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现代分离技术超临界流体色谱第1页，本讲稿共61页 什么是超临界流体什么是超临界流体?（Supercritical Fluid 简称简称SCF）n任何一种物质都存在三种相态-气相、液相、固相。n事实上当温度和压力达到一定值时，物质就会出现超临界状态。n物质的临界状态是指其气态与液态共存的一种边缘状态。n在此状态中，液体的密度与其饱和蒸汽的密度相同，因此界面消失。第2页，本讲稿共61页n液、气两相成平衡状态的点叫临界点。在临界点时的温度和压力分别称为临界温度Tc临界压力Pc。n超临界流体超临界流体是指超过临界温度与临界压力状态的流体。如果某种流体处于临界温度之上（即TTc），无论压力多高（即PPc），也不能液化，这个状态的物质常常不称为气体或液体，而被称为超临界流体（Supercritical Fluid 简称SCF）。第3页，本讲稿共61页n利用超临界流体的特殊性质，使其在超临界状态下，与待分离的物料接触，萃取出目的产物，然后通过降压降压或升升温温的方法，使萃取物得到分离q常用萃取剂n极性萃取剂：乙醇、甲醇、水（难）n非极性萃取剂：二氧化碳（易）超临界流体萃取的基本思想超临界流体萃取的基本思想第4页，本讲稿共61页n临界点：临界点：T：304.1P：73.8 barn优点：优点：缺点：缺点：q临界条件温和 设备投资大q产品分离简单q无毒、无害q不燃q无腐蚀性q价格便宜超临界二氧化碳萃取超临界二氧化碳萃取（Supercritical Carbon Dioxide Extraction）第5页，本讲稿共61页实验室用超临界萃取设备第6页，本讲稿共61页大型超临界流体萃取装置第7页，本讲稿共61页n咖啡因萃取咖啡因萃取n植物油：胚芽油、玉米油、植物油：胚芽油、玉米油、亚麻酸亚麻酸n天然香料：杏仁油、柠檬油天然香料：杏仁油、柠檬油n啤酒花啤酒花n尼古丁尼古丁超临界流体的应用超临界流体的应用第8页，本讲稿共61页第四章第四章 色层分析法色层分析法色层分析法又称为层析法或色谱分析法。色层分析法又称为层析法或色谱分析法。它是利用物质的物理化学性质的差异，分离、分析多组分混合物的它是利用物质的物理化学性质的差异，分离、分析多组分混合物的一种分析方法。一种分析方法。4.1概述概述4.2吸附色层法（吸附色层法（adsorption chromatography）4.3分配层析（分配层析（distribution chromatography）4.4离子交换层析离子交换层析4.5凝胶过滤层析凝胶过滤层析4.6亲和层析亲和层析4.7气相层析气相层析第9页，本讲稿共61页4.1 概述n4.1.1发展史发展史n 色层分析法最早始于1906年。n俄国植物学家M.Tswett在研究叶绿素时，让叶绿素的石油醚提取液通过装有CaCO3的管柱，并继续用石油醚淋洗，他发现由于CaCO3对提取液中的色素的不同吸附能力，在CaCO3上形成多个不同的色带。n以后的30年这一方法并没有引起人们的注意。直到1931年，R.Kuhn等人用色层分析法分离复杂的有机混合物时，这种方法才受到人们的重视。n这一方法现在已成为生物化学、分子生物学及其它学科领域有效的分离分析工具之一。第10页，本讲稿共61页4.1.2语源学语源学 nchrome意为“色彩”，graphy源自希腊文，意为“写”。n色谱为层析的同义语，都是从英语chromatography译来的。n 层析（色谱）chromatograpby第11页，本讲稿共61页4.1.3原理原理n层析法是利用不同物质理化性质的差异而建立层析法是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。起来的技术。