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细菌学检验重点细菌学检验重点第一章第一章细菌学实验的基本要求细菌学实验的基本要求1 1、实验室生物安全、实验室生物安全(Laboratory biosafety):实验室的生物安全条件和状态不低于容许水平，可避免实验室人员、来访人员、社区及环境受到不可接受的损害，符合相差法规、标准等对实验室生物安全责任的要求。2 2、生物安全防护基本要求、生物安全防护基本要求实验室生物安全防护实验室生物安全防护（biosafety protection for laboratories）实验对象：致病的微生物及其毒素 综合措施：实验室设计建造、个体防护设施、工作及操作程序和规程等 确保：实验室工作人员不受实验对象侵染，周围环境的生物安全。确保：实验室工作人员不受实验对象侵染，周围环境的生物安全。实验室生物安全通用原则实验室生物安全通用原则积极防止操作者操作者在污染的环境中接触生物危害物；主动封闭生物危害材料产生之源，防止从操作部位操作部位向周围环境释放；尽量减少生物危害材料生物危害材料向周围环境意外释放所造成的后果。3 3、实验室必须设有专职的生物安全负责人、实验室必须设有专职的生物安全负责人实验室负责人实验室负责人为实验室生物安全的第一责任人。第一责任人。生物安全等级生物安全等级生物安全防护实验室根据所处理的微生物及其毒素的危害程度分为四级四级。实验室生物安全防护要求：一级最低，四级最高：一级最低，四级最高。4、在主实验室合理设置清洁区、半污染区清洁区、半污染区和污染区污染区5 5、各级生物防护实验室特点、各级生物防护实验室特点一级生物安全防护实验室一级生物安全防护实验室（BSL-1/P1BSL-1/P1）：）：适用于对健康成年人已知无致病作用的微生物已知无致病作用的微生物，如用于教学的普通微生教学的普通微生物实验室物实验室等。二级生物安全防护实验室（二级生物安全防护实验室（BSL-2/P2 BSL-2/P2）实验室结构和设施、安全操作规程、安全设备适用于对人或环境具有中等潜在危害的微生物。具有中等潜在危害的微生物。在处理危险度在处理危险度 2 2 级或更高危险度级别级或更高危险度级别的微生物时，在实验室门上应标有国际通用的生物危害警告标志。三级生物安全防护实验室（三级生物安全防护实验室（BSL-3/P3BSL-3/P3）：适用于主要通过呼吸途径呼吸途径使人传染上严重的甚至是致死疾病的致病微生严重的甚至是致死疾病的致病微生物及其毒素物及其毒素，通常已有预防传染的疫苗已有预防传染的疫苗。四级生物安全防护实验室（四级生物安全防护实验室（BSL-4/P4 BSL-4/P4）：）：适用于对人体具有高度的危险性高度的危险性，通过气溶胶途径传播或传播途径不明，目前尚无有效的疫苗或治疗方法目前尚无有效的疫苗或治疗方法的致病微生物及其毒素。6、控制措施安全设备安全设备和个体防护个体防护是实验室工作人员与致病微生物及其毒素直接接触的一级屏障一级屏障。所有可能使致病微生物及其毒素溅出或产生气溶胶溅出或产生气溶胶的操作，都必须在生物安全柜内进行。生物安全柜内进行。7 7、生物安全柜（、生物安全柜（BSCBSC）biosafety cabinet(biosafety cabinet(概念、分级及特点概念、分级及特点)具备气流控制及高效空气过滤装置的操作柜，可有效降低实验过程中产生的有害气溶胶对操作者和环境的危害。(净化排气净化排气)根据生物安全防护水平的差异，生物安全柜可分为I I、级、级 3 3 种类型。种类型。实验室应按要求分别配备I、级生物安全柜。级生物安全柜：级生物安全柜：外部空气保证工作人员不受侵害，但不保证实验对象不受污染。保证工作人员不受侵害，但不保证实验对象不受污染。级生物安全柜：级生物安全柜：经高效过滤器净化的无涡流的单向流空气既保证工作人员不受侵害，也保证实验对象不受污染；既保证工作人员不受侵害，也保证实验对象不受污染；级生物安全柜：级生物安全柜：经高效过滤器净化的无涡流的单向流空气8 8、生物安全柜和超净工作台的区别、生物安全柜和超净工作台的区别(完整word版)细菌学检验-第1页(完整word版)细菌学检验-第1页超净工作台：保护保护样品，不保护不保护操作者和环境生物安全柜：保护保护操作者、环境以及实验材料正压、简单负压、复杂不能以净化工作台代替生物安全柜，反之则可以。不能以净化工作台代替生物安全柜，反之则可以。