微生物的遗传变异和育种22146.pptx

第八章 微生物的遗传变异和育种第一节 遗传变异的概念及物质基础 第二节 基因突变与基因重组第三节 微生物育种第四节 基因工程第五节 菌种保藏 第八章 微生物的遗传变异和育种n生物体最本质的属性之一。n遗传，讲的是亲子间的关系，指生物的上一代将自己的一整套遗传因子传递给下一代的行为或功能，它具有极其稳定的特性。n变异：指生物体遗传物质结构或数量的改变，即遗传型的改变。微生物与遗传学研究：n个体结构简单；营养体多为单倍体；易于在成分简单的合成培养基上生长繁殖；繁殖速度快；易于累积不同的最终代谢产物及中间代谢物；菌落形态特征的可见性与多样性；环境条件对各个体作用具有直接性和均一性；易于形成营养缺陷型；一般都有相应的病毒；存在多种处于进化过程中的原始有性生殖方式等。n研究现代遗传学和重要的生物学基本理论问题，微生物是最佳材料和研究对象。第一节 遗传变异的概念及物质基础n一、基本概念n（一）、遗传型、基因型：某一生物个体所含有的全部遗传因子（基因的总和）。n具有某遗传型的生物只有在适当的环境条件下，通过自身的代谢和发育，才能将它具体化，即产生表型。n-代谢-遗传型+环境条件-表型-发育-一、基本概念n（二）、表型：某一生物体所具有的一切外表特征及内在特性的总和，是遗传型在合适环境下的具体体现。n表型是一种现实性。一、基本概念n（三）、变异：在某种外因或内因的作用下，生物体遗传物质结构或数量的改变，即遗传型的改变。n变异特点：在群体中以极低的几率(一般为10-510-10)出现；性状变化的幅度大；变化后的新性状是稳定和可遗传的。一、基本概念n（四）、饰变：不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、翻译水平上的表型变化。n饰变特点：整个群体中每一个体都发生同样变化；性状变化的幅度小；饰变性状不遗传。n例如，粘质沙雷氏菌25培养，产生深红色灵杆菌素，把菌落染成鲜血似的(因此过去称它为“神灵色杆菌”或“灵杆菌”)；37时，群体中所有个体都不产色素。重新降温至25，所有细胞产色素能力又可以恢复。二、证明核酸是遗传变异物质的经典实验n（一）、转化实验 n（二）、噬菌体感染实验 n（三）、植物病毒的重建实验（一）转化实验n英，F.Griffith，1928年研究肺炎链（双）球菌发现转变现象。n肺炎链（双）球菌，球菌，成双或成链，致人肺炎、小鼠败血症。有许多不同菌株，有荚膜者具致病性，菌落表面光滑，称S型；有的不形成荚膜，无致病性，菌落外观粗糙，称R型。F.Griffith的三组试验：n1、动物试验：小白鼠体内加入活R菌或死S菌，小白鼠活；小白鼠体内加入活S菌，小白鼠死；小白鼠体内加入活R菌和热死S菌，小白鼠死，抽心血分离，发现有活的S型细胞转化现象。n2、细菌培养试验：热死S菌在培养皿中培养，不生长；活R菌在培养皿中培养，长出R菌；热死S菌和活R菌在培养皿中培养，长出大量R菌和10-6S菌。n3、S型菌无细胞抽提液试验：活R菌加S菌的无细胞抽提液，在培养皿中培养，长出大量的R菌和少量的S菌。(a)无毒菌系RII不使白鼠死亡，从鼠体内分离仍得无毒细菌；(b)将SIII加热杀死，不使白鼠死亡，鼠体内无有毒细菌；(c)混合活RII和加热杀死的SIII，使白鼠死亡，并在死鼠体内发现活的SIII细胞（一）转化实验n以上实验说明，加热杀死的S型细菌，在其细胞内可能存在一种转化物质，它能通过某种方式进入R型细胞，并使R型细胞获得稳定的遗传性状。（一）转化实验n1944年，美Avery等进行了离体条件转化实验。n1、从活S菌分离提纯各种细胞成分DNA，RNA，蛋白质，荚膜多糖等。n2、将各组分逐个与活R菌混合（加S菌的DNA；加S菌的DNA及DNA酶以外的酶；加S菌的DNA和DNA酶(分解DNA)；加S菌的RNA；加S菌的蛋白质；加S菌的荚膜多糖），体外培养。n3、结果：、长出S菌；、只长R菌。自SIII抽提的DNA与活R菌系细菌混合，少数R细胞转化成S细胞。加脱氧核糖核酸酶(DNase)可阻止转化作用（一）转化实验n上述结果说明：nS菌DNA将R型转化为S型。nDNA纯度越高，转化效率越高。微量纯DNA(610-8g)，仍有转化能力。nS菌转移给R菌的，不是某一遗传性状(如荚膜多糖)本身，而是以DNA为物质基础的遗传信息。（二）噬菌体感染实验n1952，A.Hershey等利用示踪元素，证明DNA是噬菌体遗传物质。