n层析系统都由两个相组成：层析系统都由两个相组成：n一是固定相，一是固定相，它或者是固体物质或者是固定于它或者是固体物质或者是固定于固体物质上的成分；固体物质上的成分；n另一是流动相，即可以流动的物质另一是流动相，即可以流动的物质 第12页，本讲稿共61页n当待分离的混合物随溶剂（流动相）通过固定相时当待分离的混合物随溶剂（流动相）通过固定相时n由于各组份的由于各组份的理化性质理化性质存在差异，存在差异，n与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，不同，在两相中的分配（含量对比）不同，n而且随溶剂向前移动，各组份不断地在两相中进行再分配。而且随溶剂向前移动，各组份不断地在两相中进行再分配。第13页，本讲稿共61页n与固定相相互作用力越弱与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小，动时受到的阻滞作用小，向前移动的速度快。向前移动的速度快。n反之，与固定相相互作用越强的组份，向前移反之，与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越慢。动速度越慢。n分布收集流出液，可得到样品中所含的各单一分布收集流出液，可得到样品中所含的各单一组份，从而达到将各组份分离的目的。组份，从而达到将各组份分离的目的。第14页，本讲稿共61页 4.1.3原理、构成层析法的条件原理、构成层析法的条件 色层法应具备的因素或条件是：色层法应具备的因素或条件是：1.具有两相具有两相 2.混合物中各组分的物理化学性质有差异混合物中各组分的物理化学性质有差异 3.多次冲洗或展开多次冲洗或展开第15页，本讲稿共61页n 4.1.4分类分类n按两相所处状态分类按两相所处状态分类流动相流动相液体液体气体气体固定相固定相液体液体液液-液层析法液层析法气气-液层析法液层析法固体固体液液-固层析法固层析法气气-固层析法固层析法第16页，本讲稿共61页n2.按固定相的使用形式（即实验技术）分：按固定相的使用形式（即实验技术）分：n 柱层析、纸上层析、薄层层析柱层析、纸上层析、薄层层析n3.按分离机制分（即物理化学性质）：n 吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶 过滤、其它层析（如亲和层析）等。n 4.按展开方式分：n 洗脱法、迎头法、置换法第17页，本讲稿共61页4.2吸附色层法（吸附色层法（adsorption chromatography）n吸附是在1909年提出的一个术语，指在固体或液体内部或表面的选择性传递。n在吸附过程中，气体或液体中的分子或原子或离子扩散到固体表面，通过与固体表面的氢键或弱分子间力作用而吸附，被吸附的物质称为溶质，而固体材料成为吸附剂。n吸附层析：吸附层析：是指混合物随流动相通过吸附剂组成的固定相时，在固定相和流动相作用下发生吸附、脱附、再吸附、再脱附的反复过程，由吸附剂对不同物质的不同吸附力而使混合物分离的方法。第18页，本讲稿共61页吸附层析是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离的方法。吸附层析是各种层析技术中应用最早的技术。吸附剂来源丰富、价格低廉、可再生，吸附设备简单。吸附层析通常采用柱型装置，将吸附剂装在吸附柱中，装置成吸附层析柱吸附层析柱。层析时，欲分离的混合溶液自柱顶加入，当样品液全部进入吸附层析柱后，再加入洗脱剂解吸洗脱。在洗脱时，层析柱内不断发生解在洗脱时，层析柱内不断发生解吸、吸附、再解吸、再吸附的过吸、吸附、再解吸、再吸附的过程。程。第19页，本讲稿共61页4.2.1原理n吸附层析是通过样品在固定相和流动相之间的吸附、脱附作用而实现吸附层析是通过样品在固定相和流动相之间的吸附、脱附作用而实现分离的。分离的。n这种吸附作用是一种物理吸附，通常是单分子层或双分子层或多分子层。n它包括几种作用力，被分离样品与吸附剂之间相反电荷基团与基团之间的静电引力，氢键、偶极分子之间定向力及范德华力等。n在不同条件下各种作用力的作用强弱各不相同，占主要地位的作用力可能是一种也可能几种力同时起作用。第20页，本讲稿共61页4.2.2吸附剂的类型吸附剂的类型n吸附剂一般是多孔性的微粒状物质。n吸附剂的多孔结构、粒度和离子形状是影响色层系统特性的基本因素。n常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、活性炭、硅酸镁、聚酰胺、硅藻土等。