9 9、标准的细菌等微生物操作要求标准的细菌等微生物操作要求实验室负责人.工作人员洗手、工作区域不允许不允许吃/喝/抽.戴护目镜或面罩、食物储存食物储存禁止口吸吸管、禁止口吸吸管、减少飞溅物/气溶胶、工作台表面的去污/灭活、废物去污后处理、废物去污后处理1010、注：高压蒸汽灭菌：负责消毒者不准离开消毒室。、注：高压蒸汽灭菌：负责消毒者不准离开消毒室。制备培养基.无菌操作无菌操作.、使用酒精灯、灭菌吸管.10 倍递增稀释.无菌操作；三三制：稀释三级，每一稀释度用三个平行平板稀释三级，每一稀释度用三个平行平板；取供试液加注于平皿时，供试液须充分混匀。培养基倾注于平皿：45451、1、整个操作过程应在lhlh 内完成、无菌检验.第二章、细菌学检验基本技术第二章、细菌学检验基本技术临床样本的采集与送检临床样本的采集与送检样本样本血骨髓采样时间采样时间发病早期、急性期或症状典型时晨起采样方法采样方法成人 10ml，儿童 35ml；骨髓 12ml。中段尿脓血、黏液的粪便；絮状物；直肠拭子自然咳痰、支气管镜、胃内采痰法等；鼻咽拭子注意事项注意事项样本切勿冰箱存放；无菌操作；废弃物高压灭菌。防杂菌污染，无菌操作。尽快送检，不得加防腐剂或消毒剂。无菌采样；新鲜；立即送检。尿液粪便痰上呼吸道样本急性期晨间无限制漱口；立即送检或 4保存。1 1、食品样本采集原则、食品样本采集原则根据检验目的、食品特点、批量、检验方法、微生物的危害程度等确定采样方案。随机采样代表性代表性无菌操作无菌操作，防污染。（外源性污染、样本变质和细菌生长）食物中毒时，采集可疑食物样本。2 2、食品样本采集种类、食品样本采集种类大样、中样、小样。大样：一整批样本。中样：从样本各部分所取得的混合样本，一般为一般为 200g200g。小样：分析用，检样，小样：分析用，检样，25g25g。注：注：检验结果报告后，剩余样品或同批样品不进行微生物项目的复检复检3 3、细菌的形态结构检查法、细菌的形态结构检查法借助显微镜，对细菌形态、大小、排列、结构进行直接观察。在细菌检验中极其重要，是细菌分类和鉴定不可缺少的组成部分在细菌检验中极其重要，是细菌分类和鉴定不可缺少的组成部分。样本中有无细菌及其大致的数量。细菌的形态、大小、排列、结构和染色反应性。培养物是否为纯种。(完整word版)细菌学检验-第2页(完整word版)细菌学检验-第2页普通光学显微镜（0.2 m 10000.2mm）细菌染色样本；弱光下用于不染色样本活菌的运动情况暗视野显微镜（0.04 m：5050 倍倍）不染色样本活菌的形态相差显微镜：活体细胞的外形和运动方式；细胞内部某些细微结构及这些结构的数量4 4、不染色检查：主要用于观察细菌的动力、不染色检查：主要用于观察细菌的动力 有鞭毛的细菌为真正运动 无鞭毛的细菌则为布朗运动(即分子运动)染色检查染色检查细菌染色显微镜观察。常用的细菌染料：人工合成带苯环的染料，色基人工合成带苯环的染料，色基+助色基助色基单纯染料：苏丹染料单纯染料：苏丹染料酸性染料：伊红、酸性品红、刚果红等酸性染料：伊红、酸性品红、刚果红等碱性染料：美蓝、孔雀绿、甲紫和碱性复红等碱性染料：美蓝、孔雀绿、甲紫和碱性复红等复合染料：姬姆萨染料、瑞氏染料等复合染料：姬姆萨染料、瑞氏染料等5 5、单染色法：、单染色法：用一种染料染色，使各种细菌均染成同一颜色。操作简单，易于使用。只能显示细菌的形态及大小操作简单，易于使用。只能显示细菌的形态及大小。如用美蓝或稀释石炭酸复红等6 6、复染色法：、复染色法：用两种以上染料染色细菌，显示细菌形态大小，鉴别细菌种类鉴别染色法鉴别染色法:革兰染色法革兰染色法、抗酸染色法、抗酸染色法GramsGrams 染色操作步骤染色操作步骤：初染、媒染、脱色、复染：初染、媒染、脱色、复染抗酸染色法：抗酸菌：抗酸染色法：抗酸菌：分枝杆菌/分枝菌酸。一般不易着色，一旦染上色后又不易被盐酸酒精脱色。经过加热和延长染色时间来促使抗酸菌着色。步骤：初染、脱色、复染步骤：初染、脱色、复染7 7、负染色法：、负染色法：背景着色而细菌本身不着色。细菌荚膜细菌荚膜常用墨汁负染色法墨汁负染色法配合单染色法单染色法(如美蓝)，背景呈黑色，菌体染成蓝色，荚膜不着色，包绕在菌体周围成为一层透明的空圈。该法具有快速、经济、简便易行、高度反差、分辨率高的特点。8 8、培养基的种类按物理性状分、培养基的种类按物理性状分液体培养基：增菌、作生化试验等半固体培养基：观察细菌的动力、分类鉴定、保存菌种及噬菌体效价滴定等。