蛋白质和氨基酸的测.ppt

第八章第八章 蛋白质及氨基酸的测定蛋白质及氨基酸的测定第一节第一节 概述概述1.1.1.1.蛋白质的元素组成（蛋白质的元素组成（蛋白质的元素组成（蛋白质的元素组成（The elements of The elements of The elements of The elements of proteinproteinproteinprotein）C C C C：50-55%N50-55%N50-55%N50-55%N：15-18%O15-18%O15-18%O15-18%O：20-23%20-23%20-23%20-23%H H H H：6-8%S6-8%S6-8%S6-8%S：0-4%0-4%0-4%0-4%微量元素：微量元素：微量元素：微量元素：P P P P、FeFeFeFe、ZnZnZnZn、CuCuCuCu2 2 2 2、基本结构单位：氨基酸、基本结构单位：氨基酸、基本结构单位：氨基酸、基本结构单位：氨基酸3 3 3 3、蛋白质的变性作用。、蛋白质的变性作用。、蛋白质的变性作用。、蛋白质的变性作用。4、蛋白质分析的重要性生物活性测定生物活性测定生物活性测定生物活性测定功能性质调查功能性质调查功能性质调查功能性质调查营养标签营养标签营养标签营养标签 总蛋白质含量总蛋白质含量 氨基酸组成氨基酸组成 蛋白质的营养价值蛋白质的营养价值5、蛋白质的测定方法利用蛋白质共性的方法利用蛋白质共性的方法利用特定氨基酸残基法利用特定氨基酸残基法凯氏定氮法凯氏定氮法杜马斯法杜马斯法福林酚法福林酚法染色法染色法第二节 蛋白质的定性测定一、蛋白质的一般显色反应一、蛋白质的一般显色反应一、蛋白质的一般显色反应一、蛋白质的一般显色反应电电电电泳泳泳泳或或或或纸纸纸纸层层层层析析析析之之之之后后后后用用用用一一一一些些些些染染染染料料料料与与与与蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质结结结结合合合合并并并并变色。书中列举了变色。书中列举了变色。书中列举了变色。书中列举了 5 5 种染料。种染料。种染料。种染料。二、复合蛋白质的显色反应二、复合蛋白质的显色反应二、复合蛋白质的显色反应二、复合蛋白质的显色反应（一）糖蛋白的显色（一）糖蛋白的显色（一）糖蛋白的显色（一）糖蛋白的显色（3 3种方法）种方法）种方法）种方法）（二）脂蛋白的显色（二）脂蛋白的显色（二）脂蛋白的显色（二）脂蛋白的显色（2 2种方法）种方法）种方法）种方法）蛋白质的测定方法蛋白质的测定方法 1 1凯凯凯凯氏氏氏氏定定定定氮氮氮氮法法法法（18331833年年年年Kieldahl,Kieldahl,常常常常量量量量法法法法、微微微微量量量量法法法法、自自自自动动动动定氮仪、半微量法、改良凯氏定氮法）定氮仪、半微量法、改良凯氏定氮法）定氮仪、半微量法、改良凯氏定氮法）定氮仪、半微量法、改良凯氏定氮法）2 2 2 2双缩脲法双缩脲法双缩脲法双缩脲法 3 3福林酚（福林酚（福林酚（福林酚（LowryLowry）法）法）法）法 4 Bicinchoninic Acid 4 Bicinchoninic Acid 法法法法 5 280nm5 280nm紫外吸收法紫外吸收法紫外吸收法紫外吸收法 6 6染色法染色法染色法染色法 6.1 6.1阴离子染色法阴离子染色法阴离子染色法阴离子染色法 6.2 6.2布兰德福特（布兰德福特（布兰德福特（布兰德福特（BradfordBradford）法）法）法）法 7 7茚三酮法茚三酮法茚三酮法茚三酮法 8 8比浊法比浊法比浊法比浊法 9 9杜马斯法（燃烧法）杜马斯法（燃烧法）杜马斯法（燃烧法）杜马斯法（燃烧法）10 10 红外光谱法红外光谱法红外光谱法红外光谱法一、凯氏定氮法（常量）一、凯氏定氮法（常量）凯氏定氮法凯氏定氮法凯氏定氮法凯氏定氮法通过测出样品中的通过测出样品中的通过测出样品中的通过测出样品中的总含氮量总含氮量总含氮量总含氮量再乘以再乘以再乘以再乘以相应的蛋白质系数而求出蛋白质含量的，由于样相应的蛋白质系数而求出蛋白质含量的，由于样相应的蛋白质系数而求出蛋白质含量的，由于样相应的蛋白质系数而求出蛋白质含量的，由于样品中常含有少量非蛋白质含氮化合物，故此法的品中常含有少量非蛋白质含氮化合物，故此法的品中常含有少量非蛋白质含氮化合物，故此法的品中常含有少量非蛋白质含氮化合物，故此法的结果称为粗蛋白含量。结果称为粗蛋白含量。结果称为粗蛋白含量。结果称为粗蛋白含量。此外，双缩脲法、染料结合法、酚试剂法等此外，双缩脲法、染料结合法、酚试剂法等此外，双缩脲法、染料结合法、酚试剂法等此外，双缩脲法、染料结合法、酚试剂法等也常用于蛋白质含量测定，由于方法也常用于蛋白质含量测定，由于方法也常用于蛋白质含量测定，由于方法也常用于蛋白质含量测定，由于方法简便快速简便快速简便快速简便快速，故多用于生产单位质量控制分析。