第21页，本讲稿共61页4.2.3流动相的选择n流动相一般是洗脱吸附柱的溶液，需要满足一下要求：稳定性好，黏度小，易于分离，易于洗脱所有分离组分。n流动相的洗脱作用实质是流动相分子与被分离的溶质分子竞争占据吸附剂表面活性中心的过程。n强极性的流动相分子竞争占据吸附中心的能力强，具有强的洗脱作用。n非极性的流动相分子竞争占据吸附中心的能力弱，洗脱作用弱。n在选择洗脱剂时，还可以由各种溶剂按不同配比配成混合溶剂作为流动相。因此，流动相的种类很多，在实践中，一般从极性小到极性大，通过实验来选择溶剂。第22页，本讲稿共61页4.3分配层析（distribution chromatography）n分配层析：是指在一个有两相存在的系统中，利用不同物质分配层析：是指在一个有两相存在的系统中，利用不同物质的分配系数不同而使其分离的方法。的分配系数不同而使其分离的方法。n在层析分离过程中，这两种互不混溶的溶剂之一为流动相；n另一种是吸收在载体中的溶剂，这种溶剂是键合在载体中，再层析过程不流动，为固定相。第23页，本讲稿共61页n例如：硅胶上键合水位固定相，环己烷和丙酮混合液为流动相分离氨基酸就是一个典型的例子。n在支持物上形成部分互溶的两相系统。n一般是水相和有机溶剂相。n常用支持物是硅胶、纤维素和淀粉等，这些亲水物质能储留相当量的水。被分离物质在两相中都能溶解，但分配比率不同，展层时就会形成以不同速度向前移动的区带。第24页，本讲稿共61页4.4离子交换层析n支持物是人工交联的带有能解离基团的有机高分子，如离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换凝胶等。n带阳离子基团的，如磺酸基（SO3H）、羧甲基（CH2COOH）和磷酸基等为阳离子交换剂。n带阴离子基团的，如DEAE（二乙基胺乙基）和QAE（四级胺乙基）等为阴离子交换剂。是指用交联剂使是指用交联剂使2个或者更多的分子分个或者更多的分子分别偶联从而使这些分子结合在一起别偶联从而使这些分子结合在一起 第25页，本讲稿共61页n离子交换层析只适用于能在水中解离的化合物，包括有机物和无机物。n对于蛋白质、核酸、氨基酸及核苷酸的分离分析有极好的分辨力。n离子交换基团在水溶液中解离后，能吸引水中被分离物的离子，各种物质在离子交换剂上的离子浓度与周围溶液的离子浓度保持平衡状态，各种离子有不同的交换常数，K值愈高，被吸附愈牢。n洗脱时，增加溶液的离子强度，如改变pH，增加盐浓度，离子被取代而解吸下来。洗脱过程中，按K值不同，分成不同的区带。第26页，本讲稿共61页4.5凝胶过滤层析n支持物是人工合成的交联高聚物，在水中膨胀后成为凝胶。n凝胶内为内水层，凝胶周围的水为外水层。n控制交联度以形成不同孔径的网状结构。n交联度小的孔径大，交联度大的孔径小。第27页，本讲稿共61页n凝胶只允许被分离物质中小于孔径的分子进入，大于孔径的分子被排斥在外水层，最先被洗脱下来。n而进入孔径的分子也按分子量大小大致分离成不同的区带。n选择不同规格的凝胶，可把一个混合物按分子量的差异分成不同的组分。n目前常用的凝胶商品有：葡聚糖凝胶（sephadex）、聚丙烯酰胺凝胶（bio-gel）、琼脂糖凝胶（sepharose）和聚苯乙烯凝胶（styragel）等。第28页，本讲稿共61页4.6亲和层析亲和层析 affinity ghromatographyn又称为功能层析。n在一对有专一的相互作用的物质中，把其中之一联结在支持物上，用于纯化相对的另一物质。n常见的亲和对,如：酶和抑制剂，抗原和抗体，激素和受体等。支持物为琼脂糖或纤维素等。n专一性强，分离速度快。第29页，本讲稿共61页4.7气相层析 gas ghromatography n属于分配层析或吸附层析，仅适用于分析分离挥发性和低挥发性物质。n固定相是在惰性支持物（如磨细的耐火砖）上覆盖一层高沸点液体，n流动相常用氦、氩或氮为展层气体。第30页，本讲稿共61页n气相层析分离的区带十分清晰，是由于挥发性物质在两相间能很快达到平衡，所需分析时间大为缩短，一般为数分钟至10余分钟。