琼脂用量为0.5%1%固体培养基：主要用于分离培养；平板、斜面、高层及高层斜面；琼脂用量为1.5%2%9 9、培养基的种类按用途分、培养基的种类按用途分基础培养基(basic medium)营养培养基(nutrient medium)增菌培养基菌培养基(enrichment medium)(enrichment medium)选择性培养基选择性培养基(selective medium)(selective medium)鉴别培养基鉴别培养基(differential medium)(differential medium)专用培养基(dedicated medium)1010、增菌培养基：多为液体。、增菌培养基：多为液体。目的菌，杂菌。营养成分抑制物质目的菌，杂菌。营养成分抑制物质选择性增菌培养基；非选择性增菌培养基选择性增菌培养基；非选择性增菌培养基7.5%NaCl7.5%NaCl 肉汤：金葡増菌肉汤：金葡増菌1111、鉴别培养基：、鉴别培养基：几种细菌由于对培养基中某一成分的分解能力不同，其菌落的生长特征(颜色、形状等)不同而被区分开。某些特定的化学物质某些特定的化学物质鉴别和区分不同细菌鉴别和区分不同细菌1212、制备培养基的一般程序、制备培养基的一般程序1 1 调配溶化；调配溶化；2 矫正 pH；3 过滤澄清；4 分装；5 5 灭菌灭菌；6 检定1313、平板划线接种法、平板划线接种法平板划线接种法是常用的细菌分离培养方法常用的细菌分离培养方法。使样本或培养物中混杂的多种细菌分开分开成长为单个菌落，并根据菌落的形态和特征，挑选所需的单个菌落，经移种获得纯种细菌纯种细菌。(完整word版)细菌学检验-第3页(完整word版)细菌学检验-第3页不同的细菌在平板上所形成的菌落有其固有的形态特征，可以作为细菌鉴定鉴定的依据之一。1414、平板划线方法、平板划线方法分区划线接种法；曲线分区划线接种法；曲线/连续划线接种法；连续划线接种法；棋盘格划线接种法；放射法；四格法；平板涂布接种法15、分区划线接种法分区划线接种法：多用于含菌数量较多样本的细菌分离：多用于含菌数量较多样本的细菌分离16、半固体培养基：可用于观察细菌动力和保存菌种。半固体培养基：可用于观察细菌动力和保存菌种。17、菌落菌落：细菌经一定时间培养后，在固体培养基表面所形成的，肉眼可见的物体(群落)。18、菌落特征菌落特征菌落形状；大小：mm；表面性状；边缘情况；颜色；透明度；质地；粘度；乳化性.等19、细菌在鉴定培养基上的特征细菌在鉴定培养基上的特征溶血特征；卵黄；蛋白；色素；气味在血平板上的溶血特征在血平板上的溶血特征 溶血：狭窄的草绿色的半透明区域 溶血：完全透明清楚的宽带 溶血：看不到溶血带的溶血卵黄琼脂中的反应卵黄琼脂中的反应：检查细菌是否产生卵磷脂酶和脂酶卵磷脂酶：降解卵黄，菌落周围出现沉淀环脂酶：出现“珍珠包膜”蛋白水解作用：蛋白水解作用：在菌落周围出现清晰的环。色素色素水溶性色素水溶性色素溶在培养基中，使培养基着色使培养基着色。绿脓色素、荧光色素等；脂溶性色素脂溶性色素则使细菌菌落着色菌落着色。金黄色葡萄球菌的金黄色菌落。气味气味假单胞菌属细菌葡萄汁气味；变形杆菌巧克力烧焦的臭味；链球菌地窖里的霉臭；梭菌粪臭、腐败味；产黑色素类杆菌属细菌辛辣味2020、细菌的生化反应试验、细菌的生化反应试验不同的细菌不同的酶系统不同的新陈代谢产物产物不同的生化特性产物不同的生化特性鉴别细菌的类别鉴别细菌的类别2121、糖发酵试验结果判断、糖发酵试验结果判断反应现象酸性变色变色、有气泡酸性变色变色、无气泡培养基不变色不变色结果描述分解糖产酸、产气分解糖产酸、不产气不分解糖2222、甲基红、甲基红(MR)(MR)试验试验：检查细菌发酵葡萄糖产生并保持稳定的酸性终末产物和克服体系缓冲作用的能力。分解葡萄糖丙酮酸乳酸、乙酸、甲酸等培养基的pH4.5甲基红指示剂红色红色：阳性；分解葡萄糖产酸少培养基pH 较高甲基红指示剂黄色：阴性黄色：阴性。2323、-半乳糖苷酶试验半乳糖苷酶试验：预测细菌发酵乳糖发酵乳糖的能力。-半乳糖苷酶：一种能把乳糖水解成葡萄糖和半乳糖的酶。发酵乳糖的大肠菌类能产生-半乳糖苷酶-渗透酶(P)和 -半乳糖苷酶(G)2424、靛基质、靛基质(吲哚吲哚)试验试验分解：蛋白胨中的色氨酸吲哚吲哚二甲氨基苯甲醛玫瑰吲哚玫瑰吲哚(红色红色)2525、硫化氢试验、硫化氢试验分解：含硫氨基酸H2S(完整word版)细菌学检验-第4页(完整word版)细菌学检验-第4页H2S铅或铁离子黑色硫化物。