中药制剂检验新技术15145.pptx

第六章第六章 中药制剂检验新技术中药制剂检验新技术u目前，各种先进的分析技术和方法越来越多地用于中药及其目前，各种先进的分析技术和方法越来越多地用于中药及其制剂，从而大大提高了药品检验工作的质量和水平。例如，制剂，从而大大提高了药品检验工作的质量和水平。例如，指纹图谱技术（指纹图谱技术（FPFP）、毛细管电泳法（）、毛细管电泳法（CECE）、电感耦合等离）、电感耦合等离子体质谱法（子体质谱法（ICPMSICPMS）、原子吸收分光光度法（）、原子吸收分光光度法（AASAAS）以及各）以及各种色质联用技术等。其中有些已被中国药典收载，成为种色质联用技术等。其中有些已被中国药典收载，成为法定的检验方法。本章将重点介绍指毛细管电泳法和超临界法定的检验方法。本章将重点介绍指毛细管电泳法和超临界流体色谱法。流体色谱法。第一节 毛细管电泳法 （一）原理（一）原理 毛细管电泳（毛细管电泳（CE）亦称为高效毛细管电泳法（）亦称为高效毛细管电泳法（HPCE），是），是20 世纪世纪80年代发展起来的一类高效快速的分离分析方法。该法系以弹性年代发展起来的一类高效快速的分离分析方法。该法系以弹性 毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分的毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分的 淌度淌度（单位电场强度下的迁移（单位电场强度下的迁移速度）和分配行为的差异而实速度）和分配行为的差异而实现分离，因此可将其视为经典现分离，因此可将其视为经典电泳技术和现代微柱分离相结电泳技术和现代微柱分离相结合的产物。合的产物。CE分离原理图示分离原理图示（二）特点（二）特点 高效、低耗、快速、广谱高效、低耗、快速、广谱 与与HPLC比较比较1.柱效更高，理论板数可达柱效更高，理论板数可达105 5-106 6m-1，这主要是由于该法无固定相，这主要是由于该法无固定相，不存在不存在传质差异传质差异，整个流体就像，整个流体就像塞子塞子似的以均速向前流动。似的以均速向前流动。2.分析速度更快，几十秒至十几分钟内即可完成一个试样的分析。分析速度更快，几十秒至十几分钟内即可完成一个试样的分析。3.溶剂和样品消耗极少，样品用量仅为纳升（溶剂和样品消耗极少，样品用量仅为纳升（nl）级。不需高压泵输液，）级。不需高压泵输液，毛细管价格低廉，因此工作成本更低。毛细管价格低廉，因此工作成本更低。4.通过改变操作模式和缓冲溶液的成分，通过改变操作模式和缓冲溶液的成分，该法有很大的选择性，可对各种成分进该法有很大的选择性，可对各种成分进 行有效的分离。例如，中性有机分子、行有效的分离。例如，中性有机分子、无机离子、蛋白质等高分子化合物，甚无机离子、蛋白质等高分子化合物，甚 至整个细胞或病毒。至整个细胞或病毒。HPLCCE（三）分离模式（共（三）分离模式（共6 6种）种）1.1.毛细管区带电泳毛细管区带电泳（CZECZE）u CZECZE又称为自由溶液区带电泳，系毛细管电泳中又称为自由溶液区带电泳，系毛细管电泳中最基本最基本、应用应用最广最广的一种操作模式，即将分析溶液引入毛细管进样一端，施的一种操作模式，即将分析溶液引入毛细管进样一端，施加直流电压后，各组分按各自的电泳流和电渗流的矢量和流向加直流电压后，各组分按各自的电泳流和电渗流的矢量和流向毛细管出口端，按阳离子、中性分子和阴离子及其电荷大小的毛细管出口端，按阳离子、中性分子和阴离子及其电荷大小的顺序通过检测器。但顺序通过检测器。但中性组分彼此不能分离中性组分彼此不能分离，因均随电渗流，因均随电渗流（EOFEOF）一起迁移。出峰时间称为迁移时间（）一起迁移。出峰时间称为迁移时间（tmtm），相当于高效），相当于高效液相色谱（液相色谱（HPLCHPLC）和气相色谱（）和气相色谱（GCGC）中的保留时间。）中的保留时间。CZECZE较适合较适合带电溶质的分离，由于中性物质均系靠电渗流迁移，不存在迁带电溶质的分离，由于中性物质均系靠电渗流迁移，不存在迁移速度的差异，故不能实现分离。移速度的差异，故不能实现分离。2.胶束电动毛细管色谱胶束电动毛细管色谱（MEKC或或MECC）u该法系以该法系以胶束为假固定相胶束为假固定相的一种电动色谱。的一种电动色谱。