n以放射性32PO3-4或35SO2-4作为磷源或硫源培养E.coli，让T2噬菌体（只有核酸和蛋白质）感染E.coli，获得含32P-DNA核心的噬菌体或含35S-蛋白质外壳的噬菌体。n将32P-DNA噬菌体、35S-蛋白质外壳噬菌体分别感染无放射性的E.coli，搅拌离心，观察。发现DNA是噬菌体遗传物质。n用含32PDNA(核心)的噬菌体作感染实验用含35S蛋白质(外壳)的噬菌体作感染实验（三）植物病毒的重建实验：n1956，美H.Fraenkel-Conrat，TMV（RNA）和HRV（与TMV近缘的霍氏车前花叶病毒）。n将TMV放在一定浓度的苯酚溶液中振荡,使蛋白质外壳与RNA分离。n分离的RNA能感染烟草患典型症状,病斑中能分离出正常病毒粒子。nRNA裸露，缺乏蛋白质衣壳保护，感染频率低于正常TMV粒子的感染频率。TMV重建实验示意图(粗线 箭头表示遗传信息的去向)二、证明核酸是遗传变异物质的经典实验n通过上述三个经典实验，确信无疑地得出结论，只有核酸才是贮存遗传信息的真正物质。三、遗传物质在细胞中的存在方式n（一）、细胞水平：核或核质体n（二）、细胞核水平：核内染色体(核基因组)，核外染色体（真核质粒、质体线粒体、叶绿体；原核质粒：F因子性因子、R因子抗性因子、Col质粒产大肠杆菌素因子、Ti质粒诱癌、巨大质粒固氮、降解性质粒降解复杂物质）n（三）、染色体水平：数目，倍数 n（四）、核酸水平：DNA，RNA三、遗传物质在细胞中的存在方式n（五）、基因水平：具有特定核苷酸顺序的核酸片段，具有自主复制能力的最小遗传功能单位。相对分子量约为6.7105Da，1000-1500bp(碱基对)，每个细菌一般含有5，00010，000个基因。三、遗传物质在细胞中的存在方式n（六）、密码子水平：决定3个核苷酸顺序（AA）的片断，遗传的信息单位。43=642023，出现一种以上密码子编码同一种氨基酸的现象。有些被用作“起读”(AUG)或“终止”信号(UAA、UGA和UAG)。n（七）、核苷酸、碱基水平：最低突变单位或交换单位（A、G、T、C）。三、遗传物质在细胞中的存在方式n原核生物的基因调控系统是由操纵子（启动基因、操纵基因、结构基因）和调节基因组成。n结构基因决定多肽(酶及结构蛋白)的合成，操纵基因与结构基因紧密连锁在一起的，控制结构基因转录的开放或关闭。启动基因是转录起始部位。n调节基因一般与操纵子有一定间隔距离(一般小于100个碱基)，调节结构基因的活动。三、遗传物质在细胞中的存在方式n顺序：启动基因操纵基因结构基调节基因n关闭转录：调节基因转录出自己的mRNA,经翻译产生阻遏蛋白,识别并附着在操纵基因上，相互作用使DNA双链无法分开，阻挡RNA聚合酶沿着结构基因移动。n启动转录：阻遏蛋白从操纵基因上解除；依赖于DNA的RNA多聚酶附着在启动基因上，通过操纵基因，沿着结构基因移动，转录mRNA。三、遗传物质在细胞中的存在方式n真核生物的基因：没有操纵子结构，存在不编码序列和重复序列，转录与翻译有空间分隔，基因之间被许多无编码功能的内含子阻隔。四、原核生物的质粒ncccDNA：游离于染色体外，具有独立复制能力的小型共价闭合环状DNA分子。1984，天蓝色链霉菌等，发现线形质粒。n某些质粒具有与核染色体整合和脱离的功能，如F因子，称“附加体”。n分子量一般在106108Da，大小约为1%核基因组。携带染色体上没有的基因，赋予某些特殊功能，例如接合、产毒、抗药、固氮、产特殊酶或降解有毒物质等。n质粒消失不会造成菌体死亡。四、原核生物的质粒n质粒复制与核染色体同步，称“严紧型复制控制”，细胞一般含12个质粒；不同步，称“松弛型复制控制”，一般含1015个或更多。n质粒之间及质粒与核染色体之间可以发生重组。n少数质粒可以在不同菌株间发生转移，如F、R等。n遇吖啶类染料、丝裂霉素C、紫外线、利福平、重金属离子或高温等因素，可使子代细胞中质粒消失。四、原核生物的质粒n（一）、F因子、致育因子或性因子：E.coli等细菌中决定性别。约等于2%核染色体DNA的小型cccDNA。分子量为6.2107Da，94.5kb（千碱基对），其中有1/3的基因与接合作用有关。四、原核生物的质粒n（二）、R因子、R质粒：n多数由相连的两个DNA片段组成。其一称RTF质粒(抗性转移因子)，含有调节DNA复制和拷贝数的基因及转移基因，有时还有四环素抗性基因。11106Da。其二为r质粒（抗性决定质粒），几百万至100106Da以上。含其他抗生素的抗性基因，例如抗青霉素、安比西林、氯霉素、链霉素、卡那霉素和磺胺等基因。