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多聚酶链式反应多聚酶链式反应扩增扩增DNADNA片断片断一、基础知识一、基础知识（一）（一）DNADNA分子的结构分子的结构C C、HH、OO、N N、P P1 1、组成元素、组成元素脱氧核苷酸脱氧核苷酸2 2、基本单位、基本单位3 3、脱氧核苷酸结构、脱氧核苷酸结构脱氧核脱氧核苷酸苷酸脱氧核苷脱氧核苷磷酸磷酸脱氧核糖脱氧核糖含氮含氮碱基碱基嘌呤嘌呤嘧啶嘧啶腺嘌呤（腺嘌呤（A A）鸟嘌呤（鸟嘌呤（G G）胞嘧啶（胞嘧啶（C C）胸腺嘧啶（胸腺嘧啶（T T）一一个核苷酸上的个核苷酸上的磷酸基团上磷酸基团上的的（OHOH）和和另一个核苷酸分子的第三位碳原子另一个核苷酸分子的第三位碳原子上的上的羟基（羟基（OH OH）之间之间失去一分子水，失去一分子水，形成形成磷酸二脂键，磷酸二脂键，即在即在相邻的相邻的两个脱氧核苷两个脱氧核苷酸的酸的3 3和和5 5碳原子碳原子之间形成之间形成磷酸二脂键磷酸二脂键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过数量庞大的四种脱氧核苷酸通过3 3、5 5、磷酸二脂键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。磷酸二脂键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。通常将通常将DNADNA的的羟基羟基“OHOH”末端称为末端称为3 3端，而磷酸基团的末端称为端，而磷酸基团的末端称为5 5端端4 4、多脱氧核苷酸链的形成、多脱氧核苷酸链的形成脱氧核苷酸结构式脱氧核苷酸结构式OOPOHO碱基碱基OOHOOPOHOOH碱基碱基5335碱基碱基碱基碱基脱氧核糖脱氧核糖脱氧核糖脱氧核糖磷酸基团磷酸基团磷酸基团磷酸基团碱基碱基碱基碱基脱氧核糖脱氧核糖脱氧核糖脱氧核糖碱基碱基碱基碱基脱氧核糖脱氧核糖脱氧核糖脱氧核糖53多脱氧核苷酸链结构简图多脱氧核苷酸链结构简图例题：甲例题：甲DNADNA分子中，分子中，A A和和T T占占2525，G G和和C C占占75%75%，乙，乙DNADNA分子中，分子中，GG和和C C占占2525，A A和和T T 占占75%75%，哪一个稳定？，哪一个稳定？答：甲答：甲DNADNA分子比乙分子比乙DNADNA分子稳定。因为分子稳定。因为A A与与T T之间形成两个氢键，之间形成两个氢键，在在GG和和C C之间形成三个氢之间形成三个氢键，键，三个氢键比两个氢键稳定，所以在三个氢键比两个氢键稳定，所以在DNADNA分分子中含有较多的子中含有较多的GGC C碱基对比含有较多的碱基对比含有较多的A AT T碱基稳定。碱基稳定。（二）（二）DNADNA的复制的复制2 2、时期、时期有丝分裂间期减数第一次分裂前的间期有丝分裂间期减数第一次分裂前的间期3 3、场所、场所细胞核（主）、线粒体、叶绿体细胞核（主）、线粒体、叶绿体4 4、模板、模板DNADNA母链母链1 1、概念、概念由一个由一个DNADNA形成两个完全相同的形成两个完全相同的DNADNA的过程的过程5 5、原材料、原材料脱氧核苷酸脱氧核苷酸6 6、基本条件、基本条件酶、酶、ATPATP、原料、模板、原料、模板7 7、复制特点、复制特点边解旋边复制边解旋边复制(过程）过程）半保留复制（结果）半保留复制（结果）8 8、遵循原则、遵循原则碱基互补配对原则碱基互补配对原则 PCR(PCR(多聚酶链式反应）多聚酶链式反应）1 1、DNADNA聚合酶聚合酶特性特性不能从头合成不能从头合成DNADNA，只能从，只能从DNADNA的的33端开始端开始延伸延伸DNADNA链，因此，链，因此，DNADNA复制需要引物复制需要引物2 2、DNADNA聚合酶聚合酶作用过程作用过程当引物与当引物与DNADNA母链通过碱基互补配对结合后，母链通过碱基互补配对结合后，DNADNA聚合酶就能从引物的聚合酶就能从引物的33端开始延伸端开始延伸DNADNA链，链，DNADNA的合成方向总是从子链的的合成方向总是从子链的55端向端向33端延伸。端延伸。高温解决了打开双链的问题，但是，高温解决了打开双链的问题，但是，又导致又导致DNADNA聚合酶失活的问题，耐高聚合酶失活的问题，耐高温的温的Taq DNATaq DNA聚合酶解决了高温导致聚合酶解决了高温导致DNADNA聚合酶失活的问题，促成了聚合酶失活的问题，促成了PCRPCR技术的自动化。技术的自动化。3 3、Taq DNATaq DNA聚合酶的应用聚合酶的应用4 4、PCRPCR原理原理在在8080100100C C的温度范围内，的温度范围内，DNADNA的双螺的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性变性当温度缓慢降低后，两条彼此分离的当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNADNA链链又会重新结合成双链又会重新结合成双链 PCR PCR利用了利用了DNADNA的热变性原理，通过控制温的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCRPCR仪仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器实质上也是一台能够自动调控温度的仪器（三）（三）PCRPCR的反应过程的反应过程1 1、PCRPCR的反应步骤的反应步骤PCRPCR一般经历三十多次循环，一般经历三十多次循环，每次循环可以每次循环可以分为三个基本步骤分为三个基本步骤变性、复性和延伸变性、复性和延伸变性（模板变性（模板DNADNA解旋）解旋）模板模板DNADNA经加热至经加热至90900 0C C以上以上。