u 当操作缓冲液加入大于其临界胶束浓度的离子型表面活性剂如十当操作缓冲液加入大于其临界胶束浓度的离子型表面活性剂如十二烷基硫酸钠（二烷基硫酸钠（SDS）或十六烷基三甲基溴化胺（）或十六烷基三甲基溴化胺（CTAB）、胆酸等，）、胆酸等，这时表面活性剂就聚集形成胶束（假固定相），其亲水端朝外，这时表面活性剂就聚集形成胶束（假固定相），其亲水端朝外，憎水非极性核朝内，溶质则在水和胶束两相间分配，各溶质因分憎水非极性核朝内，溶质则在水和胶束两相间分配，各溶质因分配系数存在差别而被分离。对于常用的配系数存在差别而被分离。对于常用的阴离子表面活性剂十二烷阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（基硫酸钠（SDS），），进样后极强亲水性组分不能进入进样后极强亲水性组分不能进入SDS胶束，随胶束，随操作缓冲液流过检测器（容量因子操作缓冲液流过检测器（容量因子k=0）；极强憎水性组分则进）；极强憎水性组分则进入入SDS胶束的核中不再回到水相，最后到达检测器胶束的核中不再回到水相，最后到达检测器(k=)。其分。其分离原理见下图。离原理见下图。该法适合该法适合中性物质中性物质的分离。因不同的溶质在胶束中的的分离。因不同的溶质在胶束中的分配系数分配系数不同，不同，其迁移速度存在差异而实现分离。其迁移速度存在差异而实现分离。MECC弥补了弥补了CZE不能分离中性物质的不能分离中性物质的不足，进一步拓宽了毛细管电泳的应用范围，鉴于中药多数为离子型和不足，进一步拓宽了毛细管电泳的应用范围，鉴于中药多数为离子型和中性物质的混合体，因此中性物质的混合体，因此MECC更适合于中药分析更适合于中药分析。3.毛细管凝胶电泳（毛细管凝胶电泳（CGE）该法在毛细管中装入单体和引发剂引发聚合反应生成该法在毛细管中装入单体和引发剂引发聚合反应生成凝胶，该方法主要用于分析凝胶，该方法主要用于分析蛋白质、蛋白质、DNA等生物大分子。等生物大分子。另外还可利用聚合物溶液，如葡聚糖等的筛分作用进另外还可利用聚合物溶液，如葡聚糖等的筛分作用进行分析，称为毛细管无胶筛分。有时将它们统称为毛行分析，称为毛细管无胶筛分。有时将它们统称为毛细管筛分电泳，下分为凝胶电泳和无胶筛分两类。细管筛分电泳，下分为凝胶电泳和无胶筛分两类。4.毛细管等速电泳（毛细管等速电泳（CITP）该法采用前导电解质和尾随电解质，在毛细管中该法采用前导电解质和尾随电解质，在毛细管中充入前导电解质后，进样，电极槽中换用尾随电解充入前导电解质后，进样，电极槽中换用尾随电解质进行电泳分析，带不同电荷的组分迁移到各个狭质进行电泳分析，带不同电荷的组分迁移到各个狭窄的区带，然后依次通过检测器。窄的区带，然后依次通过检测器。5.毛细管等电聚焦电泳毛细管等电聚焦电泳（CIEF）将毛细管内壁涂覆聚合物减小电渗流，再将样品和将毛细管内壁涂覆聚合物减小电渗流，再将样品和两性电解质混合进样，两个电极槽中分别加入酸液两性电解质混合进样，两个电极槽中分别加入酸液和碱液，施加电压后，毛细管中的操作电解质溶液和碱液，施加电压后，毛细管中的操作电解质溶液逐渐形成逐渐形成pH梯度，各溶质在毛细管中迁移至各自等梯度，各溶质在毛细管中迁移至各自等电点（电点（PI）时变为中性，形成聚焦的区带，而后用）时变为中性，形成聚焦的区带，而后用压力或改变检测器末端电极槽储液的压力或改变检测器末端电极槽储液的pH值的办法使值的办法使溶质通过检测器。溶质通过检测器。6.毛细管电色谱毛细管电色谱（CEC）u该法是在毛细管电泳技术不断发展和液相色谱理论日益完善该法是在毛细管电泳技术不断发展和液相色谱理论日益完善的基础上逐渐兴起的。它是将细粒径固定相填充到毛细管中的基础上逐渐兴起的。它是将细粒径固定相填充到毛细管中或在毛细管内壁涂覆固定相以电渗流驱动操作缓冲液（有时或在毛细管内壁涂覆固定相以电渗流驱动操作缓冲液（有时再加辅助压力）进行分离的，包含了再加辅助压力）进行分离的，包含了色谱和电泳色谱和电泳两种机制，两种机制，其中以色谱为主，但对荷电溶质兼有电泳作用。其中以色谱为主，但对荷电溶质兼有电泳作用。u 该法克服了该法克服了CE选择性差和分离中性物质困难的缺点，同时选择性差和分离中性物质困难的缺点，同时提高了液相色谱的分离效率，形成其独特的高效、微量、快提高了液相色谱的分离效率，形成其独特的高效、微量、快捷的特点，开辟了高效微柱分离技术的新途径。捷的特点，开辟了高效微柱分离技术的新途径。二、仪器设备二、仪器设备（一）毛细管电泳仪的基本结构（见下图）（一）毛细管电泳仪的基本结构（见下图）1.