一种可通过接合而转移的R因子的形成(IS因子是转座因子，可使RTF质粒和r决定质粒结合)四、原核生物的质粒n（三）、Col因子、产大肠杆菌素因子。大肠杆菌素是E.coli某些菌株分泌的细菌毒素，具有通过抑制复制、转录、翻译或能量代谢等，专一地杀死其他肠道细菌的功能。约48104Da。n携带Col因子的菌株，由于质粒本身编码一种免疫蛋白，从而对大肠杆菌素有免疫作用，不受其伤害。四、原核生物的质粒n（四）、Ti质粒、诱癌质粒：大型，长200kb。n根癌土壤杆菌侵入到双子叶植物细胞中，Ti质粒片段与植物细胞核染色体组发生整合，破坏控制细胞分裂的激素调节系统，转变成癌细胞。n植物遗传工程研究的重要载体。外源基因可借DNA重组技术插入到Ti质粒中，进一步整合到植物染色体上，改变遗传性，培育优良品种。四、原核生物的质粒n（五）、巨大质粒：200300106Da，比一般质粒大几十倍至几百倍。n根瘤菌属中发现，具有一系列固氮基因。四、原核生物的质粒n（六）、降解性质粒：可编码降解复杂物质的酶，利用一般细菌难以分解的物质作碳源。如CAM(樟脑)质粒，OCT(辛烷)质粒，XYL(二甲苯)质粒，SAL(水杨酸)质粒，MDL(扁桃酸)质粒，NAP(萘)质粒和TOL(甲苯)质粒等。n仅在假单胞菌属中发现。第二节 基因突变与基因重组 n突变指遗传物质的核苷酸顺序突然发生了稳定的可遗传的变化。n基因重组指把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过重新组合，形成新遗传型个体。属于分子水平杂交。一、基因突变 n（一）、类型 n（二）、特点 n（三）、机制（一）基因突变类型n按内部结构：n1、基因突变（点突变）：一对或少数几对碱基发生改变。n2、染色体畸变：DNA的大段变化(损伤)，表现为插入、缺失、重复、易位和倒位。n按表型特征：n1、形态突变型：细胞或菌落形态改变。n2、生化突变型-代谢途径发生变异而形态没有明显变化。分营养缺陷型、抗性突变型和抗原突变型。（一）基因突变类型nA、营养缺陷型：基因突变引起代谢过程中某种酶的合成能力丧失，必须在原有培养基中添加细胞不能合成的营养成分才能正常生长。nB、抗性突变型：能抵抗有害理化因素，分抗药性、抗紫外线或抗噬菌体等。nC、抗原突变型-细胞成分尤其是细胞表面成分(细胞壁、荚膜、鞭毛)的细微改变而引起抗原性变化。（一）基因突变类型n3、致死突变型-基因突变导致个体死亡。nA、条件致死突变型：突变后，在某种条件下可正常生长、繁殖并实现其表型，而在另一条件下却无法生长、繁殖。例如，E.coli的某些菌株可在37下正常生长，不能在42下生长等。nB、其他突变型：如毒力、糖发酵能力、代谢产物的种类和产量以及对某种药物的依赖性等。（一）基因突变类型n按分离：n1、选择性突变：具有选择性标记，可通过某种环境条件使它们得到优势生长,从而取代原始菌株。如营养缺陷型或抗性突变型等。n2、非选择性突变：没有选择性标记，只有一些性状的数量差别。例如菌落大小、颜色深浅及代谢产物量的多少等。（二）基因突变特点n1、不对应性-突变性状与原因无直接对应关系。n2、自发性-没有人为诱变因素，自发产生。n3、稀有性-自变频率低且稳定，多为10-610-9。n4、独立性-某一群体中，可发生抗青霉素的突变型，也可发生抗链霉素或任何其他药物的抗药性。某一基因的突变，不影响其他基因的突变率。突变对某一细胞是随机的，对某一基因也是随机的。（二）基因突变特点n5、诱变性-诱变剂可提高自变频率10105倍。n6、稳定性-遗传结构突变，新性状稳定遗传。n7、可逆性-由原始野生型基因变异为突变型基因的过程称为正向突变，反之称为回复突变或回变。实验证明，任何性状既有正向突变，也可发生回复突变。（三）基因突变机制n1、诱变机制：显著提高突变频率的理化因子，称为诱变剂。nA、碱基对置换：只涉及一对碱基被另一对碱基所置换，属于微小损伤，又称点突变。分为转换（嘧啶或嘌呤同类更换）、颠换（嘧啶或嘌呤异类更换）。n某一种诱变剂，可同时引起转换与颠换，也可只具一个功能。碱基的置换（实转换、虚颠换）（三）基因突变机制n直接置换诱变：直接与核酸碱基发生化学反应的诱变剂，不论在机体内或在离体条件下均有作用。种类很多，例如亚硝酸、羟胺和各种烷化剂(硫酸二乙酯、甲基磺酸乙脂、N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍、N-甲基-N-亚硝基脲、乙烯亚胺、环氧乙酸、氮芥等)。它们可与一个或几个核苷酸发生化学反应，引起DNA复制时碱基配对的转换，进一步使微生物发生变异。