n检测记录系统绘出的各峰是测定流出气体电阻变化的结果，因而测定样品量可到微克和毫微克水平。n具有快速、灵敏和微量的优点。气相层析也能用于分离制备样品，但需增加将流出气体通过冷冻将分离物回收的装置。第31页，本讲稿共61页气相层析仪流量控制q流量控制阀中装有限流器 q钢瓶压力亦需适当调整 q载流气体必須是高纯度，且需在气体钢瓶和气相层析仪间加装纯化装置，以去除气体中的微量水气和氧气样品注入系统q手动注射q自动注射q吹气捕捉第32页，本讲稿共61页气体及管线 氣體鋼瓶Helium氣相層析儀除氧除水開關閥兩段式調壓閥開關閥第33页，本讲稿共61页第34页，本讲稿共61页第35页，本讲稿共61页4.8 柱层析 一、吸附柱层析一、吸附柱层析 1.原理 吸附柱层析是利用吸附剂对混合试样各组分的吸附力不同而使各组分分离。当采用溶剂洗脱时，发生一系列吸附解吸再吸附再解吸的过程，吸附力较强的组分，移动的距离小，后出柱；吸附力较弱的组分，移动的距离大，先出柱。第36页，本讲稿共61页 2.洗脱方法及流出曲线 有色物质分离的洗脱方法 推出法：有色物质分离后，将吸附剂从柱中推出，用刀按层切开，分层洗脱再定量。无色物质分离的洗脱方法及流出曲线 无色物质分层后，可采用流出曲线加以判断。流出曲线：以物质浓度为纵座标，以收集的洗脱液体积为横座标，得出的曲线。第37页，本讲稿共61页 柱层析中按洗脱剂（溶剂）的不同可分为以下三种：设样品中含有A、B两组分，前者吸附力弱，即样品与固定相吸附力AB。洗脱法 洗脱剂：纯溶剂 最初流出纯溶剂，尔后是吸附力较弱的A，最后为吸附力较强的B组分。第38页，本讲稿共61页 迎头法 洗脱剂：原试样溶液 最初流出纯溶剂，一定体积后，吸附力较弱的A组分开始流出，一段时间后，吸附力较强的组分B与A 一起流出。置换法 洗脱剂：置换剂（即内含吸附力更强的吸附剂）。先置换A，再置换B。第39页，本讲稿共61页 3.吸附剂的选择 吸附剂应具有合适的吸附力。颗粒均匀、大小适宜。吸附与解吸可逆。不含杂质。不溶于所使用的溶剂（即洗脱剂），与欲分离的物质 不发生化学反应。第40页，本讲稿共61页 4.洗脱剂的选择 样品在溶剂中具有一定溶解度。一般采用无水溶剂，且与水不互溶。溶剂沸点适宜。纯度要高，无杂质。第41页，本讲稿共61页 二、分配柱层析二、分配柱层析 1.原理 分配层析是根据混合物中各组分在两种不相混溶的溶剂间溶解度（即分配系数）的不同，使各组分得以分离。分配系数K：当溶质在两种不相混溶的溶剂中达到平衡时，溶质在两种溶剂（即两相）中的浓度比值为一常数，称做分配系数。各种组分具有各自的分配系数K，同一物质，温度不同时，K不同。在分配的各组分中，某组分K，则固定相中浓度 C固 ，C流，后出柱。第42页，本讲稿共61页 2.固定相与流动相 固定相：由支持剂和液体（多为水）组成。流动相：一般是有机溶剂。鉴于固定相、流动相均为液体，故分配层析为液液色谱。当流动相是水或水溶液，固定相液体是有机溶剂时，称为反相分配层析。第43页，本讲稿共61页 3.移动速率Rf Rf主要是用于比较各组分移动速度的大小，即在同一时间内，各组分移动距离的大小，作为定性之用。=第44页，本讲稿共61页 三、离子交换柱层析三、离子交换柱层析 1.离子交换树脂 结构及分类 离子交换树脂是一种疏松的、具有多孔网状结构的高分子化合物。离子交换树脂通常是在合成树脂母体中引入一些活性基团组成的。性质 离子交换树脂不溶于水、酸、碱和有机溶剂。最主要的性质是具有离子交换能力。第45页，本讲稿共61页 交联度与交换摩尔 交联度：指离子交换树脂中交联剂的百分含量。交联度越大，则可用于交换的基团减少，但网眼小，可提高选择性。交换摩尔：表示树脂交换能力的大小，以每克干树脂所能交换离子的毫克摩尔数表示。离子交换树脂的选择性 离子交换树脂对不同离子的选择性不同（即亲和力不同）。第46页，本讲稿共61页 2.离子交换柱层析原理及操作 原理 将离子交换树脂装入柱中，利用各种离子对离子交换树脂的亲和力的不同，而使离子型化合物得以分离。