故多用于生产单位质量控制分析。故多用于生产单位质量控制分析。故多用于生产单位质量控制分析。原理原理样品与浓硫酸（氧化、脱水）和催化样品与浓硫酸（氧化、脱水）和催化剂（硫酸铜）一同加热消化，使蛋白剂（硫酸铜）一同加热消化，使蛋白质分解，其中质分解，其中C,H氧化为氧化为CO2 2和和H2 2O，有机有机N转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。加碱蒸馏时氨蒸出，用硼酸吸收后，加碱蒸馏时氨蒸出，用硼酸吸收后，再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。样品制备样品制备样品制备样品制备消化消化消化消化中和、蒸馏中和、蒸馏中和、蒸馏中和、蒸馏滴定滴定滴定滴定计算计算计算计算 利利利利用用用用换换换换算算算算系系系系数数数数可可可可以以以以把把把把氮氮氮氮的的的的百百百百分分分分含含含含量量量量转转转转化化化化成成成成样样样样品品品品粗粗粗粗蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质含含含含量量量量。由由由由于于于于大大大大部部部部分分分分蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质含含含含有有有有16%16%的的的的氮氮氮氮，所所所所以以以以其其其其换换换换算算算算系系系系数数数数一一一一般般般般为为为为6.256.25（100/16 100/16=6.256.25）。）。）。）。即：即：即：即：%N 6.25=%N 6.25=%蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质 蛋白质含量蛋白质含量 换算系数换算系数 蛋或肉蛋或肉 16.0 6.25 牛牛 奶奶 15.7 6.38 小小 麦麦 18.76 5.33 玉玉 米米 17.70 5.56 燕燕 麦麦 18.66 5.36 大大 豆豆 18.12 5.52 大大 米米 19.34 5.17 部分食品的蛋白质换算系数*在消化反应中在消化反应中,为了加速蛋白质的分解为了加速蛋白质的分解,缩短消化时间缩短消化时间,常加入下列物质常加入下列物质1 1 1 1）硫酸钾硫酸钾硫酸钾硫酸钾:提高溶液的沸点，加快有机物分解。它与硫酸作用生提高溶液的沸点，加快有机物分解。它与硫酸作用生提高溶液的沸点，加快有机物分解。它与硫酸作用生提高溶液的沸点，加快有机物分解。它与硫酸作用生成硫酸氢钾可提高反应温度，一般纯硫酸的沸点在成硫酸氢钾可提高反应温度，一般纯硫酸的沸点在成硫酸氢钾可提高反应温度，一般纯硫酸的沸点在成硫酸氢钾可提高反应温度，一般纯硫酸的沸点在340340340340左右左右左右左右,而添加硫酸钾后而添加硫酸钾后而添加硫酸钾后而添加硫酸钾后,可使温度提高至可使温度提高至可使温度提高至可使温度提高至400400400400以以以以上，原因主要在于随着消化过程中硫酸不断地被分解上，原因主要在于随着消化过程中硫酸不断地被分解上，原因主要在于随着消化过程中硫酸不断地被分解上，原因主要在于随着消化过程中硫酸不断地被分解,水分不断逸出而使硫酸钾浓度增大水分不断逸出而使硫酸钾浓度增大水分不断逸出而使硫酸钾浓度增大水分不断逸出而使硫酸钾浓度增大,故沸点升高故沸点升高故沸点升高故沸点升高,其反其反其反其反应式如下：应式如下：应式如下：应式如下：K K2 2SOSO4 4+H+H2 2SOSO4 4 2KHSO 2KHSO4 4 2KHSO 2KHSO4 4 K K2 2SOSO4 4+H+H2 2O+SOO+SO2 2硫酸钾加入量不能太大，否则消化体系温度过高，又会引起引起生成的铵盐发生热分解放出氨而造成损失。除硫酸钾外，也可以加入硫酸钠、氯化钾等盐类来提高沸点，但效果不如硫酸钾。（2 2）（催化剂、指示剂）硫酸铜 起催化剂的作用。使用时常加入少量过氧起催化剂的作用。使用时常加入少量过氧化氢、次氯酸钾等作为氧化剂以加速有机化氢、次氯酸钾等作为氧化剂以加速有机物氧化。物氧化。指示消化终点的到达，为清澈的蓝绿色。指示消化终点的到达，为清澈的蓝绿色。指示蒸馏时的碱加入量是否足够。指示蒸馏时的碱加入量是否足够。除硫酸铜外，还有氧化汞、汞、硒粉、二除硫酸铜外，还有氧化汞、汞、硒粉、二氧化钛等也可用的催化剂。氧化钛等也可用的催化剂。