黑色硫化物。2626、触酶试验、触酶试验过氧化氢酶又称触酶，可使细菌代谢过程中的过氧化氢分解为水和氧。2727、血浆凝固酶试验、血浆凝固酶试验金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌可产生凝固酶凝固酶,使血浆中的纤维蛋白原转变为纤维蛋白,附着于细菌表面,产生凝固。玻片法：与细胞壁结合的凝固酶试管法：菌体生成后释放于培养基中的游离凝固酶2828、血清学鉴定、血清学鉴定 serological identity：确定致病菌的种或型未知纯种细菌已知特异性抗体未知纯种细菌已知特异性抗体常用方法：玻片凝集试验玻片凝集试验、免疫荧光、协同凝集、对流免疫电泳、酶免疫、间接血凝、乳胶凝集2929、血清学诊断、血清学诊断辅助诊断：抗原性较强的病原菌和病程较长的传染病。抗体有无及其抗体效价变化 已知的细菌/特异性抗原特异抗体常用方法：试管凝集试验。试管凝集试验。直接凝集试验、显微镜凝集试验、沉淀试验、乳胶凝集试验、ELISA、免疫荧光试验等。急性期和恢复期双份血清样本，恢复期的抗体效价比急性期升高升高 4 4 倍或倍或 4 4 倍以上倍以上。3030、细菌毒素的检测方法、细菌毒素的检测方法外毒素外毒素 细菌外毒素的免疫血清(抗体)被检细菌培养物滤液(抗原)细菌外毒素(抗原)被检患者血清 动物试验内毒素内毒素 家兔热原试验,鲎试验鲎试验,免疫学方法、生物学方法、化学发光法、流式细胞术、高效液相色谱3131、鲎试验、鲎试验(limulus test(limulus test，LT)LT)：定量及半定量检测细菌内毒素；血液中含有一种独特的有核变形红细胞，红细胞裂解物内毒素凝胶有核变形红细胞，红细胞裂解物内毒素凝胶3232、细菌数量的测定：物理计数法、细菌数量的测定：物理计数法；生物计数法；生物计数法物理计数法物理计数法细菌总数计数法细菌总数计数法：利用工具和仪器对样本中的细菌进行计数，其结果表示样本中的所有细菌(活菌死菌活菌死菌)。Breed 计数法：Direct microscopic count比浊管计数法：细菌悬液的浊度与菌数成正比分光光度计测定法：吸光度同细菌总数成正比生物计数法生物计数法活菌活菌计数法：利用各种培养方法检测样本中细菌的数目,计数培养基上生长的菌落菌落数样本中活菌数活菌数。半定量计数法；倾注平板法倾注平板法；旋管计数法；滴液计数法；琼脂表面计数法；膜滤过计数法；微菌落快速计数法；最可能数最可能数(MPN)(MPN)的估计的估计3333、L-L-型细菌检查型细菌检查 L forms bacterium L forms bacterium：一种细菌通过变异而产生的细胞壁缺陷型。必须在高渗溶液中方能存活，并失去原有形态而变成圆球形或多形性。致病?第四章、细菌的分型及其检验技术第四章、细菌的分型及其检验技术1 1、细菌分型、细菌分型“传统方法”仅进行病原的菌种鉴定菌种鉴定是不够的，需要进一步的分型诊断分型诊断。血清学分型；生物化学分型血清学分型；生物化学分型；噬菌体分型；细菌素分型；耐药谱分型耐药谱分型；质粒图谱分型;PCR 技术；染色体酶切物脉冲场(完整word版)细菌学检验-第5页(完整word版)细菌学检验-第5页凝胶电泳分型2、噬菌体的作用具有高度特异性（种、型）噬菌体的作用具有高度特异性（种、型）一种噬菌体只能裂解一种或与该种相近的细菌，故可用于细菌的分类分类鉴定。用己知型噬菌体鉴定细菌，可对细菌进行分型。分型。3 3、毒性噬菌体：、毒性噬菌体：Virulent PhageVirulent Phage：能在宿主菌细胞内复制、增殖，产生许多子代噬菌体，最终裂解细菌。4 4、温和噬菌体、温和噬菌体：TemperateTemperate PhagePhage：与宿主菌的染色体整合，随细菌DNA 的复制而复制，随细菌的分裂而传代，不产生子代噬菌体。5 5、噬菌斑、噬菌斑(plaque)(plaque)在液体培养基中，噬菌体可使浑浊的菌液变为澄清；在固体培养基上，噬菌体对宿主菌细胞的裂解作用可使菌落溶解，导致在带菌琼脂平板上产生空斑，易于观察，称噬菌斑(plaque)。6 6、噬菌体的效价测定、噬菌体的效价测定噬斑形成单位噬斑形成单位(pfu)(pfu)的测定的测定：若将噬菌体按一定倍数稀释，通过噬斑计数，可测定一定体积内的噬斑形成单噬斑形成单位位(plaque forming units,pfu)数目，即噬菌体的数目。