流式细胞仪讲义.ppt

流式细胞术实验结果的质控获得流式细胞术实验结果必须经历以一下步骤：1、检测样本的获得2、抗体染色与洗涤3、流式细胞仪对样本的采集、存取与分析 影响流式细胞术实验结果的主要因数:一、仪器的可变性。二、标本的可变性。三、操作过程的可变性。四、数据分析的可变性1、流式细胞仪需要质控的部件a、激发光路：（激光器、棱镜、透镜）b、发射光路：（透镜组合滤片）c、电子线路：（光检测器、高压供给器、放大器、补偿线路、模数转换器）d、流路系统：（流动室、样品流、进样针、鞘液流）一、仪器的可变性。PMTPMTPMTPMTDichroicFiltersBandpassFiltersLaser 1234流式细胞仪的液流系统Injector TipFluorescence Fluorescencesignals signalsFocused laser Focused laserbeam beamSheath fluid2、控制流式细胞仪可变性的具体步骤：A、校正激发、发射光路B、监控检测器的灵敏度(cv)C、监控仪器电子线路的稳定性二、标本的可变性1、标本的采集和固定方法的质控2、单细胞悬液制备的质控3、石蜡包埋组织单细胞制备的质控4、脱落细胞样品的采集的质控1、标本的采集和固定方法的质控A、取手术切除新鲜标本或活检针吸标本时，避免出血或取材坏死组织。B、标本采集后要及时固定C、固定剂的浓度：以对组织细胞穿透性强的为佳2、单细胞悬液制备的质控1、没有连结装组织：培养细胞、血液、骨髓等2、新鲜实体组织：（酶学、化学、机械方法）3、石蜡包埋组织：（切片厚度、脱蜡、水化、单细胞制备）4、脱落细胞样本的采集：（杂质、团块、重叠 细胞少于2%，）三、操作（试剂方法）过程的可变性1、温度对荧光染色强度的影响（温度淬灭）2、荧光燃料浓度与荧光强度的关系（浓度淬灭）3、PH 值对荧光强度的影响4、其他一些影响荧光强度的因数（醛类固定剂、溶剂中不发光物质如：卤化物、氨基酸、铁 等）四、数据分析的可变性1、设门2、阴、阳细胞的分界线实验条件对流式细胞术分析结果的影响1、低渗处理2、未固定细胞样品染色后存放时间3、设门A、设一个门分析多种参数B、设多个门分析某一种参数4、在DNA 含量分析时（二联体细胞）1、低渗处理低渗处理前正常外周血细胞DNA 直方图低渗处理5H 后正常外周血细胞DNA 直方图G0/1 峰左侧有明显细胞碎片峰2、未固定细胞样品染色后存放时间染色后立即检测样品染色后置40C5H 后检测样品3、设门 A、设一个门分析多种参数散射光图（R1 设定细胞为淋巴细胞）左上限：CD3-/CD(16+56)+荧光标记：FL1:CD3-FITC,FL2:CD(16-56-PE)右限：CD(16+56)+细胞（少）右限：CD3+细胞（多）荧光标记：FL1:CD3-FITC,FL2:CD(16-56-PE)B、设多个门分析某一种参数荧光标记：FL1:CD3-FITC,FL2:CD(16-56-PE)荧光标记：FL1:CD3-FITC,FL2:CD(16-56-PE)荧光标记：FL1:CD71.177B、设联动门分析某些参数4、二联体细胞对DNA 含量分析的影响鉴别DNA 直方图中凋亡细胞与DNA 异倍体G0/1 期细胞峰在DNA 直方图上，靠近二倍体G0/1期细胞峰前出现一个亚峰二倍体细胞峰，它是DNA 异倍体细胞峰，还是凋亡峰？可用半胱氨酸蛋白酶3 与样品细胞作用后，当半胱氨酸蛋白酶3+率增高时，该细胞峰为凋亡峰，当半胱氨酸蛋白酶3+率很低时，该细胞峰可能是低DNA 二倍体的异倍体细胞G0/1期细胞峰.在DNA 直方图中鉴别细胞增殖(SPF)与DNA 异倍体G0/1细胞峰在DNA 直方图上，二倍体G0/1细胞出现右肩峰时，先对DNA 直方图作二倍体周期分析，若SPF 比率与CD71+细胞检出率接近时，则该细胞峰为增殖细胞，若SPF比率显著高于CD71+细胞检出率时，则该右肩峰可能为DNA 异倍体细G0/1峰。在DNA 直方图上细胞凋亡和细胞坏死比较分析谢谢!