装置装置操作步骤消化消化消化消化 准确称取固体样品准确称取固体样品准确称取固体样品准确称取固体样品0.20.20.20.22g2g2g2g（半固体样品（半固体样品（半固体样品（半固体样品2 2 2 25g5g5g5g，液体样品液体样品液体样品液体样品1010101020ml20ml20ml20ml）移入凯氏烧瓶移入凯氏烧瓶移入凯氏烧瓶移入凯氏烧瓶加入研细加入研细加入研细加入研细的硫酸铜的硫酸铜的硫酸铜的硫酸铜0.5g0.5g0.5g0.5g、硫酸钾、硫酸钾、硫酸钾、硫酸钾10g10g10g10g和浓硫酸和浓硫酸和浓硫酸和浓硫酸20ml20ml20ml20ml摇匀摇匀摇匀摇匀安装消化装置安装消化装置安装消化装置安装消化装置于凯氏瓶口放一漏斗于凯氏瓶口放一漏斗于凯氏瓶口放一漏斗于凯氏瓶口放一漏斗以以以以45454545角角角角斜支于有小孔的石棉网上斜支于有小孔的石棉网上斜支于有小孔的石棉网上斜支于有小孔的石棉网上用电炉先以小火加热用电炉先以小火加热用电炉先以小火加热用电炉先以小火加热至内容物全部炭化，泡沫停止后至内容物全部炭化，泡沫停止后至内容物全部炭化，泡沫停止后至内容物全部炭化，泡沫停止后加大火力保持加大火力保持加大火力保持加大火力保持瓶内液体微沸瓶内液体微沸瓶内液体微沸瓶内液体微沸至液体变蓝绿色透明至液体变蓝绿色透明至液体变蓝绿色透明至液体变蓝绿色透明继续加热继续加热继续加热继续加热微沸微沸微沸微沸30303030分钟分钟分钟分钟冷却冷却冷却冷却 定容。定容。定容。定容。加入玻璃珠数粒以防蒸馏时暴沸。加入玻璃珠数粒以防蒸馏时暴沸。加入玻璃珠数粒以防蒸馏时暴沸。加入玻璃珠数粒以防蒸馏时暴沸。蒸馏 吸取吸取5mL5mL稀释后的消化液稀释后的消化液加入凯氏定加入凯氏定氮仪内氮仪内加加10mL40%10mL40%的氢氧化钠的氢氧化钠夹好漏斗夹好漏斗夹夹冷凝管下端插入吸收瓶液面下冷凝管下端插入吸收瓶液面下(瓶内预瓶内预先装入先装入10ml4%10ml4%硼酸溶液及混合指示剂硼酸溶液及混合指示剂)加热蒸馏至氨全部蒸出加热蒸馏至氨全部蒸出(由红变蓝后约由红变蓝后约1010分分钟钟)将冷凝管下端提离液面将冷凝管下端提离液面用蒸馏水用蒸馏水冲洗管口冲洗管口继续蒸馏继续蒸馏1 1分钟分钟加热。加热。滴定滴定 将上述吸收液用0.1000mol/L盐酸标准溶液直接滴定至由蓝色变为微红色微红色（用甲基（用甲基红溴甲酚绿混合指示剂）红溴甲酚绿混合指示剂）即为终点，同时作一试剂空白。计算计算Page 158 公式当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入冷却，加入30%30%过氧化氢过氧化氢过氧化氢过氧化氢2 23ml3ml后再继续消化。后再继续消化。一般消化至呈透明后，继续消化一般消化至呈透明后，继续消化3030分钟即可，分钟即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品，如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有机物如分解酸等时，需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液呈完全，消化液呈蓝色或浅绿色蓝色或浅绿色蓝色或浅绿色蓝色或浅绿色，但含铁量多时，但含铁量多时，呈较呈较深绿色深绿色深绿色深绿色。蒸馏装置不能漏气。蒸馏装置不能漏气。蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色蓝色蓝色蓝色不生成氢不生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。硼酸吸收液的温度不应超过40，否则对氨的吸收作用减弱而造成损失，此时可置于冷水浴中使用。蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面，清洗管口，再蒸1分钟后关掉热源，否则可能造成吸收液倒吸。二、自动凯氏定氮法 将将将将凯氏定氮装置组装成具有自动操作功能的凯氏定氮装置组装成具有自动操作功能的凯氏定氮装置组装成具有自动操作功能的凯氏定氮装置组装成具有自动操作功能的一套装置，原理与试剂同前。一套装置，原理与试剂同前。一套装置，原理与试剂同前。一套装置，原理与试剂同前。自动凯氏定氮仪：该装置内具有自动加碱蒸馏自动凯氏定氮仪：该装置内具有自动加碱蒸馏自动凯氏定氮仪：该装置内具有自动加碱蒸馏自动凯氏定氮仪：该装置内具有自动加碱蒸馏装置，自动吸收和滴定装置以及自动数字显示装置，自动吸收和滴定装置以及自动数字显示装置，自动吸收和滴定装置以及自动数字显示装置，自动吸收和滴定装置以及自动数字显示装置。装置。装置。装置。消化装置：由优质玻璃制成的凯氏消化瓶及红消化装置：由优质玻璃制成的凯氏消化瓶及红消化装置：由优质玻璃制成的凯氏消化瓶及红消化装置：由优质玻璃制成的凯氏消化瓶及红外线加热装置组合而成的消化炉。外线加热装置组合而成的消化炉。外线加热装置组合而成的消化炉。外线加热装置组合而成的消化炉。