7 7、细菌素分型技术细菌素分型技术细菌素细菌素(bactericin)：某些细菌产生的蛋白质类抗菌物质，这种物质只对只对产生菌亲缘关系近的细菌有抗菌作用，而对产生菌本身不敏感。细菌素是蛋白质，质粒控制，多处于抑制状态。细菌素的应用主要是细菌的分型细菌的分型和流行病学调查，是血清学分型的补充。8 8、药敏试验、药敏试验(drug susceptibility test)(drug susceptibility test)在体外测定抗菌药物抑制或杀死细菌能力的试验。在体外测定抗菌药物抑制或杀死细菌能力的试验。抗菌药物：抗菌药物：具有杀菌或抑菌活性的抗生素和化学合成药物。9 9、药敏试验方法、药敏试验方法纸片法：纸片法：测定抑菌环抑菌环大小，其结果以敏感、中度敏感、中介度、耐药表示。稀释法稀释法：找出能抑制细菌生长的最小抑菌浓度最小抑菌浓度(MIC)(MIC)或最小杀菌浓度最小杀菌浓度(MBC(MBC)表示。E E 试验试验(E-test)(E-test)：最小抑菌浓度最小抑菌浓度 MIC MIC：在特定环境下孵育 24 小时，可抑制某种微生物出现明显增长的最低药物浓度。最小杀菌浓度最小杀菌浓度 MBC MBC：杀死 99.9%（降低 3 个数量级）的供试微生物所需的最低药物浓度1010、纸片扩散法、纸片扩散法是国际上推荐使用的标准实验方法标准实验方法；细菌耐药谱分析中最常用最常用的方法。原理原理：将含定量抗菌药物纸片抗菌药物纸片贴在已接种待测细菌待测细菌的琼脂平板表面，培养后，形成一个透明抑菌环抑菌环。抑菌环的大小抑菌环的大小反映待测菌对该药物的敏感程度，与与 MICMIC 成反比。成反比。8 80.50.5 麦氏比浊度麦氏比浊度=1=11010 cfu/mlcfu/ml结果判断：结果判断：针对抑菌环直径测量值抑菌环直径测量值报告敏感、中介敏感、中介或耐药。耐药。敏感(S)：被测细菌所引起的感染可以用常用剂量的该抗菌药物治愈。中介(I)耐药(R)：被测细菌不能被常用剂量抗菌药物抑制,或具有特定耐药机理，临床治疗效果不佳。1111、肉汤稀释法、肉汤稀释法原理原理：将药物按一定规律用 M-H 肉汤稀释成一系列浓度后，与一定量的细菌作用，经培养后定量测定其MIC，反映细菌的药物敏感性。5 5校正 0.5 麦氏比浊标准，1 1200200 稀释稀释（110120）。（510510 cfu/mlcfu/ml）结果判定结果判定：无肉眼可见细菌生长的药物最低浓度即为该待测菌MICMIC。1212、琼脂稀释法、琼脂稀释法原理原理：将待测菌接种于含不同浓度药物不同浓度药物的琼脂平板上，经培养后观察菌落的生长情况，以能抑制细胞生长的最能抑制细胞生长的最(完整word版)细菌学检验-第6页(完整word版)细菌学检验-第6页低药物浓度低药物浓度为该菌的 MICMIC。第五章、细菌的分类与命名第五章、细菌的分类与命名 P91P911 1、细菌分类等级、细菌分类等级 种种是细菌分类的基本单位基本单位，将生物学性基本相同的细菌群体归成一个菌种菌种；性状相近、关系密切的若干菌种组成一个菌属菌属；2 2、细菌、细菌 DNADNA 中中 G GC mol/%C mol/%测定测定细菌 DNA 中 G GC mol%C mol%含量不同是细菌的一个重要遗传特征重要遗传特征。单一菌种单一菌种中许多不同菌株的 GC mol%平均值极为接近接近或者是一致一致的。3 3、细菌命名、细菌命名细菌的科学名称(学名)为生物双名式。属名种名(人名、地名)。斜体斜体属名在前，名词，首字母大写种名在后，形容词，小写属名属名可用第一个字母代表 M.M.tuberculosis(结核分枝杆菌)、S S.typhi(伤寒沙门菌)常见的细菌也可用习惯通用俗名 tuberculosis(结核杆菌)、typhoid bacillus(伤寒杆菌)泛指泛指某一属细菌：属名spsp(菌种 species)Mycobacterium spsp，Salmonella sp sp亚种的名称：属名种名亚种 Klesbsiella penumoniae subspecies pneumoniae中文译名则种名在前，属名在后。4 4、细菌分类系统、细菌分类系统：伯杰氏鉴定细菌学手册第七章、消毒学试验技术第七章、消毒学试验技术1 1、消毒学试验、消毒学试验原理原理：将试验微生物试验微生物暴露于消毒因子消毒因子(物理、化学、生物学)，作用预定的时间之后，检查试验的微生物是否被被杀灭或抑制杀灭或抑制。