（三）基因突变机制n间接置换诱变：通过活细胞的代谢活动使碱基类似物掺入到DNA分子中引起诱变。如5-溴尿嘧啶(5-BU)、5-氨基尿嘧啶(5-AU)、8-氮鸟嘌呤(8-NG)、2-氨基嘌呤(2-AP)和6-氯嘌呤(6-CP)等。n对休止细胞、游离噬菌体粒子或离体DNA分子不起作用。（三）基因突变机制nB、移码突变：诱变剂使DNA分子中一个或少数几个核苷酸增添(插入)或缺失，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和翻译错误的一类突变。由移码突变所产生的突变株，称为移码突变株。（三）基因突变机制nC、染色体畸变：某些理化因子如X射线及烷化剂、亚硝酸等，引起DNA的大损伤，包括染色体结构的缺失（基因减少）、重复（基因增加）、插入、易位、倒位（基因排列顺序相反）和染色体数目变化。n染色体结构变化，分染色体内畸变和染色体间畸变。前者只涉及一条染色体，后者非同源染色体间的易位。（三）基因突变机制n注意：许多理化诱变剂的诱变作用都不是单一功能的。例如，亚硝酸既能引起碱基对的转换作用，又能诱发染色体畸变；一些电离辐射也可同时引起基因突变和染色体畸变。（三）基因突变机制n2、自发（没有人工参与所发生）突变机制：nA、背景辐射和环境因素的诱变：不少“自发突变”实质上是一些原因不详的低剂量诱变因素长期综合诱变导致。例如，充满宇宙空间的各种短波辐射或高温诱变效应，以及自然界中普遍存在的一些低浓度的诱变物质(在微环境中有时也可能是高浓度)的作用等。（三）基因突变机制nB、自身代谢产物的诱变：过氧化氢是普遍存在于微生物体内的一种代谢产物。对脉孢菌有诱变作用，加入过氧化氢酶可降低这种作用。如果在加入该酶的同时又加入酶抑制剂KCN，则又可提高突变率。说明过氧化氢很可能是“自发突变”中的一种内源性诱变剂。在许多微生物的陈旧培养物中易出现自发突变株，可能也是同样原因。（三）基因突变机制nC、互变异构效应：DNA链中，T以烯醇式出现，复制时，其相对位置不再是A，而是G；C以亚氨基形式出现，就和A配对，使基因发生突变，造成自发突变。碱基对发生自发突变的几率约为10-810-9。（三）基因突变机制nD、环出效应：DNA复制中，如果其中某一单链上偶而产生一个小环，则会因其上的基因越过复制而发生遗传缺失，从而造成自发突变。环出效应设想图：复制时，上链标记B处发生“环出”，只有A及C获得复制，从而发生自发突变。在下链中,复制正常进行。二、基因重组 n（一）、原核微生物的基因重组：n转化、转导、接合、原生质体融合 n（二）、真核微生物的基因重组：n有性杂交、准性生殖-（一）原核微生物基因重组n1、转化与转染：n受体菌直接吸收来自供体菌的DNA片段，通过交换，整合到自己的基因组中，从而获得供体菌的部分遗传性状的现象称转化。n转化后的受体菌，称为转化子。来自供体的DNA片段称为转化因子，一般是双链DNA片段。转化过程示意图 G肺炎双球菌的转化过程 n吸附：双链 DNA片段与感受态（受体菌最易接受外源DNA片段并实现转化的生理状态）受体菌细胞表面的特定位点(主要在新形成细胞壁的赤道区)结合，胆碱可促进这一过程；n酶解：吸附的DNA被核酸内切酶分解，形成平均分子量45106的DNA片段；n进入：一条单链被膜上另一种核酸酶切除，另一条单链耗能后逐步进入细胞。分子量5105的DNA片段不能进入细胞。低浓度溶菌酶处理，提高细胞壁通透性，可提高转化频率；（一）原核微生物基因重组n转化：进入的单链与受体菌染色体组上的同源区段配对，接着受体染色体组的相应单链片段被切除，并被外来的单链DNA所交换和取代，形成杂合DNA区段(它们间的DNA顺序不一定互补，故可呈杂合状态)；n复制：染色体组复制，杂合区段分离成两个，其中之一类似供体菌，另一类似受体菌。细胞分裂后，该染色体发生分离，形成1个转化子。转化中单链外基因组片段与双链内基因组间的交换与整合过程示意图（一）原核微生物基因重组n转染：抽提噬菌体或其他病毒的DNA(或RNA)，感染感受态的宿主细胞，产生正常的噬菌体或病毒后代的现象。n与转化不同之处：病毒或噬菌体并非遗传基因的供体菌，中间也不发生任何遗传因子的交换或整合，最后也不产生具有杂种性质的转化子。（一）原核微生物基因重组n2、转导与溶源转变：n通过缺陷或温和噬菌体的媒介缺陷或温和噬菌体的媒介，把供体细胞的DNA片段携带到受体细胞中，从而使后者获得了前者部分遗传性状的现象。获得新遗传性状的受体细胞，称为转导子。