方法特点及应用范围灵敏灵敏准确准确快速快速样品用量少样品用量少三、微量凯氏定氮法三、微量凯氏定氮法原理及适用范围同常量凯氏定氮法主要仪器：凯氏烧瓶（100mL）；微量凯氏定氮仪试剂：0.01000mol/L HCl 标准液，其余同常量法Page 160蛋白质的快速测定双缩脲法蛋白质的快速测定双缩脲法原理方法特点及应用范围灵敏度较低，但操作简单快速，在生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法。适用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品的测定。也可定量测定分离纯化也可定量测定分离纯化后的蛋白质。后的蛋白质。步骤步骤标标准准曲曲线线的的绘绘制制：以以采采用用凯凯氏氏定定氮氮法法测测出出蛋蛋白白质质含含量量的的样样品品作作为为标标准准蛋蛋白白质质样样。按按蛋蛋白白质质含含量量 40mg40mg、50mg50mg、60mg60mg、70mg70mg、80mg80mg、90mg90mg、100mg100mg、110mg110mg分分别别称称取取混混合合均均匀匀的的标标准准蛋蛋白白质质样样于于8 8支支50ml50ml纳纳氏氏比比色色管管中中，然然后后各各加加入入1ml1ml四四氯氯化化碳碳，再再用用碱碱性性硫硫酸酸铜铜溶溶液液（或或）准准确确稀稀释释至至50ml50ml，振振摇摇1010分分钟钟，静静置置1 1小小时时，取取上上层层清清夜夜离离心心5 5分分钟钟，取取离离心心分分离离后后的的透透明明液液于于比比色色皿皿中中，在在560nm560nm波波长长下下以以蒸蒸馏馏水水作作参参比比液液调调节节仪仪器器零零点点并并测测定定各各溶溶液液的的吸吸光光度度A A，以以蛋蛋白白质质的的含含量量为为横横坐坐标标，吸吸光光度度A A为为纵纵坐坐标标绘绘制制标准曲线。标准曲线。样品的测定：准确称取用品适量（使得蛋白质含量在40110mg之间）于50mL纳氏比色管中，加1ml四氯化碳，按上述步骤显色后，在相同条件下测其吸光度A。用测得的A值在标准曲线上即可查得蛋白质mg数，进而由此求得蛋白质含量。优点：该该该该方方方方法法法法比比比比凯凯凯凯氏氏氏氏定定定定氮氮氮氮法法法法费费费费用用用用低低低低，速速速速度度度度快快快快（可可可可在在在在不不不不到到到到30min30min的的的的时时时时间间间间内内内内完完完完成成成成），是是是是分分分分析析析析蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质最最最最简简简简单单单单的的的的方方方方法。法。法。法。比比比比福福福福林林林林酚酚酚酚法法法法、紫紫紫紫外外外外吸吸吸吸收收收收法法法法或或或或比比比比浊浊浊浊法法法法更更更更少少少少发发发发生生生生颜颜颜颜色色色色偏离。偏离。偏离。偏离。几乎没有物质干扰食品中蛋白质的双缩脲反应。几乎没有物质干扰食品中蛋白质的双缩脲反应。几乎没有物质干扰食品中蛋白质的双缩脲反应。几乎没有物质干扰食品中蛋白质的双缩脲反应。不包含非多肽或非蛋白质来源的氮。不包含非多肽或非蛋白质来源的氮。不包含非多肽或非蛋白质来源的氮。不包含非多肽或非蛋白质来源的氮。缺点：不不不不如如如如福福福福林林林林酚酚酚酚法法法法灵灵灵灵敏敏敏敏，分分分分析析析析时时时时至至至至少少少少需需需需要要要要24mg24mg蛋蛋蛋蛋白质。白质。白质。白质。如果存在胆汁素，则吸光度会虚假增加。如果存在胆汁素，则吸光度会虚假增加。如果存在胆汁素，则吸光度会虚假增加。如果存在胆汁素，则吸光度会虚假增加。高浓度的胺盐会干扰反应。高浓度的胺盐会干扰反应。高浓度的胺盐会干扰反应。高浓度的胺盐会干扰反应。不不不不同同同同蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质其其其其最最最最终终终终反反反反应应应应产产产产物物物物的的的的颜颜颜颜色色色色不不不不同同同同，例例例例如如如如明胶的双缩脲反应产生红紫色。明胶的双缩脲反应产生红紫色。明胶的双缩脲反应产生红紫色。明胶的双缩脲反应产生红紫色。如如如如果果果果有有有有高高高高浓浓浓浓度度度度的的的的脂脂脂脂（用用用用醚醚醚醚抽抽抽抽出出出出）或或或或碳碳碳碳水水水水化化化化合合合合物物物物存在时，最终的反应溶液中可能会呈乳白色。存在时，最终的反应溶液中可能会呈乳白色。存在时，最终的反应溶液中可能会呈乳白色。存在时，最终的反应溶液中可能会呈乳白色。此此此此方方方方法法法法不不不不是是是是一一一一个个个个测测测测量量量量绝绝绝绝对对对对值值值值的的的的方方方方法法法法，必必必必须须须须用用用用已已已已知知知知浓浓浓浓度度度度的的的的蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质（如如如如BSABSA）或或或或经经经经凯凯凯凯氏氏氏氏定定定定氮氮氮氮法法法法校校校校正。