电极槽和进样系统电极槽和进样系统 2.清洗系统清洗系统 3.毛细管毛细管 4.检测器检测器 5.铂电极铂电极 6.电极槽电极槽 7.恒温系统恒温系统 8.记录和数据处理记录和数据处理 （二）主要部件及其性能（二）主要部件及其性能 1.毛细管毛细管u毛细管为毛细管为弹性石英弹性石英毛细管。内径毛细管。内径50m50m和和75m75m两种使两种使用较多，内径细的分离效果较好，但柱上检测因光程用较多，内径细的分离效果较好，但柱上检测因光程较短，检测限比内径粗的要差。毛细管长度称为较短，检测限比内径粗的要差。毛细管长度称为总长总长度度，根据分离度的要求，可选用，根据分离度的要求，可选用2020100cm100cm长度，进长度，进样端至检测器间的长度称为样端至检测器间的长度称为有效长度有效长度。u毛细管常盘放在管架上，在一定温度下操作，以控制毛细管常盘放在管架上，在一定温度下操作，以控制焦耳热，操作缓冲液的黏度和电导度，对测定的重复焦耳热，操作缓冲液的黏度和电导度，对测定的重复性很重要。性很重要。2.直流高压电源直流高压电源 一般采用一般采用0-30kV0-30kV（或相近）可调节直流电源，可供（或相近）可调节直流电源，可供应约应约300A300A电流，具有稳压和稳流两种方式可供选择。电流，具有稳压和稳流两种方式可供选择。3.电极和电极槽电极和电极槽 两个电极槽里放入操作缓冲液，分别插入毛细管的进两个电极槽里放入操作缓冲液，分别插入毛细管的进口端与出口端以及铂电极，铂电极接至直流高压电源，正口端与出口端以及铂电极，铂电极接至直流高压电源，正负极可切换。多种型号的仪器将样品瓶同时用做电极槽。负极可切换。多种型号的仪器将样品瓶同时用做电极槽。4.4.冲洗进样系统冲洗进样系统u 每次进样之前毛细管要用不同的溶液冲洗，选用自动冲洗进样仪每次进样之前毛细管要用不同的溶液冲洗，选用自动冲洗进样仪器较为方便。进样方法有压力进样、负压进样、虹吸进样和电动进器较为方便。进样方法有压力进样、负压进样、虹吸进样和电动进样等。进样时通过控制压力、电压或时间来控制进样量。样等。进样时通过控制压力、电压或时间来控制进样量。5.5.检测器检测器 紫外检测器，荧光检测器，电化学检测器，质谱仪等均可作为紫外检测器，荧光检测器，电化学检测器，质谱仪等均可作为CECE的检测器。其中紫外检测器应用最广，它是将毛细管接近出口端的外的检测器。其中紫外检测器应用最广，它是将毛细管接近出口端的外层聚合物剥去约层聚合物剥去约2mm2mm一段，使石英管壁裸露，毛细管两侧各放置一一段，使石英管壁裸露，毛细管两侧各放置一个石英聚光球，使光源聚焦在毛细管上，透过毛细管到达光电池对溶个石英聚光球，使光源聚焦在毛细管上，透过毛细管到达光电池对溶质进行检测。质进行检测。1.检测窗口2.毛细管3.基座4.调焦机构5.圆形狭缝6.狭缝7.球透镜photo冲洗装置样品瓶毛细管UVD电极槽电极槽6.数据处理系统与一般色谱数据处理系统基本相同。三、基本操作三、基本操作（一）准备工作（一）准备工作 1.按照仪器操作手册开机，预热，输入各项参数，如毛细管按照仪器操作手册开机，预热，输入各项参数，如毛细管温度、操作电压、检测波长、冲洗程序等。温度、操作电压、检测波长、冲洗程序等。2.按照各品种项下的规定配制操作缓冲液。操作缓冲液按照各品种项下的规定配制操作缓冲液。操作缓冲液须过滤和脱气。冲洗液、缓冲液等放置于样品瓶中，依次放入进须过滤和脱气。冲洗液、缓冲液等放置于样品瓶中，依次放入进样器。操作缓冲液的种类、样器。操作缓冲液的种类、pH值和浓度，以及添加剂（用以增加值和浓度，以及添加剂（用以增加溶质的溶解度和溶质的溶解度和/或控制溶质的解离度，手性拆分等）的选定对测或控制溶质的解离度，手性拆分等）的选定对测定结果的影响很大，应根据初试的结进行果调整、优化。定结果的影响很大，应根据初试的结进行果调整、优化。四、系统适用性试验四、系统适用性试验u 目的在于考察所配置的毛细管分析系统和设定的参数是否适用。目的在于考察所配置的毛细管分析系统和设定的参数是否适用。u测试项目和方法与高效液相色谱法或气相色谱法相同，相关的计算测试项目和方法与高效液相色谱法或气相色谱法相同，相关的计算式和要求也相同。如重复性（相对标准偏差式和要求也相同。如重复性（相对标准偏差 RSD）、容量因子）、容量因子（k）、毛细管理论数（）、毛细管理论数（n）、分离度（）、分离度（R）、拖尾因子（）、拖尾因子（T）、）、线性范围、最低检测限（线性范围、最低检测限（LOD）等，最低定量限（）等，最低定量限（LOQ）等，可参）等，可参照测定。