n1952年在鼠伤寒沙门氏杆菌中发现。大肠杆菌、芽孢杆菌属、变形杆菌属、假单胞菌属、志贺氏菌属、葡萄球菌属中均发现。（一）原核微生物基因重组nA、普遍性转导：噬菌体本身DNA没有包进去，形成缺陷型，同时误包供体菌中的任何基因(包括质粒)，使受体菌实现各种性状的转导。n分为完全普遍转导（完全转导）和流产普遍转导（流产转导）。（一）原核微生物基因重组n完全转导：鼠伤寒沙门氏菌野生型菌株作供体菌，营养缺陷型为受体菌，P22 噬菌体作为转导媒介。当P22在供体菌内增殖时，宿主染色体组断裂，待噬菌体成熟之际，极少数(10-610-8)噬菌体衣壳误包与噬菌体DNA相仿的供体菌DNA片段(约1%)，形成完全不含完全不含噬菌体本身DNA的假噬菌体(一种完全缺陷的噬菌体)。供体菌裂解时，如把少量裂解物与大量的受体菌群相混，这种特殊噬菌体将外源DNA片段导入受体菌。（一）原核微生物基因重组n1个完全缺陷的假噬菌体只能感染1个受体细胞，受体细胞不会发生溶原化和裂解。导入的供体DNA片段可与受体染色体组上的同源区段配对，再通过双交换而重组到受体菌染色体上，形成遗传性稳定的转导子。外源染色体片段(双链DNA)通过双交换形成一个稳定的转导子图示（一）原核微生物基因重组n流产转导：在获得供体菌DNA片段的受体菌内，转导DNA不能与受体菌DNA进行重组并复制复制，也不迅速消失，（只是借住而已）仅表现稳定转录、转译、表达的现象。n受体菌进行分裂时，只有一个子细胞获得这段DNA，另一子细胞仅获得供体基因的产物酶，在表型上出现供体菌的某一特征。并且，每经过一次分裂，就受到一次“稀释”。所以，只能在选择性培养基平板上形成一个微小菌落（即其中只有一个细胞是转导子）。流产转导示意图（一）原核微生物基因重组nB、局限转导：通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并获得表达的转导现象。n只能转导供体菌的个别特定基因(一般为噬菌体整合位点两侧的基因)；该特定基因由部分缺陷（与完全缺陷相对而言）的噬菌体携带。n分为低频转导和高频转导。（一）原核微生物基因重组n低频转导(LFT)：用低感染复数的LFT裂解物感染宿主，获得极少量局限转导子的方式。（宿主染色体被不正常切离的频率极低，故只能获得极少量部分缺陷噬菌体，即极少量局限转导子）（一）原核微生物基因重组n当温和噬菌体感染受体菌后，其染色体开环，以线状形式整合到宿主染色体的特定位点上，使宿主细胞发生溶原化。该溶原菌因诱导而发生裂解时，有极少数(10-5)的前噬菌体发生不正常切离，将插入位点两侧之一的少数宿主基因，连接到噬菌体DNA上，噬菌体也将相应的一段DNA遗留在宿主的染色体组上，通过衣壳的“误包”，形成一种特殊的噬菌体（部分）缺陷噬菌体。当它感染宿主并整合在宿主基因组上时，可使宿主细胞成为一个局限转导子，而不是一个溶原菌，不具有对相同温和噬菌体的免疫性。低频转导(LFT)裂解物的形成（一）原核微生物基因重组n高频转导(HFT)：用高感染复数的HFT裂解物感染其它E.coligal-受体菌，高频率地转化为E.coligal+转导子的方式。（一）原核微生物基因重组n用高感染复数的LFT裂解物感染E.coligal-受体菌（不发酵半乳糖的营养缺陷型），凡感染dgal（带供体菌gal基因）噬菌体的细胞，几乎同时感染正常的噬菌体。两种噬菌体同时整合在一个受体菌核染色体组上，受体菌成为双重溶原菌。当双重溶原菌被紫外线等诱导时，正常噬菌体（助体或辅助噬菌体）的基因可补偿dgal 所缺失的部分基因功能，两种噬菌体同时获得复制的机会；裂解物含有等量和dgal 粒子，称HFT裂解物。（一）原核微生物基因重组n-溶原转变：温和噬菌体感染宿主使之溶原化，使宿主获得除免疫性以外的新性状的现象。当宿主丧失这一噬菌体时，通过溶原转变而获得的性状也同时消失。n区别：1、温和噬菌体不携带供体菌基因；2、噬菌体完整，没有缺陷。n典型例子：不产毒白喉棒状杆菌菌株（噬菌体）产白喉毒素。鸭沙门氏菌（15噬菌体）细胞表面多糖结构变化。红霉素链霉菌（P4噬菌体）红霉素生物合成及形成气生菌丝等能力。（一）原核微生物基因重组n3、接合：通过供体菌和受体菌完整细胞间直接接触而传递大段DNA的过程。n细菌以生活在肠道内的大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、赛氏杆菌、弧菌、固氮菌、克氏杆菌和假单胞杆菌等属的一些种最为常见。n放线菌研究得最多的是链霉菌属、诺卡氏菌属等，尤以天蓝色链霉菌最为详细。