正。正。正。三、福林酚（Lowry）法原理原理蛋白质与福林酚试剂反应，生成的蓝色复合物。蛋白质与福林酚试剂反应，生成的蓝色复合物。蛋白质与福林酚试剂反应，生成的蓝色复合物。蛋白质与福林酚试剂反应，生成的蓝色复合物。其中蛋白质中的其中蛋白质中的其中蛋白质中的其中蛋白质中的肽键与碱性铜离子反应形成双缩肽键与碱性铜离子反应形成双缩肽键与碱性铜离子反应形成双缩肽键与碱性铜离子反应形成双缩脲反应脲反应脲反应脲反应，同时蛋白质中存在的酪氨酸和色氨酸同，同时蛋白质中存在的酪氨酸和色氨酸同，同时蛋白质中存在的酪氨酸和色氨酸同，同时蛋白质中存在的酪氨酸和色氨酸同磷钼酸磷钼酸磷钼酸磷钼酸-磷钨酸试剂反应产生颜色，蛋白质浓度与磷钨酸试剂反应产生颜色，蛋白质浓度与磷钨酸试剂反应产生颜色，蛋白质浓度与磷钨酸试剂反应产生颜色，蛋白质浓度与吸光度有较好的线性关系。吸光度有较好的线性关系。吸光度有较好的线性关系。吸光度有较好的线性关系。优点因因因因为为为为福福福福林林林林酚酚酚酚法法法法简简简简单单单单、灵灵灵灵敏敏敏敏，已已已已被被被被广广广广泛泛泛泛应应应应用用用用于于于于蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质的的的的生生生生物物物物化化化化学学学学中中中中。然然然然而而而而，一一一一般般般般不不不不用用用用于于于于测测测测定定定定未未未未从食品混合物中纯化的蛋白质。从食品混合物中纯化的蛋白质。从食品混合物中纯化的蛋白质。从食品混合物中纯化的蛋白质。1 1非常非常非常非常灵敏灵敏灵敏灵敏：A:A:较双缩脲法灵敏较双缩脲法灵敏较双缩脲法灵敏较双缩脲法灵敏5010050100倍。倍。倍。倍。B B：较：较：较：较280nm280nm紫外吸收法灵敏紫外吸收法灵敏紫外吸收法灵敏紫外吸收法灵敏10201020倍。倍。倍。倍。C C：较茚三酮法灵敏好几倍。：较茚三酮法灵敏好几倍。：较茚三酮法灵敏好几倍。：较茚三酮法灵敏好几倍。D D：与奈斯勒方法的灵敏度相似，但操作比其方便。：与奈斯勒方法的灵敏度相似，但操作比其方便。：与奈斯勒方法的灵敏度相似，但操作比其方便。：与奈斯勒方法的灵敏度相似，但操作比其方便。2 2测定结果较少受到样品混浊度的影响。测定结果较少受到样品混浊度的影响。测定结果较少受到样品混浊度的影响。测定结果较少受到样品混浊度的影响。3 3特异性特异性特异性特异性要高于其他大多数方法。要高于其他大多数方法。要高于其他大多数方法。要高于其他大多数方法。4 4操作相对简单，可以在操作相对简单，可以在操作相对简单，可以在操作相对简单，可以在11.511.5小时内完成。小时内完成。小时内完成。小时内完成。缺点 由由由由于于于于下下下下列列列列因因因因素素素素，福福福福林林林林酚酚酚酚法法法法在在在在某某某某些些些些应应应应用用用用中中中中需需需需采采采采用用用用标标标标准准准准曲曲曲曲线线线线进进进进行校正。行校正。行校正。行校正。1 1反反反反应应应应产产产产生生生生的的的的颜颜颜颜色色色色比比比比双双双双缩缩缩缩脲脲脲脲法法法法更更更更易易易易因因因因蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质的的的的种种种种类类类类不不不不同同同同而而而而发发发发生变化。生变化。生变化。生变化。2 2反应最终的颜色深浅并不直接与蛋白质浓度成正比。反应最终的颜色深浅并不直接与蛋白质浓度成正比。反应最终的颜色深浅并不直接与蛋白质浓度成正比。反应最终的颜色深浅并不直接与蛋白质浓度成正比。3 3蔗蔗蔗蔗糖糖糖糖、脂脂脂脂类类类类、磷磷磷磷酸酸酸酸盐盐盐盐缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液、单单单单糖糖糖糖和和和和己己己己胺胺胺胺会会会会不不不不同同同同程程程程度度度度的的的的干扰反应。干扰反应。干扰反应。干扰反应。4.4.4.4.高浓度的还原糖、硫酸铵和巯基化合物会干扰反应。高浓度的还原糖、硫酸铵和巯基化合物会干扰反应。高浓度的还原糖、硫酸铵和巯基化合物会干扰反应。高浓度的还原糖、硫酸铵和巯基化合物会干扰反应。四、紫外吸收法原理原理蛋白质在蛋白质在UV280nmUV280nm处有强烈吸收，这是由于处有强烈吸收，这是由于蛋白质中蛋白质中有色氨酸和酪氨酸等芳香环残基有色氨酸和酪氨酸等芳香环残基存在存在。由于存在于每一种食品的蛋白质中。由于存在于每一种食品的蛋白质中色氨酸和酪氨酸的含量相当恒定，所以可色氨酸和酪氨酸的含量相当恒定，所以可用比色法，即在用比色法，即在280nm280nm处比色测定蛋白质的处比色测定蛋白质的浓度。浓度。