照测定。具体指标应符合各品种项下的规定。特别是进样精度，具体指标应符合各品种项下的规定。特别是进样精度，不同荷电溶质迁移速度的差异对分析精密度的影响。不同荷电溶质迁移速度的差异对分析精密度的影响。（二）毛细管的处理（二）毛细管的处理u毛细管处理的好坏对测定结果影响很大。毛细管处理的好坏对测定结果影响很大。u 未涂层新毛细管要用较浓碱液在较高温度（例如未涂层新毛细管要用较浓碱液在较高温度（例如1mol/L氢氧化氢氧化钠液在钠液在60）冲洗，使毛细管内壁生成）冲洗，使毛细管内壁生成硅羟基硅羟基，再依次，再依次0.1mol/L氢氧化钠，水，操作缓冲液冲洗分数分钟。两次进样中间可仅用氢氧化钠，水，操作缓冲液冲洗分数分钟。两次进样中间可仅用缓冲液冲洗，但若发现分离性能改变，则开始用缓冲液冲洗，但若发现分离性能改变，则开始用0.1mol/L氢氧化氢氧化钠冲洗，甚至要用浓氢氧化钠液升温冲洗。钠冲洗，甚至要用浓氢氧化钠液升温冲洗。u 凝胶毛细管，涂层毛细管，填充毛细管的冲洗则应按照所附说凝胶毛细管，涂层毛细管，填充毛细管的冲洗则应按照所附说明操作。明操作。u 冲洗时将盛溶液样品瓶依次置于进样器，设定顺序和时间进行。冲洗时将盛溶液样品瓶依次置于进样器，设定顺序和时间进行。（三）进样测试（三）进样测试u 将待测样品溶液瓶置于进样器中，设定操作参数，如将待测样品溶液瓶置于进样器中，设定操作参数，如进样压力（电动进样电压）、进样时间、正极端或负极进样压力（电动进样电压）、进样时间、正极端或负极端进样、操作电压或电流、检测器参数等，开始分析。端进样、操作电压或电流、检测器参数等，开始分析。根据初试的电泳谱图调整仪器和操作缓冲液以获得优化根据初试的电泳谱图调整仪器和操作缓冲液以获得优化结果。而后用优化条件正式分析。结果。而后用优化条件正式分析。（四）数据处理（四）数据处理 有关有关CE的计算方法、公式等可参照中国药典高的计算方法、公式等可参照中国药典高效液相色谱法的有关规定，将保留时间（效液相色谱法的有关规定，将保留时间（tR R）改为）改为迁移迁移时间时间(tm m)即可。即可。（五）结束工作（五）结束工作 分析完成后用水冲洗毛细管，注意将毛细管两端分析完成后用水冲洗毛细管，注意将毛细管两端浸入水中保存，如果长久不用应将毛细管用氮吹干，浸入水中保存，如果长久不用应将毛细管用氮吹干，最后关机。最后关机。（六）注意事项（六）注意事项u由于进样方法的限制，目前毛细管电泳的精密度比用定量阀由于进样方法的限制，目前毛细管电泳的精密度比用定量阀进样的高效液相色谱法差，故进样的高效液相色谱法差，故定量测定定量测定以采用以采用内标法内标法为宜。为宜。u 用加压或减压法进样时，样品溶液黏度会影响进样体积，应用加压或减压法进样时，样品溶液黏度会影响进样体积，应注意保持试样溶液和对照品溶液黏度一致；注意保持试样溶液和对照品溶液黏度一致；u 用电动法进样时，被测组分因电荷不同的电歧视现象和溶液用电动法进样时，被测组分因电荷不同的电歧视现象和溶液离子强度会影响待测组分的迁移量，也要注意其影响。离子强度会影响待测组分的迁移量，也要注意其影响。五、应用实例五、应用实例山茱萸及六味地黄丸中没食子酸的含量测定山茱萸及六味地黄丸中没食子酸的含量测定u 没食子酸为中药山茱萸的有效成分，山茱萸为六味地黄丸没食子酸为中药山茱萸的有效成分，山茱萸为六味地黄丸药味之一。没食子酸在碱水中可电离成阴离子，故本法采用药味之一。没食子酸在碱水中可电离成阴离子，故本法采用毛细管区带电泳法（毛细管区带电泳法（CZE），肉桂酸为内标物，测定二者中），肉桂酸为内标物，测定二者中没食子酸的含量，以控制其质量。没食子酸的含量，以控制其质量。没食子酸肉桂酸（一）仪器与试剂（一）仪器与试剂u Unimicro毛细管电泳仪；毛细管毛细管电泳仪；毛细管60cm（有效长度（有效长度45cm）75m；没食子酸对照品，肉桂酸对照品，；没食子酸对照品，肉桂酸对照品，95%乙醇，乙醇，硼砂（分析纯），去离子水，市售山茱萸，硼砂（分析纯），去离子水，市售山茱萸，六味地黄丸（水蜜丸）六味地黄丸（水蜜丸）（二）实验条件（二）实验条件u 操作缓冲溶液为操作缓冲溶液为20mmol/L硼砂溶液，检测波长硼砂溶液，检测波长271nm，重力进样，重力进样（10cm5s），工作电压工作电压20kV，电泳温电泳温度度20，每次运行前依次用，每次运行前依次用0.1mol/L氢氧化钠溶液、去氢氧化钠溶液、去离子水、操作缓冲溶液冲洗离子水、操作缓冲溶液冲洗3min。