n接合还可发生在不同属之间，如大肠杆菌与鼠伤寒沙门氏菌或鼠伤寒沙门氏菌与痢疾志贺氏菌之间。研究细菌接合方法的基本原理（一）原核微生物基因重组n大肠杆菌F因子(即致育因子或性质粒)：n独立于染色体外的小型的环状DNA，一般呈超螺旋状态，具有自主的与染色体进行同步复制和转移到其他细胞中去的能力。还带有一些对细胞生命活动关系较小的基因。n分子量5107，DNA含量2%，14个细胞。属于附加体质粒，既可脱离染色体独立存在，也可插入(即整合)到染色体组上；既可经过接合作用而获得，也可通过一些理化因素(如吖啶橙、利福平、环已亚胺和加热等)的处理从细胞中消失。（一）原核微生物基因重组n大肠杆菌的4种类型：nF-(“雌性”)菌株：没有F因子,表面不具性菌毛。nF+(“雄性”)菌株：细胞中存在游离F因子,表面具性菌毛，数目与因子数相同。nHfr(高频重组)菌株：F因子被整合在DNA上。-nF菌株：Hfr的F因子脱离DNA,形成携带一小段(最多可达13)染色体基因的游离F因子,特称F因子。该菌株称为初生F菌株。-（一）原核微生物基因重组n大肠杆菌的接合类型：n1、F+F-：F+通过性菌毛将F因子转移给F-成为F+。nF因子传递“滚环模型”：F因子的一条DNA单链在特定位置上发生断裂；断裂的单链逐渐解开，同时以留下的另一条环状单链作模板，通过模板的旋转，将解开的单链通过性菌毛推入F-中，同时在供体细胞内，重新合成一条新的环状单链，取代解开的单链；F-细胞中，外来DNA单链上也合成一条互补的新DNA链，恢复成环状双链F因子，F-变成了F+。（一）原核微生物基因重组2、FF-初生F菌株与F-菌株接合，使之成为次生F菌株，含有质粒基因和若干原属Hfr菌株的遗传性状。通过质粒来传递供体基因的方式，称为F质粒转导、F因子转导、性导、F质粒媒介转导。（一）原核微生物基因重组n-Hfr与F-：接合时，Hfr染色体在F因子处发生断裂，由环状变成线状，F因子位于最末端。由于种种原因，这种线状染色体在转移过程中经常会发生断裂，越在前端的基因，进入的机会就越多，在F-中出现重组子的时间就越早，频率也高。F因子位于最末端，进入的机会最少，引起性别转化的可能性也最小。因此，Hfr与F-接合的结果重组频率虽高，但却很少出现F+的菌株，大多数情况下，仍是F-。F因子的存在方式及其相互关系（二）真核微生物基因重组n1、有性杂交：指性细胞间的接合和随之发生染色体重组，并产生新遗传型后代的一种方式。能产生有性孢子者，均可采用有性杂交。n2、准性生殖：类似于有性生殖但更为原始的一种生殖方式。可使同一生物的两个不同来源的体细胞经融合后，不通过减数分裂而导致低频率的基因重组。（二）真核微生物基因重组n1、有性杂交n酿酒酵母：将甲、乙两个双倍体亲本，分别接种到产孢培养基(醋酸钠培养基等)斜面上，使其产生子囊，减数分裂，形成4个单倍体子囊孢子。用蒸馏水洗下子囊，经机械法(加硅藻土和石蜡油，在匀浆管中研磨)或酶法(如蜗牛酶)破环子囊，离心，获得子囊孢子，涂布平板，培养，得到单倍体菌落。把两个亲体的不同性别的单倍体细胞密集接触在一起，有机会出现双倍体的杂交后代。双倍体细胞和单倍体细胞有很大不同,易于识别。（二）真核微生物基因重组n2、准性生殖：n菌丝联结：形态没有区别,遗传性上有差别的两个同种亲本的单倍体体细胞间发生菌丝联结。n形成异核体：联结后,原有的两个单倍体核集中到同一个细胞中,形成双相异核体。异核体能独立生活。n核配：异核体中的双核偶尔可以发生核融合,产生双倍体杂合子核。如构巢曲霉、米曲霉核融合频率为10-510-7。某些理化因素如樟脑蒸汽、紫外线或高温等的处理,可以提高频率。（二）真核微生物基因重组n体细胞交换和单倍体化：体细胞交换即体细胞中染色体的交换,也称有丝分裂交换。双倍体杂合子性状极不稳定,在其进行有丝分裂过程中,其中极少数核中的染色体会发生交换和单倍体化,从而形成了极个别具有新性状的单倍体杂合子。如对双倍体杂合子用紫外线、射线等进行处理,就会促进染色体断裂、畸变或导致染色体在两个子细胞中分配不均,因而有可能产生各种不同性状组合的单倍体杂合子。半知菌的准性生殖示意图 第三节 微生物育种n目前，微生物发酵已由野生型菌株发酵向代谢调控发酵转移。n代谢调控发酵：利用遗传学原理和方法，在DNA水平人为地改变和控制微生物代谢，使目的产物大量积累的发酵。n关键之一：选育从遗传角度解除了微生物正常代谢机制的突变株。n方法：主要是诱变、杂交、遗传工程等。