高效液相色谱课件.ppt

高高 效效 液液 相相 色色 谱谱（HighPerformanceLiquidChromatography）基本原理基本原理高效液相色谱法原理高效液相色谱法原理 当采用一种或多种测试方法不能直接确定当采用一种或多种测试方法不能直接确定混合物中特定混合物中特定或或全部组全部组份份的的组成或含量组成或含量时，需要分离后再进行测定。时，需要分离后再进行测定。基于混合物中各组分与流动相和固定相作用力基于混合物中各组分与流动相和固定相作用力存在差异使得它们存在差异使得它们在色谱柱中停留时间不同在色谱柱中停留时间不同而而完成分离。完成分离。主要分离机理：分配、吸附主要分离机理：分配、吸附基本原理基本原理色谱图(chromatogram)色谱峰保留时间(tR)死时间(t0)相对保留时间(tR)峰面积(A)峰高(h)峰宽(W)T(min)S(mV)tRt0tRAh色谱图：色谱图：是指被分离组分的检测信号随时间分布的图象。色谱峰色谱峰：组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线，流出曲线上的突起部分。保留时间保留时间(tR)：被分离样品组分从进样开始到柱后出现该组分浓度极大值时的时间，也既从进样开始到出现某组分色谱峰的顶点时为止所经历的时间，称为此组分的保留时间，用tR表示，常以分（min）为时间单位。死时间死时间(t0)：从进样到峰出现极大值的时间称为死时间。基本原理基本原理0选择性选择性分分离离度度色谱柱色谱柱塔板数塔板数保留因子保留因子基本原理基本原理保留因子保留因子k=(tR t0)/t0 =tR/t0分离因子分离因子=k2/k1流动相组成；色谱柱；温度色谱柱长短；色谱柱长短；流动相流量流动相流量基本原理基本原理分离度考虑了保留时间和峰宽度，是一个综合指标：分离度考虑了保留时间和峰宽度，是一个综合指标：R 1.0两峰明显重叠两峰明显重叠R=1.0两峰达两峰达97.7%分离分离R 1.5两峰完全分开两峰完全分开基本原理基本原理不对称度不对称度 B/A拖尾因子拖尾因子 (B+A)/2A不对称度与拖尾因子不对称度与拖尾因子基本原理基本原理小结小结色谱法研究的核心：色谱法研究的核心：选择最适合的色谱体系和条件、在最选择最适合的色谱体系和条件、在最短的时间达到最佳的分离效果。短的时间达到最佳的分离效果。基本原理基本原理固定相重量流动相重量色谱理论色谱理论1 1、塔板理论、塔板理论目的：从理论上得到描述色谱流出曲线的方程，并通过目的：从理论上得到描述色谱流出曲线的方程，并通过 这一方程各参数来研究影响分离的因素。这一方程各参数来研究影响分离的因素。假设（1）色谱柱存在多级塔板;（2）组分通过时在每级塔板两相间达 到一次平衡;基本原理基本原理理论塔板数理论塔板数N N的计算的计算基本原理基本原理相邻组分分离度的基本关系式：相邻组分分离度的基本关系式：分离度：分离度：或或基本原理基本原理1）、从理论上得到了描述色谱流出曲线的方程，通过该）、从理论上得到了描述色谱流出曲线的方程，通过该 方程可以预测具有不同分配系数方程可以预测具有不同分配系数K的两种物质在塔的两种物质在塔 板数为板数为n的色谱柱上分离的情况；的色谱柱上分离的情况；2）、通过这一方程看出影响柱效率的因素是理论板数）、通过这一方程看出影响柱效率的因素是理论板数 n，其值越大，色谱峰越窄，分离效果越好；，其值越大，色谱峰越窄，分离效果越好；怎样提高色谱柱的理论塔板数怎样提高色谱柱的理论塔板数n n，从而提高色谱柱的效率？从而提高色谱柱的效率？基本原理基本原理2 2、速率理论、速率理论塔板理论的不足塔板理论的不足 塔塔板板理理论论虽虽然然指指出出了了理理论论板板数数n n或或理理论论板板高高度度H H对对色色谱谱柱柱效效率率的的影影响响，但但是是没没有有指指出出影影响响塔塔板板高高度度的的因因素素，因因此此无法在理论指导下从实验上提高色谱柱的效率。