（三）测试溶液的制备（三）测试溶液的制备u对照品溶液的制备对照品溶液的制备 精密称取没食子酸对照品精密称取没食子酸对照品19.5mg19.5mg于于25ml25ml量瓶中，用量瓶中，用95%95%乙醇溶解并稀释至刻度，作为对照品溶液；称取肉桂酸对照品乙醇溶解并稀释至刻度，作为对照品溶液；称取肉桂酸对照品9.6mg9.6mg，用，用95%95%乙醇溶解并稀释至乙醇溶解并稀释至25ml25ml，作为内标溶液。，作为内标溶液。u山茱萸供试品溶液的制备山茱萸供试品溶液的制备 将山茱萸药材剪碎，称取将山茱萸药材剪碎，称取5g5g，加，加95%95%乙醇乙醇50ml50ml，浸泡，浸泡1212小时，加热回流提取小时，加热回流提取2 2小时，过滤，滤渣重复提取小时，过滤，滤渣重复提取2 2次，合并提次，合并提取液，减压浓缩至取液，减压浓缩至10ml10ml，移至，移至50ml50ml量瓶中，加量瓶中，加95%95%乙醇稀释至刻度，摇匀，乙醇稀释至刻度，摇匀，精密量取精密量取2ml2ml并加入内标溶液并加入内标溶液1ml1ml，95%95%乙醇稀释定容至乙醇稀释定容至5ml5ml，摇匀，即得。，摇匀，即得。u六味地黄丸供试品溶液的制备六味地黄丸供试品溶液的制备 取六味地黄丸粉碎后，称取取六味地黄丸粉碎后，称取5g5g，提取方，提取方法同山茱萸药材，减压浓至法同山茱萸药材，减压浓至10ml10ml，以下操作同山茱萸供试品溶液的制备，以下操作同山茱萸供试品溶液的制备，即得。即得。（四）系统适用性试验（四）系统适用性试验 在山茱萸的测定中，没食子酸的理论板数在山茱萸的测定中，没食子酸的理论板数n=179820，在，在六味地黄丸的测定中，没食子酸的理论板数六味地黄丸的测定中，没食子酸的理论板数n=167388，没食子酸与周围组分分离良好，无干扰组分存在。下图没食子酸与周围组分分离良好，无干扰组分存在。下图为山茱萸、六味地黄丸样品和对照品的电泳图谱。为山茱萸、六味地黄丸样品和对照品的电泳图谱。山茱萸山茱萸（A）、六味地黄丸六味地黄丸（B）和对照品和对照品（C）的的电泳图谱电泳图谱 （1.肉桂酸；肉桂酸；2.没食子酸）没食子酸）（五）方法学考察（五）方法学考察u线性范围线性范围 精密量取没食子酸对照品溶液精密量取没食子酸对照品溶液0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、2.0ml于于5ml量瓶中，各加入肉桂酸内标量瓶中，各加入肉桂酸内标液液1ml，95%乙醇定容至刻度，以没食子酸对照品峰面积与内标乙醇定容至刻度，以没食子酸对照品峰面积与内标物峰面积的比值对其质量浓度作图，其线性回归方程为物峰面积的比值对其质量浓度作图，其线性回归方程为 Y=0.0167X+0.1333，相关系数，相关系数r=0.9993（n=7）。u 精密度精密度 山茱萸和六味地黄丸峰面积的山茱萸和六味地黄丸峰面积的RSD分别为分别为2.9%和和2.1%（n=5）u准确度准确度 山茱萸和六味地黄丸加样回收率分别为山茱萸和六味地黄丸加样回收率分别为97.4%98.6%和和99.3%102.4%。（六）样品中没食子酸的含量测定（六）样品中没食子酸的含量测定u 取山茱萸供试品溶液和六味地黄丸供试品溶液分别取山茱萸供试品溶液和六味地黄丸供试品溶液分别测定，山茱萸中没食子酸含量为测定，山茱萸中没食子酸含量为0.225%；六味地黄；六味地黄丸中没食子酸的含量为丸中没食子酸的含量为0.055%。第二节 超临界流体色谱法u超临界流体色谱超临界流体色谱(supercrical fluid chromatography,SFC)是以超临界流体作为流动是以超临界流体作为流动相的色谱方法，是相的色谱方法，是20世纪世纪80年代以来发展迅速的年代以来发展迅速的一个色谱分支。一个色谱分支。u所谓超临界流体，是指在高于临界压力和临界温所谓超临界流体，是指在高于临界压力和临界温度时的一种物质状态。它既不是气体，也不是液度时的一种物质状态。它既不是气体，也不是液体，但它兼有气体的低粘度、液体的高密度以及体，但它兼有气体的低粘度、液体的高密度以及介于气、液之间较高的扩散系数等特性。介于气、液之间较高的扩散系数等特性。