适用范围应用应用应用应用简便迅速，常用于生物化学研究工作，但由于许简便迅速，常用于生物化学研究工作，但由于许简便迅速，常用于生物化学研究工作，但由于许简便迅速，常用于生物化学研究工作，但由于许多非蛋白成分在紫外光区也有吸收作用，故还没多非蛋白成分在紫外光区也有吸收作用，故还没多非蛋白成分在紫外光区也有吸收作用，故还没多非蛋白成分在紫外光区也有吸收作用，故还没有广泛应用于食品体系。有广泛应用于食品体系。有广泛应用于食品体系。有广泛应用于食品体系。已经用于测定牛奶和肉制品中蛋白质的含量，但已经用于测定牛奶和肉制品中蛋白质的含量，但已经用于测定牛奶和肉制品中蛋白质的含量，但已经用于测定牛奶和肉制品中蛋白质的含量，但此法此法此法此法更适用于纯化的蛋白质体系、已经抽提在碱更适用于纯化的蛋白质体系、已经抽提在碱更适用于纯化的蛋白质体系、已经抽提在碱更适用于纯化的蛋白质体系、已经抽提在碱液或变性剂（如液或变性剂（如液或变性剂（如液或变性剂（如8M8M8M8M尿素）中的蛋白质测定尿素）中的蛋白质测定尿素）中的蛋白质测定尿素）中的蛋白质测定。尽管。尽管。尽管。尽管蛋白质中的肽键在蛋白质中的肽键在蛋白质中的肽键在蛋白质中的肽键在190nm190nm190nm190nm220nm220nm处的紫外吸收比在处的紫外吸收比在处的紫外吸收比在处的紫外吸收比在280nm280nm更强，但在低紫外区域的测定更困难。更强，但在低紫外区域的测定更困难。更强，但在低紫外区域的测定更困难。更强，但在低紫外区域的测定更困难。优点快快速速，相相对对较较灵灵敏敏（在在280nm处处需需要要100ug或更多的蛋白质，比双缩脲法灵敏数倍）。或更多的蛋白质，比双缩脲法灵敏数倍）。反应不受硫酸铵和其它缓冲液的干扰。反应不受硫酸铵和其它缓冲液的干扰。不不破破坏坏样样品品原原有有的的性性质质，在在测测定定完完蛋蛋白白质质含含量量后后仍仍然然可可用用于于其其它它分分析析。广广泛泛用用于于层层析柱分离后的蛋白质测定。析柱分离后的蛋白质测定。缺点核核核核酸酸酸酸在在在在280nm280nm处处处处也也也也有有有有紫紫紫紫外外外外吸吸吸吸收收收收，纯纯纯纯蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质和和和和纯纯纯纯核核核核酸酸酸酸的的的的280nm/260nm280nm/260nm紫紫紫紫外外外外吸吸吸吸收收收收比比比比分分分分别别别别为为为为1.751.75和和和和0.50.5。如如如如果果果果知知知知道道道道280nm/260nm280nm/260nm的的的的值值值值，就就就就能能能能校校校校正正正正核核核核酸在酸在酸在酸在280nm280nm处的吸收值。处的吸收值。处的吸收值。处的吸收值。不不不不同同同同种种种种类类类类食食食食品品品品的的的的蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质中中中中，芳芳芳芳香香香香族族族族氨氨氨氨基基基基酸酸酸酸的的的的含含含含量明显不同。量明显不同。量明显不同。量明显不同。样品溶液必须纯净无色。样品溶液必须纯净无色。样品溶液必须纯净无色。样品溶液必须纯净无色。此法适用于相对纯净的体系。此法适用于相对纯净的体系。此法适用于相对纯净的体系。此法适用于相对纯净的体系。Bicinchoninic Acid(BCA)法法原理原理 SmithSmith等人提出等人提出,在碱性条件下蛋白质在碱性条件下蛋白质将铜离子还原成亚铜离子，将铜离子还原成亚铜离子，亚铜离子亚铜离子-蛋白蛋白质复合物和苹果绿的质复合物和苹果绿的BCABCA试剂反应形成浅紫试剂反应形成浅紫色色。反应形成颜色的深浅与蛋白质浓度成。反应形成颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。正比。Bicinchoninic Acid(BCA)法法 方法方法方法方法1 1 蛋蛋蛋蛋 白白白白 质质质质 溶溶溶溶 液液液液 和和和和 含含含含 有有有有 BCABCA钠钠钠钠 盐盐盐盐、NaNa2 2COCO3 3、NaOHNaOH、CuSOCuSO4 4、pH11.25pH11.25的的的的BCABCA试剂一步混合。试剂一步混合。试剂一步混合。试剂一步混合。2 2在在在在3737保保保保温温温温30min30min或或或或室室室室温温温温下下下下放放放放置置置置2hr,2hr,或或或或6060保保保保温温温温30min30min。温温温温度度度度的的的的选选选选择择择择取取取取决决决决于于于于灵灵灵灵敏敏敏敏度度度度的的的的要要要要求求求求。较较较较高高高高的的的的温度导致较深的颜色反应。温度导致较深的颜色反应。温度导致较深的颜色反应。温度导致较深的颜色反应。3 3在在在在562nm562nm处比色读数，并做空白比较。