无法在理论指导下从实验上提高色谱柱的效率。Van Deemter方程方程 1956年年Van Deemter提出速率方程，指出了提高提出速率方程，指出了提高柱效率的途径：柱效率的途径：式中：式中：u u为流动相流动的线速度为流动相流动的线速度基本原理基本原理（1）A为涡流扩散项：指固定相填充不均匀引起的扩散为涡流扩散项：指固定相填充不均匀引起的扩散为填充的不规则因子dp固定相颗粒粒径基本原理基本原理（2）B/u 为纵向分子扩散项：指分子沿色谱柱轴向扩散引为纵向分子扩散项：指分子沿色谱柱轴向扩散引 起的色谱谱带展宽起的色谱谱带展宽B=2rDm式中：式中：r弯曲因子，填充柱弯曲因子，填充柱 r BC正、反相色谱中极性和保留时间的关系正、反相色谱中极性和保留时间的关系HPLCHPLC的应用的应用化学键合相色谱法化学键合相色谱法HPLCHPLC的应用的应用化学键合相色谱法化学键合相色谱法流动相流动相l表征溶剂特性的重要参数表征溶剂特性的重要参数溶溶剂剂强强度度：溶溶剂剂分分子子与与吸吸附附剂剂的的亲亲合合程程度度，越越大大，亲亲合合力力约约大。大。溶溶解解度度参参数数：衡衡量量溶溶剂剂极极性性强强度度的的指指标标，越越大大，极极性性越越强强。是是溶溶剂剂和和溶溶质质分分子子间间色色散散力力、偶偶极极力力、接接受受质质子子或或给给予予质质子子能能力的总和。所以力的总和。所以相近的混合溶剂，它的选择性相近的混合溶剂，它的选择性不同。不同。极极性性参参数数P：溶溶剂剂与与乙乙醇醇、二二氧氧六六环环、硝硝基基甲甲烷烷相相互互作作用用的的度度量，比较全面的反映了溶剂的性质。量，比较全面的反映了溶剂的性质。粘度粘度：HPLCHPLC的应用的应用化学键合相色谱法化学键合相色谱法溶剂的选择原则溶剂的选择原则溶剂具有稳定的化学性质溶剂具有稳定的化学性质溶剂的选择与使用的检测器要有相容性溶剂的选择与使用的检测器要有相容性溶剂的粘度要小溶剂的粘度要小溶剂的沸点不能太低溶剂的沸点不能太低溶剂的纯度要高且价格便宜溶剂的纯度要高且价格便宜 HPLCHPLC的应用的应用液固色谱法液固色谱法分离机理分离机理 以固体吸附剂为固定相的液相色谱法。由于溶质分子和流动相分子在吸附剂表面的吸附活性中心上进行竞争吸附，这种竞争吸附形成不同溶质在吸附剂表面的吸附、解吸平衡。平衡常数的不同导致不同溶质得以分离。固定相固定相 极性固定相：硅胶、氧化镁、氧化铝等 非极性固定相：活性炭、高分子多孔微球、碳多孔微球等 HPLCHPLC的应用的应用液固色谱法液固色谱法流动相流动相1、越大，洗脱力越强。合适的洗脱强度可通过混合溶剂来得到越大，洗脱力越强。合适的洗脱强度可通过混合溶剂来得到2、硅硅胶胶为为固固定定相相时时：以以弱弱极极性性的的正正构构烷烷烃烃为为主主体体，加加入入二二氯氯甲甲烷等中等极性溶剂调节合适的洗脱强度。烷等中等极性溶剂调节合适的洗脱强度。3、可可用用水水对对硅硅胶胶进进行行减减活活处处理理，或或加加入入四四氢氢呋呋喃喃、乙乙腈腈、甲甲醇醇、异丙醇等改性剂异丙醇等改性剂HPLCHPLC的应用的应用液固色谱法液固色谱法l中中等等分分子子量量的的油油溶溶性性样样品品如如油油品品、脂脂肪肪、芳芳烃烃等等l不不同同极极性性取取代代基基的的化化合合物物l结结构构异异构构体体和和几几何何异异构构体混合物的分离体混合物的分离HPLCHPLC的应用的应用离子对色谱法离子对色谱法分离机理分离机理 将一种或数种与样品离子电荷（将一种或数种与样品离子电荷（A A+）相反的离子相反的离子(B(B-)（称为对离称为对离子或反离子）加入到色谱系统流动相中，使其与样品离子结合生成子或反离子）加入到色谱系统流动相中，使其与样品离子结合生成弱极性的离子对（中性缔合物）的分离方法。