一、突变与育种n（一）、自发突变与育种：n1、生产选育：富于实际经验并且善于细致观察的人们在日常生产过程中，发现自然突变，选育优良菌株。n2、定向培育：用某一特定因素长期处理某一微生物培养物，同时不断对它们进行传代，以达到累积并选择相应的自发突变体的一种古老的育种方法。过程十分缓慢，“守株待兔”。一、突变与育种n分离筛选步骤n1、采样（土壤、食品等）n2、增殖培养（数量不足时）n3、纯种分离（稀释、划线、组织分离等）n4、纯培养（扩大）n5、生产性能测定一、突变与育种n（二）、诱变育种：利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的细胞群，大幅度提高突变频率，通过简便、快速和高效的筛选，从中挑选符合育种目的的突变株。n发酵工业和其他微生物生产部门使用的高产菌株，几乎都是通过诱变育种而大大提高了生产性能的。提高产量、改进质量、扩大品种和简化生产工艺等，是使用最广泛的育种手段之一。一、突变与育种n1、诱变育种的基本结果：以高产突变株为例n-诱变出发菌株绝大多数死亡-少数存活-多数未变-多数负变-少数突变-少数正变少数正变-多数幅度小-少数幅度大多数不宜投产n少数适宜投产一、突变与育种n2、诱变育种的基本路线：n 确定出发菌株纯化选优性能测定同步培养制备单细胞（单孢子）悬液活菌浓度测定诱变剂选择与剂量确定预试验诱变处理平板分离计数（变异菌落与突变率）挑取疑似菌落纯培养突变体初筛复筛摇瓶发酵试验选出突变体生产试验或重复诱变处理（详情见教材）一、突变与育种n3、诱变育种的原则：n挑选优良的出发菌株-n处理单孢子(或单细胞)悬液n选择简便有效、最适剂量的诱变剂-一、突变与育种n出发菌株是用于育种的原始菌株。n选用单倍体纯种，排除异核体和异质体影响；n采用优良性状菌株；n选择对诱变剂敏感的菌株，或改变菌株的遗传型，提高菌株敏感性；n高产突变往往需要逐步累积，有必要多选一些经过诱变的菌株为出发菌株，进行多步育种，确保高产菌株的获得。一、突变与育种n诱变育种必须使用均匀状态的单细胞悬液。n诱变剂一般只作用于DNA双链中的某一条单链，因此，处理多核或单核细胞、孢子时，某一突变无法反映在当代的表型上。只有经过DNA复制和细胞分裂，表型才会发生变异，出现不纯菌落，称为“表型延迟”。这是初次分离的菌株经传代后很快出现生产性状“衰退”的主要原因。n诱变霉菌或放线菌稍加萌发的孢子；芽孢杆菌的芽孢(只有一个核质体)；细菌对数期诱变处理效果较好。一、突变与育种n诱变剂主要有物理诱变剂和化学诱变剂。如紫外线、X射线、射线和快中子等；烷化剂、碱基类似物和吖啶类化合物。最常用的烷化剂有N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍(NTG)、甲基磺酸乙酯(EMS)、甲基亚硝基脲(NMU)、硫酸二乙酯(DES)、氮芥、乙烯亚胺和环氧乙烷等。n物理诱变剂剂量：强度时间，紫外线强度单位是尔格，X射线单位是伦琴或拉得等；化学诱变剂剂量：一定温度下诱变剂浓度和处理时间。常采用杀菌率作各种诱变剂的相对剂量。一、突变与育种n诱变剂的作用：提高突变频率；扩大产量变异幅度；使产量变异向正变(提高)或负变(降低)的方向移动。凡在高诱变率的基础上既能扩大变异幅度，又能促使变异移向正变范围的剂量，就是合适的剂量。诱变剂的剂量对产量变异的影响：a.未经诱变剂的处理-b.变异幅度扩大c.正变占优势-d.负变占优势一、突变与育种n确定合适剂量，要多次试验。n正变较多出现在偏低剂量中，负变则相反；经多次诱变而提高产量的菌株，更容易出现负变。n过去用紫外线作诱变剂，常采用杀菌率为99或99.9%的剂量，近年来倾向于采用杀菌率为70%75%，甚至更低(30%70%)的剂量，特别是对于经多次诱变后的高产菌株更是如此。一、突变与育种n诱变剂的复合处理常呈现一定的协同效应。n复合处理的方法：两种或多种诱变剂的先后使用；同一种诱变剂的重复使用；两种或多种诱变剂的同时使用。二、原生质体融合育种n（一）基本原理：将两个亲株细胞壁分别通过酶解作用加以剥除，在高渗环境中释放出只有原生质膜包被着的球状原生质体；将两个亲株的原生质体在高渗条件下混合，由聚乙二醇(PEG)等助融，使细胞质融合；通过两套基因组之间的接触、交换，发生基因组的遗传重组，在再生细胞中获得重组体。二、原生质体融合育种n（二）、育种步骤：n筛选标记菌株；n制备原生质体；n原生质体融合；n原生质体再生；n选择融合子；n筛选实用性菌株。二、原生质体融合育种n1、筛选标记菌株-亲株常采用常规诱变育种方法，获得营养缺陷和抗药性等遗传性状为标记。