。从正极端起，依次为一般在染色后的薄膜上可显现清楚的五条区带。从正极端起，依次为一般在染色后的薄膜上可显现清楚的五条区带。从正极端起，依次为一般在染色后的薄膜上可显现清楚的五条区带。从正极端起，依次为清蛋白，清蛋白，清蛋白，清蛋白，1 1 1 1球蛋白，球蛋白，球蛋白，球蛋白，2 2 2 2球蛋白，球蛋白，球蛋白，球蛋白，球蛋白，球蛋白，球蛋白，球蛋白，球蛋白。球蛋白。球蛋白。球蛋白。17第17页，本讲稿共19页A 清蛋白清蛋白 1 2 清蛋白清蛋白 1 2 B血血 清清 蛋蛋 白白 电电 泳泳 图图 谱谱18第18页，本讲稿共19页（六）定量：（六）定量：l l 一般采用洗脱法或光密度扫描法，测定各蛋白质组分一般采用洗脱法或光密度扫描法，测定各蛋白质组分一般采用洗脱法或光密度扫描法，测定各蛋白质组分一般采用洗脱法或光密度扫描法，测定各蛋白质组分的相对百分含量。的相对百分含量。的相对百分含量。的相对百分含量。l l人血清中五种蛋白质的正常值范围：人血清中五种蛋白质的正常值范围：人血清中五种蛋白质的正常值范围：人血清中五种蛋白质的正常值范围：清蛋白清蛋白清蛋白清蛋白 54.054.073.073.0；1 1球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白 2.82.85.15.1；2 2球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白 6.36.310.610.6：球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白 5.25.21111：球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白 12.512.520.020.0。19第19页，本讲稿共19页