多为反相离子对色谱弱极性的离子对（中性缔合物）的分离方法。多为反相离子对色谱 HPLCHPLC的应用的应用离子对色谱法离子对色谱法 固定相、流动相和离子对试剂固定相、流动相和离子对试剂固定相：固定相：多为多为C18，C8反相键合相反相键合相流动相：流动相：以水为主的缓冲液，或水以水为主的缓冲液，或水-甲醇、水甲醇、水-乙腈等混合溶剂乙腈等混合溶剂离子对试剂：离子对试剂：四丁基铵正离子、十二烷基磺酸根，十六烷基三甲基铵四丁基铵正离子、十二烷基磺酸根，十六烷基三甲基铵 正离子等正离子等HPLCHPLC的应用的应用离子色谱法离子色谱法分离机理分离机理 试样中的离子与离子交换树脂上的离子发生反应：试样中的离子与离子交换树脂上的离子发生反应：阳离子交换：阳离子交换：树脂树脂SO3-H+M+=树脂树脂SO3-M+H+阴离子交换：阴离子交换：树脂树脂NR3+Cl-+X-=树脂树脂NR3+X-+Cl-不同的离子与树脂离子的交换能力（不同的离子与树脂离子的交换能力（亲和能力亲和能力）不同，亲和力）不同，亲和力越大，离子越难洗脱，从而得以分离。越大，离子越难洗脱，从而得以分离。双双柱柱抑抑制制型型：在在分分离离柱柱和和检检测测器器之之间间加加一一个个化化学学抑抑制制器器，其其作作用用有有二二，一一是是降降低低淋淋洗洗液液的的背背景景电电导导，二二是是增增加加被被测测离离子子的的电电导导值值，改改善善信信噪比。灵敏度高。噪比。灵敏度高。单柱非抑制型：单柱非抑制型：淋洗液直接进入电导检测器。简单、分辨率较好淋洗液直接进入电导检测器。简单、分辨率较好。HPLCHPLC的应用的应用离子色谱法离子色谱法 固定相固定相 离子交换剂，最常用的是乳胶薄壳型离子交换树脂小球，根据功离子交换剂，最常用的是乳胶薄壳型离子交换树脂小球，根据功能基可分为：强酸型（磺酸基团）、强碱型（季铵基）、弱酸型能基可分为：强酸型（磺酸基团）、强碱型（季铵基）、弱酸型（羧酸）、弱碱型（伯、仲、叔胺）（羧酸）、弱碱型（伯、仲、叔胺）流动相流动相 双柱抑制型：双柱抑制型：分离阳离子，一般采用无机酸如分离阳离子，一般采用无机酸如HCl，HNO3等；等；分离阴离子，一般采用分离阴离子，一般采用NaOH、NaHCO3/NaCO3。单柱非抑制型：单柱非抑制型：分离阳离子，用低浓度的分离阳离子，用低浓度的HCl，HNO3等；分离等；分离阴离子，可用苯甲酸及其盐、酒石酸、柠檬酸等阴离子，可用苯甲酸及其盐、酒石酸、柠檬酸等分析无机阴离子的首选方法；还可用于分析无机阳离子，有机酸、分析无机阴离子的首选方法；还可用于分析无机阳离子，有机酸、碱，糖类、蛋白质等。碱，糖类、蛋白质等。HPLCHPLC的应用的应用体积排阻色谱法体积排阻色谱法分离原理分离原理以以多多孔孔凝凝胶胶为为固固定定相相，利利用用精精确确控控制制的的凝凝胶胶孔孔径径，使使样样品品中中不不同分子大小的组分得以分离。同分子大小的组分得以分离。V VR R=V=V0 0+K+KD DVpVp 0K0KD D1.02000 不溶不溶 排阻色谱排阻色谱 水水 分配色谱分配色谱(同系物同系物)各种各种 吸附色谱吸附色谱(异构物异构物)各种各种 不溶不溶 排阻色谱排阻色谱(分子大小分子大小)各种各种 反相液液色谱反相液液色谱 各种各种 可溶但不解离可溶但不解离 排阻色谱排阻色谱 水水 阳离子交换色谱阳离子交换色谱(碱碱)缓冲液缓冲液 可溶且不解离可溶且不解离 阴离子交换色谱阴离子交换色谱(酸酸)缓冲液缓冲液 2000 可溶离子或非离子可溶离子或非离子 反相离子色谱反相离子色谱 缓冲液缓冲液 HPLCHPLC的发展方向的发展方向方法特点方法特点1 1，分离效能高，分离效能高2 2，检测灵敏度高，检测灵敏度高3 3，分析速度快，分析速度快发展方向发展方向1 1，高分辨率，高分辨率2 2，高峰容量，高峰容量3 3，高速，高速