目的基因不一定与标记基因连锁。已知融合频率较高时，为了减少标记对正常代谢的干扰，可以仅有一个标记。每个亲株各有两个隐性性状的营养缺陷标记，可以排除获得的原养型融合子是回复突变的可能。最好选择对菌株生产性能没有影响的标记。特别是对于工业生产菌来说，用诱变方法获得标记，往往对该菌株的生产性能影响甚大，应尽可能采用该菌株自身已带的遗传标记。二、原生质体融合育种n2、制备原生质体-细菌和放线菌主要采用溶菌酶；酵母菌和霉菌可用蜗牛酶和纤维素酶。影响因素：进行预处理，加强壁对酶的敏感性。在细菌中加入EDTA、甘氨酸、青霉素和D-环丝氨酸等；在放线菌的中加入1%4%的甘氨酸等；在酵母菌中加入EDTA和巯基乙醇等；在粟酒裂殖酵母中加入2-脱氧葡萄糖等。（甘氨酸取代肽聚糖的L-丙氨酸和D-丙氨酸残基；青霉素干扰甘氨酸肽桥与四肽侧链上D-丙氨酸之间的联结；环丝氨酸结构类似于D-丙氨酸，竞争性抑制丙氨酸消旋酶的作用，使L-丙氨酸不能转变为D-丙氨酸，不能合成N-乙酰胞壁酸五肽）二、原生质体融合育种n选择适宜的培养时间，生长、代谢旺盛，壁对酶解作用最为敏感，原生质体形成率、再生率均很高。细菌采用对数生长后期，放线菌采用对数生长期到平衡期之间的转换期最为合适。n酶浓度过低，不利于原生质体形成；酶浓度增加，形成率增大；超过一定范围，形成率提高不明显，并且导致再生率降低。最佳酶浓度是使形成率和再生率之积达到最大。n 提高酶解温度，酶解反应加快；酶蛋白逐渐变性失活。最适温度是两种效应的共同结果。还要以再生率加以校正。一般酶解温度2040。二、原生质体融合育种n酶解时间应适宜。过短，原生质体形成不完全；过长，随着酶解时间的延长，酶使膜损伤，原生质体破裂、失活，再生率急剧降低。n渗透压保护原生质体免于膨胀作用，有助于酶和底物的结合。细菌中多用蔗糖、丁二酸钠、NaCl等，酵母菌中多用山梨醇、甘露醇等，霉菌中多用KCl和NaCl等。浓度0.30.8mol/L。n此外，破壁pH值、培养基成分、培养方式、离子强度和种类等，亦有一定影响。二、原生质体融合育种n3、融合：表面活性剂聚乙二醇及 Ca2*、Mg2*等阳离子，使融合频率出现突破性提高。PEG分子量从1000到12000，融合时多用4000和6000两种。n研究发现，融合开始时，强烈脱水引起质体粘合，不同程度地形成聚集场，质体收缩并高度变形，大量粘着的质体形成非常紧密的接触。接触处的膜间蛋白颗粒发生转位和聚集，邻近的脂质分子发生相互反应。Ca2*等强烈地促进脂质分子的扰动和重新组合，使接触处的膜形成小区域的融合，产生小的原生质桥并逐渐增大，直至两个原生质体融合。二、原生质体融合育种n4、再生酶解去壁后的原生质体应能重建细胞壁，恢复细胞完整形态，生长、分裂。再生培养基必须加入具有一定渗透压的基质，成分因种而异。壁剥离不彻底，有助于再生。菌种本身的再生特性、原生质体制备条件、再生培养基成分及再生培养条件等影响再生。-再生菌数原生质体再生率=100%-破壁前菌数剩余菌数n0.00100%。二、原生质体融合育种n5、选择融合子质体融合可以是真正融合（杂合二倍体或单倍重组体）；或是暂时融合（异核体）。两者均可在选择培养基上生长，一般前者较稳定，后者不稳定，会分离成亲本类型，有的甚至以异核状态移接几代。因此，要获得真正的融合子，必须在融合原生质体再生后，进行几代自然分离和选择，才能加以确定。如果有两个遗传标记互补可以确定其为融合子。二、原生质体融合育种n6、筛选实用性菌株融合子类型是各种各样的，存在性能和产量不同的情况。需要人为定向筛选融合子。n以纯齿棒杆菌B9和天津短杆菌TG-866为亲株进行质体融合，初筛后发现，有的根本不产生谷氨酸，如F5、F38、F220等；有的产率很低，如F12、F268、F300等；有的产率介于两亲株之间，如F70；有的产率较两亲株都高，如F263、F288等。原生质体融合基本过程示意图 第四节 基因工程n重组DNA技术：在体外对不同来源的DNA分子进行重组，引入合适的寄主细胞内，使之复制和表达。n基因工程属于狭义的遗传工程，习惯上所说的遗传工程多指基因工程。n广义的遗传工程包括基因工程、细胞工程、染色体工程、细胞器工程等。一、基因工程的基本操作 n（一）、目的基因的取得：n选择适宜的给体细胞，从中采集分离有生产意义的目的基因；n通过反转录酶的作用由mRNA合成cDNA(互补DNA)；n用化学方法合成特定功能的基因。一、基因工程的基本操作n（二）、选择载体：原核受体细胞的载体，主要是细菌质粒(松弛型)和噬菌体