一、超临界流体色谱的特点与原理一、超临界流体色谱的特点与原理一、超临界流体色谱的特点与原理一、超临界流体色谱的特点与原理principle and character of supercritical fluid principle and character of supercritical fluid chromatographychromatography1超临界流体的特性。超临界流体的特性。对于某些纯物质来说，具有三相点对于某些纯物质来说，具有三相点和临界点，如图所示，从图中可以和临界点，如图所示，从图中可以看出，物质在三相点，气、液、固看出，物质在三相点，气、液、固三态处于平衡状态，当处于临界温三态处于平衡状态，当处于临界温度和临界压力以上时，则不论施加度和临界压力以上时，则不论施加多大压力，气体也不会液化，此时多大压力，气体也不会液化，此时即非气体，也非液体，而是以超临即非气体，也非液体，而是以超临界流体形式存在。界流体形式存在。超临界流体对于分离具有极其有用的物理性质，这些性超临界流体对于分离具有极其有用的物理性质，这些性质恰好介于气体和液体之间。表对气体、液体、和超临界质恰好介于气体和液体之间。表对气体、液体、和超临界流体的有关物理性质进行了比较。流体的有关物理性质进行了比较。表表 气体、液体、超临界流体物理性质的比较气体、液体、超临界流体物理性质的比较流动相流动相密度（密度（g/mlg/ml）扩散系数扩散系数（cmcm2 2/s/s）粘度粘度（g/cm.sg/cm.s）气体气体超临界流超临界流体体液体液体约约1010-3-30.2-0.90.2-0.90.8-1.00.8-1.01-101-10-2-21010-3-3-10-10-4-41010-5-51010-4-41010-4-4-10-10-3-31010-2-22.原理原理 SFC的流动相的流动相：超临界流体；：超临界流体；CO2、N2O、NH3 SFC的固定相的固定相：固体吸附剂（硅胶）或键合到载体（或毛：固体吸附剂（硅胶）或键合到载体（或毛细管壁）上的高聚物；可使用液相色谱的柱填料。填充柱细管壁）上的高聚物；可使用液相色谱的柱填料。填充柱SFC和毛细管柱和毛细管柱SFC；分离机理：吸附与脱附。组分在两相间的分配系数不同而分离机理：吸附与脱附。组分在两相间的分配系数不同而被分离；被分离；通过调节流动相的压力（调节流动相的密度），调整组分通过调节流动相的压力（调节流动相的密度），调整组分保留值；保留值；压力效应：压力效应：SFCSFC的柱压降大（比毛细管色谱大的柱压降大（比毛细管色谱大3030倍），对分离有影响倍），对分离有影响（柱前端与柱尾端分配系数相差很大，产生压力效应）；（柱前端与柱尾端分配系数相差很大，产生压力效应）；超临界流体的密度受压力在临界压力处最大，超过该点，超临界流体的密度受压力在临界压力处最大，超过该点，影响小，超过临界压力影响小，超过临界压力20%20%，柱压降对分离的影响小；，柱压降对分离的影响小；压力效应：在压力效应：在SFCSFC中，压力变化对容量因子产生显著影响，中，压力变化对容量因子产生显著影响，超流体的密度随压力增加而增加，密度增加提高溶剂效率，超流体的密度随压力增加而增加，密度增加提高溶剂效率，淋洗时间缩短。淋洗时间缩短。CO CO2 2流动相，当压力改变：流动相，当压力改变：7.09.0107.09.0106 6 PaPa，则：，则：C C1616H H3434的保留时间的保留时间 25min 5min 25min 5min。程序升压HPLC与SFC比较u与GC法和HPLC法比较,因超临界流体的粘度接近于气相色谱的流动相,对溶质的传质阻力小，可以使用更高的流速洗脱，因此SFC的分离速度快于HPLC而与GC相当；超临界流体的扩散率介于GC和LC之间，因而峰展宽小于在气体中。uSFC中的流动相不是惰性的传输介质，这不同于GC而与LC一样，溶质与流动相间有相互作用，利用此点可调控选择因子u当考虑溶质分压时，也可利用SFC的两重性，即被测物质在超临界流体中的溶解性非常接近其挥发性，而发生温度却较低，因此，在一定压力下，超临界流体溶解的分子的分压比在气体中高几个数量级，这就可以实现对大分子、热不稳定性化合物、高聚物等的有效分离。二、超临界流体色谱仪的结构与流程（SFC）1.1.结构流程结构流程 2.主要部件（1）SFC的高压泵 无脉冲的注射泵；通过电子压力传感器和流量检测器，计算机控制流动相的密度和流量；（2）SFC的色谱柱和固定相 可以采用液相色谱柱和交联毛细管柱；SFC的固定相：固体吸附剂（硅胶）或键合到载体（或毛细管壁）上的高聚物；专用的毛细管柱SFC；色谱柱色谱柱填充柱填充柱填充柱与填充柱与HPLCHPLC柱相似，基于分配平衡实现分离，柱长可达柱相似，基于分配平衡实现分离，柱长可达25cm25cm，分离柱内径，分离柱内径0.5-4.6mm0.5-4.6mm。