主要目的：主要目的：检查一种消毒剂或消毒方法消毒剂或消毒方法是否能达到杀灭或消除病原微生物杀灭或消除病原微生物的要求。2、消毒消毒 disinfection disinfection：杀灭或清除传播媒介上病原微生物，使其达到无害化的处理。灭菌：灭菌：杀灭或清除传播媒介上一切微生物（包括病原体和非病原体的繁殖体和芽胞）的处理。3 3、微生物学检验：、微生物学检验：中和试验、定性定性/量杀菌试验量杀菌试验、病毒灭活试验、能量试验、现场试验等4 4、消毒药械鉴定测试的项目、消毒药械鉴定测试的项目理化性能检验微生物学检验消毒剂有效成分含量；pH；金属腐蚀性微生物杀灭微生物杀灭模拟现场试验与现场试验稳定性试验消毒器械杀菌因子强度或浓度；金属腐蚀性实验室杀灭微生物实验室杀灭微生物模拟现场和现场试验安全性试验(电器、毒理)其他5 5、菌片、菌片：用于测定各种消毒剂、消毒器械与方法消毒剂、消毒器械与方法对不同物品上微生物微生物的杀灭作用。6 6、残留消毒剂的去除方法：化学中和法（称中和剂法）、残留消毒剂的去除方法：化学中和法（称中和剂法）、过滤冲洗法、稀释法等中和剂法：中和剂法：在消毒剂与微生物作用到达规定时间的终点时，取样加于适宜种类和浓度的中和剂中和剂中，将残留消毒(完整word版)细菌学检验-第7页(完整word版)细菌学检验-第7页剂迅速中和，使其不再持续抑制或杀灭微生物的方法。中和剂中和剂：能及时中止消毒剂的杀微生物作用本身及其与消毒剂的反应产物对微生物无抑制或杀灭作用，对培养基无不良影响。7 7、中和试验、中和试验操作方法操作方法5 56 61.用 PBS 将指示菌制成 510510 510510 cfu/mlcfu/ml 悬液。2.将消毒剂用灭菌蒸馏水配制成3 3 种不同浓度种不同浓度，在不加中和剂的情况下，测知该消毒剂10min10min 抑杀指示菌抑杀指示菌 99.999.9以上的最低有效浓度。以上的最低有效浓度。3.取消毒剂10min抑杀指示菌的最低有效浓度与待选择中和剂进行试验，选出中和剂种类选出中和剂种类并依据等当量中和原则，调整中和剂浓度，选出试验浓度的消毒剂使用中和剂的浓度中和剂的浓度。4.中和剂选择试验时，先将消毒剂1.0mL 与中和剂溶液 9.0mL 混合，制成中和产物溶液中和产物溶液，再分组分组进行。试验分组试验分组消菌：消毒剂对试验菌有无杀灭或抑制能力。(消菌)中：残留消毒剂被中和后受到消毒剂作用后的试验菌是否能恢复生长。中菌：中和剂是否抑菌。(消毒剂中和剂)菌液：中和产物，或未被完全中和的残留消毒剂对试验菌的生长繁殖是否有影响。稀菌：菌数对照。稀中培养：阴性对照。8 8、消毒剂定性消毒试验：、消毒剂定性消毒试验：测定受消毒因子作用后的样本有无细菌生长有无细菌生长的试验方法。试验方法试验方法5 56 6510510 510510 cfu/mLcfu/mL 的菌悬液。灭菌试管 10，标号。每管：灭菌蒸馏水2.5mL，202水浴。消毒液消毒液 2.5mL，倍比稀释倍比稀释，至第 9 管。第 10 管中不加消毒液作对照。56加菌悬液 2.5mL 于各管中，混匀并记录各管加菌时间，使菌药混合液中含菌量均为10 10 cfu/mL。各管分别于加菌后 4 个不同间隔时间，取0.5mL 4.5mL 中和剂内，中和中和 10min 后，取出0.5mL 加入 4.5mL 营养肉汤管内。将接种细菌的肉汤管放 37培养培养 48h，观察初步结果，无菌生长管继续培养至第7 天。试验重复试验重复 5 5 次。次。结果判定结果判定若肉汤管混浊肉汤管混浊，则表示有菌生长有菌生长，记为阳性，以（+）表示。若培养至第 7 天，肉汤管澄清肉汤管澄清，则表示无菌生长无菌生长，记为阴性，以（）表示。对难以判定的肉汤管，取01mL 接种于营养琼脂平板，用灭菌L 棒涂匀，放37培养 48h，观察菌落形态；并做涂片染色镜检，判断是否有指示菌生长。有指示菌生长记为阳性。5 5 次试验，均无指示菌生长表示达到灭菌。次试验，均无指示菌生长表示达到灭菌。9 9、消毒剂定量消毒试验：、消毒剂定量消毒试验：测定受消毒因子作用后，样本残存微生物数量残存微生物数量的试验方法，以杀灭率表示杀灭率表示结果。用于对消毒剂杀灭效果的评价。原理原理：将一定量的细菌悬液细菌悬液或菌片(载体)，暴露于设计浓度的消毒液消毒液中，作用至规定时间后，取细菌与消毒液的混合物或取出载体，与中和剂中和剂反应，终止消毒剂的继续作用，并接种于营养琼脂平板，培养之后，计数菌落。以存活的菌落数与最初加入的菌数比较，计算出杀灭率出杀灭率，或杀灭效果(germicidal effect，GE)。