操作 树脂装柱样品上柱欲分离组分吸留水洗（除杂物）洗脱收集再生 第47页，本讲稿共61页4.10 纸上层析 一、原理一、原理 纸上层析是一种分配层析。固定相：由滤纸和水组成，其中滤纸是支持剂。流动相：多元溶剂系统（即混合溶剂）。故纸上层析属液-液色谱。纸上层析是在滤纸的一端滴上要分离的样品，放在密闭的容器内，使溶剂从有样品的一端流向另一端，从而使得混合物中各组分得以分离。第48页，本讲稿共61页 特点：设备仪器简单，操作方便，样品需要量少，灵敏度高，但展开时间长。目前，纸上层析广泛应用于生物化学、有机、无机等方面，在发酵工业中也广泛应用，尤其在科研单位应用较多，已用于分离糖类、氨基酸、有机酸、色素、维生素等分析工作中。第49页，本讲稿共61页 二、层析滤纸二、层析滤纸 1.对滤纸的要求 滤纸质地均匀，厚薄一致。具有一定的机械强度，被溶剂浸湿后能站立。滤纸纤维松紧程度适宜，溶剂展开速度合适。具有一定纯度。滤纸上不含有溶于水及有机溶剂的物质。第50页，本讲稿共61页 2.滤纸的选用 按溶剂在滤纸上流速的不同，将滤纸分为三种：快速滤纸：纤维疏松，展开速度快，但斑点易扩散，适用于Rf相差大的组分分离，或急于了解结果。慢速滤纸：纤维紧密，展开速度慢，斑点小，适用于Rf 相差小的组分分离。中速滤纸：性能介于两者之间。另外，滤纸还有厚薄之分。第51页，本讲稿共61页 三、溶剂系统三、溶剂系统 1.组成 纸上层析主要用于分离亲水物质或极性较大的物质，展开时，以极性较大的水作固定相，流动相宜用极性较小的溶剂。一般采用多元溶剂系统，即展开剂由两种或三种溶剂由一定比例配制而成。第52页，本讲稿共61页溶剂系统中各组分按其性能的不同，可分为三类：第一类：对分离物质的溶解度很小，非极性物质，导致Rf 小，占主导地位。第二类：对分离物质的溶解度很大，极性物质，导致Rf大。第三类：调节溶剂各组分比例或系统pH，或各组分的互溶程度。第53页，本讲稿共61页 2.选用 选用溶剂系统应从以下几个方面考虑：分离物质在该溶剂系统中Rf=0.050.85，两个被分离组分Rf之差大于0.05。溶剂系统与分离组分不发生化学反应。在该系统中，分配系数不受或少受温度影响。溶剂系统不能影响显色。溶剂挥发性好，展开后易于滤纸干燥。第54页，本讲稿共61页 四、操作方法四、操作方法 1.点样：先用铅笔划原线和原点。用毛细管或微量注射器点样。2.平衡 平衡：是指展开前将滤纸与层析缸用溶剂系统的蒸汽加以饱和的过程。第55页，本讲稿共61页 3.展开 平衡后，将点样一端浸入展开剂中。按溶剂在滤纸上流动方向的不同，展开方式可分为三种：上升法（上行法）下降法（下行法）环行法（水平法）以上方法中，当溶剂前沿到达滤纸另一端1cm处时，表示展开完毕，取出滤纸，用铅笔在溶剂前沿处画一直线，晾干。第56页，本讲稿共61页 4.显色 如果组分有色，可得到有色斑点，则不需显色。当组分无色时，需要显色。一般有两种显色方法：紫外光显色法 显色剂显色法 用化学试剂作显色剂，以显示组分斑点的位置。注：显色后斑点易褪色，应立即用铅笔描出斑点位置。第57页，本讲稿共61页 五、定性分析五、定性分析 1.移动速率Rf 同柱层析一样，为表示某组分移动速率的快慢，用Rf表示之。2.影响Rf的主要因素 滤纸 溶剂系统 温度 pH 样品本身性质 第58页，本讲稿共61页 3.定性鉴定 以上讨论了影响Rf的因素，如果在一定的操作条件下，每一物质都有各自恒定的 Rf值。各种不同的物质，即使在相同的操作条件下，由于它们各自分配系数K的不同，Rf值也不同。因此，我们可以在相同条件下，测Rf对各种物质进行定性鉴定。第59页，本讲稿共61页纸层析纸层析 单向纸层析图单向纸层析图RfRf值值 第60页，本讲稿共61页 思考题：思考题：1.层析法的分离原理是什么？2.吸附层析、分配层析、离子交换层析的原理是什么？3.纸上层析的原理是什么？它属什么类型的层析？其固定相、流动相是什么？4.什么是分配系数K？什么是移动速率Rf？组分随流动相移动速率的大小与K有何关系？5.纸上层析操作中展开前，为何要有“平衡”过程？这里的“平衡”是什么？6.纸上层析的展开方式有哪几种？特点如何？7.影响纸上层析 Rf的主要因素有哪些？第61页，本讲稿共61页