使用粒径为。使用粒径为3-10m3-10m的填料填的填料填充。如硅胶、充。如硅胶、-NH2-NH2、-CN-CN及及C18C18、C8C8等化学键合相均可用于等化学键合相均可用于SFCSFC。其中以极性填料的分离效果更好。其中以极性填料的分离效果更好。SFCSFC在手性化合物的在手性化合物的分离上效果优于分离上效果优于HPLCHPLC。在实际操作中，往往会因压力变化而产生较大的柱压降，使在实际操作中，往往会因压力变化而产生较大的柱压降，使柱入、出口处的保留时间有很大差异，所以一般采用高于超柱入、出口处的保留时间有很大差异，所以一般采用高于超临界压力临界压力20%20%左右的压力以减小影响。在填料的选择上也要左右的压力以减小影响。在填料的选择上也要注意与所分析的样品相适应，如分析极性或碱性化合物时，注意与所分析的样品相适应，如分析极性或碱性化合物时，填料覆盖度小，会产生不对称峰。若使用填料覆盖度小，会产生不对称峰。若使用“封端封端”填料则会填料则会得到改善。得到改善。填充柱在重现性、载样量等方面要优于毛细管柱，填充柱在重现性、载样量等方面要优于毛细管柱，操作简便，也有用微填充柱的，将操作简便，也有用微填充柱的，将3-10m3-10m的填料填的填料填充到内径几个毫米或更小的毛细管柱中。充到内径几个毫米或更小的毛细管柱中。毛细管柱毛细管柱较长用的填充毛细管柱内径较长用的填充毛细管柱内径0.5mm0.5mm，柱长为，柱长为10-10-30mm30mm；开管毛细管柱主要是内径为；开管毛细管柱主要是内径为50-100m50-100m化学交化学交连的各种硅氧烷柱或其它类型的交连柱。连的各种硅氧烷柱或其它类型的交连柱。SFCSFC色谱柱必须借助柱箱以实现精确的温度控制，范色谱柱必须借助柱箱以实现精确的温度控制，范围可以从室温至围可以从室温至450C450C，同时配低温控制系统，可，同时配低温控制系统，可在在-50-50以下工作。以下工作。主要部件（3 3）流动相）流动相 SFC SFC的流动相：超临界流体；的流动相：超临界流体；COCO2 2、N N2 2O O、NHNH3 3 CO CO2 2应用最广泛；无色、无味、无毒、易得、对各类有机应用最广泛；无色、无味、无毒、易得、对各类有机物溶解性好，在紫外光区无吸收；缺点：极性太弱；加少量甲物溶解性好，在紫外光区无吸收；缺点：极性太弱；加少量甲醇等改性；醇等改性；（4 4）检测器）检测器 可采用液相色谱检测器，也可采用气相色谱的可采用液相色谱检测器，也可采用气相色谱的FIDFID检测器检测器使用气相色谱检测器，以FID为多用，应用时可将色谱柱的流出物分流，部分流出物通过限流器变为气态进入检测器，若用FID检测时，流动相中不能加入改进剂，否则改进剂本身将给出信号干扰测定，FID对小分子量化合物可得到很好的结果，对分子量大的化合物常得不到单峰，而是一簇峰。如把检测器加热可使分子量大于2000的化合物获得满意的分离。在SFC中也可以使用氮磷检测器（NPD）、火焰光度检测器（FPD）等。使用液相色谱检测器。在进入检测器之前应将超临界状态转为液态，可增加检测的灵敏度，使谱带变窄，而且可以在室温下操作，UVD是用改性剂流动相的填充柱SFC的最常用的检测方法。要求检测器必须耐高压。如使用毛细管柱，UVD的流通池可由一段熔融石英毛细管构成，内容积在200nl左右，这样不会影响柱效；荧光检测器（FD）也可以如此应用。对于填充柱，蒸发光散射检测器也是一种常用的通用检测器。三、超临界流体色谱的流动相和改性剂三、超临界流体色谱的流动相和改性剂（一）流动相（一）流动相SFCSFC的流动相为超临界流体。超临界流体的主要特点是在不的流动相为超临界流体。超临界流体的主要特点是在不同压力下对各种样品有不同的溶解能力。其溶解度随超临界同压力下对各种样品有不同的溶解能力。其溶解度随超临界流体密度的增加而增加。当两组分的溶解度常数越接近时，流体密度的增加而增加。当两组分的溶解度常数越接近时，其互溶性就越好。有人研究认为，几种常用的超临界流体的其互溶性就越好。有人研究认为，几种常用的超临界流体的溶解能力在相同的压力条件下顺序是乙烷溶解能力在相同的压力条件下顺序是乙烷 二氧化碳二氧化碳 氧化亚氧化亚氮氮 三氟甲烷，在相同条件下其分离能力是：二氧化碳三氟甲烷，在相同条件下其分离能力是：二氧化碳氧化亚氮三氟甲烷氧化亚氮三氟甲烷乙烷。