1010、悬液定量杀菌试验、悬液定量杀菌试验-活菌培养计数活菌培养计数消毒液：浓度为待测浓度的1.251.25 倍倍88实验用菌悬液：(110 510)cfu/ml菌菌 0.5ml0.5ml干扰干扰 0.5ml0.5ml，混匀，201水浴5min，消毒液消毒液 4.0m4.0ml，迅速混匀并立即计时。待菌药相互作用至预定时间，分别吸取0.5ml 菌药混合液加于 4.5ml 经灭菌的中和剂中和剂中，振荡混匀。(完整word版)细菌学检验-第8页(完整word版)细菌学检验-第8页1111、定量杀菌试验的评价规定、定量杀菌试验的评价规定在产品说明书指定的最低浓度最低浓度与最低作用时间，重复试验最低作用时间，重复试验 3 3 次。次。在悬液定量杀灭试验中，各次的杀灭对数值均杀灭对数值均5.005.00，可判定为消毒合格消毒合格。1212、破坏效果判定、破坏效果判定以 S/NS/N2.12.1 作为 HBsAg 抗原性破坏合格标准。S 是消毒因子作用后被检样品或阳性对照样品平均每分钟脉冲数（cpm）值或光密度（OD）值。N 是试验中阴性对照样品平均cpm 值或 OD 值。细菌学检验各论一般性思考题：细菌学检验各论一般性思考题：1 1、菌的培养特征如何？（增菌、选择性平板）菌的培养特征如何？（增菌、选择性平板）2 2、菌的形态与染色有何特点。、菌的形态与染色有何特点。3 3、菌的生化特性有哪些？其中最有特点的是哪个项目，如何利用这个项目，诊断某细菌是否是、菌的生化特性有哪些？其中最有特点的是哪个项目，如何利用这个项目，诊断某细菌是否是菌。菌。4 4、菌的分型特点是什么？、菌的分型特点是什么？致病菌检测的一般思路？致病菌检测的一般思路？（肖老师某次课后在黑板上总结过，大家注意哦）（肖老师某次课后在黑板上总结过，大家注意哦）第十一章第十一章弧菌属弧菌属弧菌属细菌分布广泛，尤以水中最多，致病菌主要有霍乱弧菌、副溶血性弧菌，霍乱弧菌、副溶血性弧菌，分别引起霍乱和食物中毒霍乱和食物中毒1 1 霍乱弧菌霍乱弧菌目前，作为国际检疫传染病霍乱的病原诊断，以检出O1O1 群霍乱弧菌或群霍乱弧菌或 O139O139 群霍乱弧菌群霍乱弧菌为准1 1、生物学性状、生物学性状形态：形态：-，菌体弯曲或直的短杆菌，呈弧形或逗点状，单鞭毛 在病人“米泔水”样便中，可呈头尾相接的鱼群样排列。鱼群样排列。作悬滴观察时，因细菌一端有鞭毛，呈穿梭样运动。在暗视野显微镜下观察，犹如夜空中的流星流星。无荚膜，有普通菌毛和性菌毛，O139 群有多糖荚膜，不形成芽胞。培养特性培养特性营养要求不高，在普通培养基上生长良好，属兼性厌氧菌。生长温度：1642/37pHpH：6.06.09.29.2/7.27.4/8.48.6/9.2碱性蛋白胨水碱性蛋白胨水：菌膜，液体混浊。固体琼脂培养基：无色、圆形、透明、光滑、湿润、扁平或稍凸起、边缘整齐的菌落。抗原特性抗原特性：O1 群霍乱弧菌分类生化特性生化特性靛基质和亚硝基靛基质反应靛基质和亚硝基靛基质反应(霍乱红反应霍乱红反应)细菌分解色氨酸吲哚+对二甲基氨基苯甲醛玫瑰色吲哚玫瑰色吲哚霍乱弧菌能还原硝酸盐为亚硝酸盐，靛基质反应阳性，当培养在含硝酸盐及色氨酸的培养基中，产生靛基质与亚硝酸盐，在浓硫酸存在时，生成红色红色，称为霍乱红反应霍乱红反应VPVP 试验：试验：细菌分解葡萄糖丙酮酸乙酰甲基甲醇二乙酰+胍基红色化合物埃尔托生物型：埃尔托生物型：+古典生物型：古典生物型：-溶血性溶血性区分古典生物型与埃尔托生物型区分古典生物型与埃尔托生物型霍乱弧菌古典生物型溶血素-溶血环-备注草绿色环(完整word版)细菌学检验-第9页(完整word版)细菌学检验-第9页埃尔托生物型+，透明2 2、细菌学检验、细菌学检验增菌：碱性蛋白胨水增菌：碱性蛋白胨水分离：分离：TCBS：硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂，发酵蔗糖。黄色，扁平状，直径2-3mm。确证：确证：初步鉴定：初步鉴定：显微镜下涂片染色：G-；动力检查：+（制动试验）；氧化酶试验：+；氯化钠三糖铁试验：生化确认：生化确认：法国梅里埃 ID32E 鉴定试剂条霍乱弧菌的快速诊断方法霍乱弧菌的快速诊断方法制动试验制动试验急性病人的水样便直接镜检：流星状动力的细菌。+O1 群霍乱免疫血清 运动停止，凝集成块。