一定时间后，。一定时间后，使模板使模板DNADNA双链或经双链或经PCRPCR扩增形成的双链扩增形成的双链DNADNA解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备。下轮反应作准备。2 2、循环过程、循环过程靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列PCR PCR 循环第一步循环第一步 ：加热变性：加热变性复性（退火）复性（退火）模板模板DNADNA经加热变性成单链经加热变性成单链后，温度降到后，温度降到50500 0C C左右左右，引，引物与模板物与模板DNADNA单链的互补序单链的互补序列配对结合。列配对结合。靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列引物引物引物引物 引物引物引物引物 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 3 3 3 3 PCR PCR 循环第二步循环第二步 ：引物与靶序列退火：引物与靶序列退火延伸延伸 DNA DNA模板引物结合物在模板引物结合物在TaqDNATaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的与半保留复制的原理，合成一条新的DNADNA链链靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列靶序列引物引物引物引物引物引物引物引物5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 3 3 3 3 Taq DNATaq DNATaq DNATaq DNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶PCR PCR 循环第三步循环第三步 ：引物延伸：引物延伸靶序列靶序列靶序列靶序列 靶序列靶序列靶序列靶序列第第1 1个个 PCR PCR 循环完成后循环完成后 ：得到两个拷贝的：得到两个拷贝的靶序列靶序列 PCR PCR过程需要的引物不是过程需要的引物不是RNARNA，而是人工，而是人工合成的合成的DNADNA单链，其长度通常为单链，其长度通常为20203030个脱个脱氧核苷酸氧核苷酸3 3、细胞内复制和、细胞内复制和PCRPCR不同点不同点 PCR PCR过程中过程中DNADNA的解旋不依靠解旋酶，而是的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的通过对反应温度的控制来实现的 理论上理论上DNADNA扩增数目的计算扩增数目的计算二二、课题成果评价课题成果评价1 1、一条一条DNADNA，复制，复制n n次，次，DNADNA为为2 2 n n2 2、a a条条DNADNA，复制，复制n n次，次，DNADNA为为a x2 a x2 n n四、四、课题延伸课题延伸例如：例如：PCRPCR产物每轮循环增加一倍，产物每轮循环增加一倍，3030轮循轮循环扩增量达环扩增量达2 23030个拷贝。个拷贝。PCRPCR技术是技术是8080年代中期发展起来的体外核酸年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。扩增技术。它具有它具有特异、敏感、产率高、特异、敏感、产率高、快快速、速、简便、重复性好、易自动化简便、重复性好、易自动化等突出特点等突出特点三、实验小结三、实验小结 PCRPCR仪仪加加热热使使（）变变性性,复复性性使使引引物物与与模模板板DNADNA（）,延延伸伸需需将将反反应应温温度度升升至至中中温温(),),在在（）的的 作作 用用 下下,以以(）为为原原料料,以以（）为为复复制制的的起起点点,合合成成新新链链。如如此此重重复复改改变变反反应应温温度度,经经（）三三个个阶阶段段为为一一个个循循环环,每每一一次次循循环环使使特特异异区区段段的的基基因因拷拷贝贝数数放放大大一一倍倍,一一般般样样品品是是经经过过3030次次循循环环,最最终终使使基基因因放放大大了了数数百百万万倍倍;将将扩扩增增产产物物进进行行电电泳泳,经经溴溴化化乙乙锭锭染染色色,在在紫紫外外灯灯照照射射下下肉肉眼眼能能见见到到扩扩增增特异区段的特异区段的DNADNA带。带。模板模板互补互补TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸引物引物变性、复性和延伸变性、复性和延伸7272四四、PCR PCR 的实验操作的实验操作视频VCDVCD