乙烷。对于对于SFCSFC流动相的选择应综合考虑。除溶解性能外，还要与流动相的选择应综合考虑。除溶解性能外，还要与检测器相适应，检测器相适应，CO2CO2是最常用的流动相。其临界温度低、压是最常用的流动相。其临界温度低、压力适中，容易操作，相对便宜，无毒无嗅，安全性好，且在力适中，容易操作，相对便宜，无毒无嗅，安全性好，且在190nm190nm以上无紫外吸收。以上无紫外吸收。在在SFC中，弱极性或非极性超临界流体流动相如中，弱极性或非极性超临界流体流动相如CO2，对于一些极性化合物的溶解能力较差。为了加强其对极性对于一些极性化合物的溶解能力较差。为了加强其对极性溶质的溶解和洗脱能力，常常向其中加入一定比例的极性溶质的溶解和洗脱能力，常常向其中加入一定比例的极性溶剂称为改性剂，加入的量一般为溶剂称为改性剂，加入的量一般为1%-5%，以甲醇最常用，以甲醇最常用，其次是其他脂肪醇，表中列出了部分适于二氧化碳的改性其次是其他脂肪醇，表中列出了部分适于二氧化碳的改性剂及应用特性。剂及应用特性。（二）改性剂（二）改性剂 表 常用CO2改性剂CO2改性剂检测方法CO2改性剂检测方法甲醇UVD MS FIDC（用量应少于1%）脂肪二甲基亚砜乙二氧甲烷UVUV UV MSUV MS脂肪醇UV MS甲醇UV MS FID四氢呋喃UV MS 二氧化碳UV MS FID2-基乙醇UV 水UV MS FID在分离酸性或碱性化合物时，也可以向在分离酸性或碱性化合物时，也可以向CO2CO2流动相中加入酸或碱，使其峰形变锐。流动相中加入酸或碱，使其峰形变锐。四、应用与示例四、应用与示例超临界流体色谱法已被广泛应用于天然物，药物，表面超临界流体色谱法已被广泛应用于天然物，药物，表面活性剂，高聚物，农药，炸药，火箭推进剂等物质的分离活性剂，高聚物，农药，炸药，火箭推进剂等物质的分离与分析与分析.1.1.超临界流体色谱法测定怀牛膝制剂中齐墩果酸的含量超临界流体色谱法测定怀牛膝制剂中齐墩果酸的含量牛膝制剂中含有的齐墩果酸不易挥发，且含有羟基、羟基等相性牛膝制剂中含有的齐墩果酸不易挥发，且含有羟基、羟基等相性基团，用基团，用GCGC法测定须衍生化处理后，才能测定，又因其结构中无发法测定须衍生化处理后，才能测定，又因其结构中无发色团，本自无紫外吸收，也不易被激发产生荧光，若用色团，本自无紫外吸收，也不易被激发产生荧光，若用HJPLCHJPLC测定无测定无法用常规检测器检测，而用法用常规检测器检测，而用SFCSFC可直接进样测定，由于可直接进样测定，由于SFCSFC对对GCGC及及HPLCHPLC的检测器可兼容使用，分辨率也好于的检测器可兼容使用，分辨率也好于HPLCHPLC。色谱条件色谱条件 色谱柱：石英毛细管交联柱（色谱柱：石英毛细管交联柱（10m50Mm10m50Mm，IDID），固定），固定相：相：SB-Cyanopropyl-50SB-Cyanopropyl-50；液膜厚度：；液膜厚度：0.25Mm0.25Mm；流动相：；流动相：CO2CO2（99.995%99.995%）；柱温：）；柱温：9090；检测点：；检测点：FIDFID，325325；压力程序：；压力程序：15.20MPa15.20MPa，保持，保持7min7min后以后以0.81MPa/min0.81MPa/min升至升至20.26MPa,20.26MPa,再以再以1.22MPa/min1.22MPa/min升至升至35.45MPa,35.45MPa,分流进样分流进样2Ml2Ml，分流比，分流比100:15100:15，补充气：，补充气：氮气，纸建氮气，纸建.0.5cm/min.0.5cm/min，衰减，衰减8 8。标准溶液的配制，取齐墩果酸对照品适量，加二氯甲烷溶解，标准溶液的配制，取齐墩果酸对照品适量，加二氯甲烷溶解，并稀释成浓度为并稀释成浓度为1.921mg/ml1.921mg/ml的标准溶液。的标准溶液。标准曲线的绘制标准曲线的绘制 精密量取齐墩果酸标准液精密量取齐墩果酸标准液（1.921mg/ml1.921mg/ml）0.40.4，0.80.8，1.21.2，1.61.6，2.02.0及及2.6ml2.6ml，分别置，分别置平底烧瓶中，挥去二氯甲烷后，各加平底烧瓶中，挥去二氯甲烷后，各加2mol/L2mol/L盐酸盐酸20ml 20ml 后按后