免疫荧光菌球法免疫荧光菌球法SPASPA协同凝集试验协同凝集试验霍乱病原菌即古典生物型霍乱弧菌、古典生物型霍乱弧菌、埃尔托生物型霍乱弧菌流行株和埃尔托生物型霍乱弧菌流行株和 O139O139 群，群，不仅可引起个体严重腹泻性疾病，而且可引起该病的流行和大流行。2 2副溶血性弧菌副溶血性弧菌是一种海洋细菌，主要来源于鱼、虾、蟹、贝类和海藻等海产品海产品。进食含有该菌的食物致可食物中毒，也称嗜盐菌嗜盐菌食物中毒。神奈川现象（神奈川现象（KPKP）:KPKP 阳性：绝大多数致病性副溶血性弧菌产生的耐热溶血毒素能使人或家兔的红细胞溶解。阳性：绝大多数致病性副溶血性弧菌产生的耐热溶血毒素能使人或家兔的红细胞溶解。溶血反应是鉴定致病性与非致病性菌株的一项重要指标。第十三章第十三章与医学有关的其他细菌与医学有关的其他细菌1 1 军团菌属军团菌属营养要求特殊，常接种于复合培养基中，生长环境中必须含半胱氨酸半胱氨酸和铁盐铁盐。需氧，2.5%2.5%5%CO5%CO2 2能促进生长。分离分离:各取 0.1ml 上述 3 种经处理样品，分别接种BCYEBCYE 或 GVPCGVPC 平板。平板。BCYCBCYC：可溶性焦磷酸铁，L-半胱氨酸盐酸盐鉴定鉴定：培养确证：BCYEBCYE 生长生长/BCYE-Cys/BCYE-Cys 不生长不生长军团病主要是通过呼吸道吸入带菌飞沫、飞沫、气溶胶气溶胶而感染，多流行于夏秋季，为全身性疾患。2 2绿脓杆菌绿脓杆菌假单胞菌中同人类与动物疾病有重要关系的大约有10 种：绿脓杆菌绿脓杆菌、荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、葱头假单胞菌、类鼻疽假单胞菌、嗜麦芽假单胞、腐败假单胞菌、斯氏假单胞菌、产碱假单胞菌、类产碱假单胞菌2 2 种水溶性色素种水溶性色素：绿脓素绿脓素，为蓝绿色的吩嗪类分合物，无荧光性，具有抗菌作用。绿脓素只有绿脓杆菌产生，故有诊断意义。荧光素，呈绿色。1 1、增菌：、增菌：110 样品稀释液 10ml+90ml SCDLPSCDLP 液体培养基(完整word版)细菌学检验-第10页(完整word版)细菌学检验-第10页SCDLPSCDLP：用于疏水性化妆品样品处理及化妆品和一次性使用卫生用品增菌培养。2 2、分离：乙酰胺培养基、分离：乙酰胺培养基3 3、绿脓菌素试验、绿脓菌素试验可疑菌落接种绿脓菌素测定用培养基氯仿提取蓝色+盐酸粉红色、紫红色阳性(被检物中有绿脓菌素存在)3 3李斯特菌李斯特菌单核细胞增多性李斯特菌单核细胞增多性李斯特菌与人类关系较密切，是人和动物的致病菌。嗜冷菌嗜冷菌：242(也有报道在 0能缓慢生长)。“冰箱杀手”与医学有关的其他细菌大家所出思考题汇总与医学有关的其他细菌大家所出思考题汇总绿脓杆菌的鉴定方法有绿脓杆菌的鉴定方法有：革兰染色、镜检，氧化酶试验，硝酸盐还原产气试验、明胶液化试验、42生长试验绿脓杆菌能产生两种水溶性色素：绿脓杆菌能产生两种水溶性色素：绿脓素具有抗菌作用有诊断意义。荧光素1.李斯特菌李斯特菌穿刺 SIM 动力培养 5d 的培养特性：倒立伞状生长2.李斯特菌生化反应中触酶试验：阳性幽门螺杆菌幽门螺杆菌1.Hp 与下列哪种疾病无关？DA.十二指肠溃疡 B.胃炎 C.肝癌 D.肺炎2.Hp 的快速检测方法是下列哪种？CA.氧化酶试验 B.触酶试验 C.尿素酶实验 D.硝酸盐还原实验布鲁菌属布鲁菌属1 以下不属于布鲁菌属的生物学特性的是:DA 革兰阴性杆菌 B 严格需氧菌 C 硝酸盐还原实验阳性 D 具有运动性2 布鲁菌的实验室常用培养基是_或_.（肝浸液培养基、改良厚氏培养基）气单胞菌属气单胞菌属1、气单胞菌属气单胞菌属的选择性培养基、鉴别培养基分别是什么？（RS 培养基、AHM 培养基）2、使用碱性蛋白胨水增菌的细菌有哪些？（霍乱弧菌、气单胞菌）弯曲菌属弯曲菌属1.弯曲菌属中导致腹泻的最常见病源菌？空肠弯曲菌2.弯曲菌属生化鉴定的三个试验？快速马尿酸钠试验、快速硫化氢试验、快速DNA 酶水解试验军团菌军团菌1 在军团菌标本处理时，哪些平板可用来培养？GVPC 平板，巧克力平板，血琼脂平板2 军团菌鉴定的试验及结果有哪些？发酵试验（-）、氧化酶试验（+/-）触酶实验（+）、动力试验（+）、马尿酸水解试验（+）、明胶液化试验（+）为军团菌第四章第四章螺旋体属螺旋体属螺旋体是一类菌体细长、柔软、弯曲呈螺旋状螺旋状、无鞭毛而能活泼运动的原核单细胞微生物。与宿主组织磷脂形成的复合抗原：当螺旋体侵入组织后，组织中的磷脂可粘附在螺旋体上，形成复合抗原，此种复合抗原可刺激机体产生抗磷