处比色读数，并做空白比较。处比色读数，并做空白比较。处比色读数，并做空白比较。4.4.4.4.用用用用BSABSABSABSA作标准曲线。作标准曲线。作标准曲线。作标准曲线。Bicinchoninic Acid(BCA)法法优点 BCABCA法法法法已已已已经经经经应应应应用用用用于于于于蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质的的的的分分分分离离离离和和和和纯纯纯纯化化化化中中中中。此此此此法法法法对对对对测定复杂食品体系中蛋白质的适用性还未见报道。测定复杂食品体系中蛋白质的适用性还未见报道。测定复杂食品体系中蛋白质的适用性还未见报道。测定复杂食品体系中蛋白质的适用性还未见报道。1 1灵灵灵灵敏敏敏敏度度度度与与与与福福福福林林林林酚酚酚酚法法法法相相相相似似似似。微微微微量量量量BCABCA法法法法的的的的灵灵灵灵敏敏敏敏度度度度（0.510ug0.510ug）稍高于福林酚法。）稍高于福林酚法。）稍高于福林酚法。）稍高于福林酚法。2 2一步混合的操作比福林酚法更简单。一步混合的操作比福林酚法更简单。一步混合的操作比福林酚法更简单。一步混合的操作比福林酚法更简单。3 3所用试剂比福林酚法简单。所用试剂比福林酚法简单。所用试剂比福林酚法简单。所用试剂比福林酚法简单。4 4非离子型表面活性剂和缓冲液不对反应产生干扰。非离子型表面活性剂和缓冲液不对反应产生干扰。非离子型表面活性剂和缓冲液不对反应产生干扰。非离子型表面活性剂和缓冲液不对反应产生干扰。5 5中中中中等等等等浓浓浓浓度度度度的的的的变变变变性性性性剂剂剂剂（4M4M盐盐盐盐酸酸酸酸胍胍胍胍或或或或3M3M尿尿尿尿素素素素）不不不不对对对对反反反反应产生干扰。应产生干扰。应产生干扰。应产生干扰。Bicinchoninic Acid(BCA)法法 缺点：缺点：缺点：缺点：1 1反应产生的颜色不稳定，需要仔细地控制比色时间。反应产生的颜色不稳定，需要仔细地控制比色时间。反应产生的颜色不稳定，需要仔细地控制比色时间。反应产生的颜色不稳定，需要仔细地控制比色时间。2 2还原糖会对此反应产生的干扰比对福林酚法更大。还原糖会对此反应产生的干扰比对福林酚法更大。还原糖会对此反应产生的干扰比对福林酚法更大。还原糖会对此反应产生的干扰比对福林酚法更大。3 3不同蛋白质反应引起的颜色变化与福林酚法相似。不同蛋白质反应引起的颜色变化与福林酚法相似。不同蛋白质反应引起的颜色变化与福林酚法相似。不同蛋白质反应引起的颜色变化与福林酚法相似。4 4比色的吸光度与蛋白质浓度不成线性关系。比色的吸光度与蛋白质浓度不成线性关系。比色的吸光度与蛋白质浓度不成线性关系。比色的吸光度与蛋白质浓度不成线性关系。阴离子染色法原理原理原理原理含含含含蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质的的的的样样样样品品品品溶溶溶溶于于于于缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液中中中中和和和和已已已已知知知知的的的的过过过过量量量量阴阴阴阴离离离离子子子子染染染染色色色色剂剂剂剂混混混混和和和和，蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质与与与与染染染染色色色色剂剂剂剂形形形形成成成成不不不不溶溶溶溶性性性性复复复复合合合合物物物物。反反反反应应应应平平平平衡衡衡衡后后后后，离离离离心心心心或或或或过过过过滤滤滤滤除除除除去去去去不不不不溶溶溶溶性性性性的的的的复复复复合合合合物，再测定溶液中未结合的可溶性染色剂。物，再测定溶液中未结合的可溶性染色剂。物，再测定溶液中未结合的可溶性染色剂。物，再测定溶液中未结合的可溶性染色剂。蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质 +过过过过量量量量染染染染色色色色剂剂剂剂 蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质-染染染染色色色色剂剂剂剂复复复复合合合合不不不不溶物溶物溶物溶物+未结合可溶性染色剂未结合可溶性染色剂未结合可溶性染色剂未结合可溶性染色剂 阴阴阴阴离离离离子子子子磺磺磺磺酸酸酸酸基基基基染染染染色色色色剂剂剂剂，包包包包括括括括酸酸酸酸性性性性十十十十二二二二号号号号橙橙橙橙，橙橙橙橙G G G G和和和和酰酰酰酰黑黑黑黑10B10B10B10B，都都都都可可可可以以以以和和和和基基基基本本本本氨氨氨氨基基基基酸酸酸酸残残残残基基基基中中中中的的的的阳阳阳阳性性性性基基基基团团团团（组组组组氨氨氨氨酸酸酸酸中中中中的的的的咪咪咪咪唑唑唑唑基基基基、精精精精氨氨氨氨酸酸酸酸中中中中的的的的胍胍胍胍基基基基和和和和赖赖赖赖氨氨氨氨酸酸酸酸中中中中的的的的-氨氨氨氨基基基基等等等等），以以以以及及及及蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质中中中中游游游游离离离离的的的的氨氨氨氨基基基基酸酸酸酸终终终终端基团结合端基团结合端基团结合端基团结合.未未未未结结结结合合合合的的的的染染染染色色色色剂剂剂剂与与与与样样样样品品品品中中中中蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质的的的的含含含含量量量量成成成成反反反反比比比比,可可可可用分光光度计法测定。用分光光度计法测定。用分光光度计法测定。用分光光度计法测定。方法 1 1样品粉碎（样品粉碎（样品粉碎（样品粉碎（6060目或更小），加入过量的染色剂目或更小），加入过量的染色剂目或更小），加入过量的染色剂目或更小），加入过量的染色剂 。2 2剧剧剧剧烈烈烈烈摇摇摇摇晃晃晃晃内内内内容容容容物物物物加加加加速速速速染染染染色色色色反反反反应应应应至至至至平平平平衡衡衡衡，过过过过滤滤滤滤或或或或离离离离心心心心去去去去除不溶物。除不溶物。除不溶物。除不溶物。3 3测测测测定定定定滤滤滤滤液液液液中中中中未未未未结结结结合合合合染染染染色色色色剂剂剂剂溶溶溶溶液液液液的的的的吸吸吸吸光光光光度度度度，从从从从标标标标准准准准曲曲曲曲线线线线中计算染色剂浓度。中计算染色剂浓度。中计算染色剂浓度。中计算染色剂浓度。4 4通通通通过过过过对对对对未未未未结结结结合合合合染染染染色色色色剂剂剂剂浓浓浓浓度度度度与与与与样样样样品品品品的的的的蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质总总总总氮氮氮氮含含含含量量量量作作作作图，得到一条线性的标准曲线。图，得到一条线性的标准曲线。图，得到一条线性的标准曲线。图，得到一条线性的标准曲线。5 5与与与与样样样样品品品品同同同同类类类类的的的的未未未未知知知知样样样样品品品品的的的的蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质含含含含量量量量可可可可以以以以根根根根据据据据标标标标准准准准曲曲曲曲线计算，或通过最小二乘法得到的回归方程计算。线计算，或通过最小二乘法得到的回归方程计算。线计算，或通过最小二乘法得到的回归方程计算。线计算，或通过最小二乘法得到的回归方程计算。应用阴阴阴阴离离离离子子子子染染染染色色色色法法法法已已已已经经经经用用用用来来来来测测测测定定定定牛牛牛牛奶奶奶奶及及及及乳乳乳乳制制制制品品品品、小小小小麦面粉、大豆制品和肉制品中的蛋白质。麦面粉、大豆制品和肉制品中的蛋白质。麦面粉、大豆制品和肉制品中的蛋白质。麦面粉、大豆制品和肉制品中的蛋白质。AOACAOAC中中中中共共共共有有有有二二二二种种种种染染染染色色色色方方方方法法法法（使使使使用用用用酸酸酸酸性性性性1212号号号号橙橙橙橙的的的的方方方方法法法法967.12967.12和和和和使使使使用用用用酰酰酰酰胺胺胺胺黑黑黑黑10B10B的的的的方方方方法法法法975.17975.17）分析牛奶中的蛋白质。分析牛奶中的蛋白质。分析牛奶中的蛋白质。分析牛奶中的蛋白质。优点快快快快速速速速（10min10min或或或或更更更更短短短短），费费费费用用用用便便便便宜宜宜宜，结结结结果果果果相相相相对对对对比比比比较较较较准确。准确。准确。准确。因因因因为为为为染染染染色色色色剂剂剂剂不不不不与与与与不不不不可可可可利利利利用用用用的的的的赖赖赖赖氨氨氨氨酸酸酸酸结结结结合合合合，因因因因此此此此可可可可用用用用于于于于测测测测定定定定谷谷谷谷物物物物产产产产品品品品在在在在加加加加工工工工过过过过程程程程可可可可利利利利用用用用赖赖赖赖氨氨氨氨酸酸酸酸的的的的含含含含量量量量，（而而而而赖赖赖赖氨氨氨氨酸酸酸酸是是是是谷谷谷谷物物物物产产产产品品品品中中中中的的的的限限限限制制制制氨氨氨氨基基基基酸酸酸酸，所所所所以以以以可可可可利利利利用用用用赖赖赖赖氨氨氨氨酸酸酸酸含含含含量量量量代代代代表表表表谷谷谷谷物物物物产产产产品品品品的的的的蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质营营营营养养养养价值。）价值。）价值。）价值。）不用腐蚀性试剂不用腐蚀性试剂不用腐蚀性试剂不用腐蚀性试剂 。不需测定非蛋白氮。不需测定非蛋白氮。不需测定非蛋白氮。不需测定非蛋白氮。缺点灵敏度低灵敏度低，需要毫克级的蛋白质。，需要毫克级的蛋白质。蛋蛋白白质质因因基基本本氨