基因芯片技术在肿瘤细胞基因表达模式及肿瘤相关基因发掘中的作用(共4页).doc

精选优质文档-倾情为你奉上基因芯片技术在肿瘤细胞基因表达模式及肿瘤相关基因发掘中的作用肿瘤是一种进行性的多基因紊乱性疾病，恶性肿瘤严重威胁着人类健康。为探清肿瘤发生的分子生物学机制对其生物学行为的研究，无论对肿瘤的早期诊断还是有效治疗，都将带来彻底改观。应用一些基因寻找策略如差异显示聚合酶链反应(PCR)技术，代表性差异分析(RDA)等虽为发现新的功能基因提供了一些线索，但还有相当的局限性。基因芯片技术是伴随着人类基因组计划实施而出现的将PCR技术，计算机科学，核技术，物理学，数学等学科的多种理论和技术有机结合而发展起来的新的基因分析技术，它可从疾病及药物两角度对生物体的多个参量同时进行研究，以发掘筛选靶标即疾病相关分子，同时获取大量其它相关信息。因此这种集成化分析技术对肿瘤生物学研究具有极大优势。 基因芯片技术的概念及其分类 一、 概念 基因芯片又称DNA芯片(DNA chips)或探针微阵列(Probe microarray)，它是将成千上万个寡核昔酸探针固定在约厘米大小的硅片上，或直接在硅片上原位合成寡核营酸探针，然后将待研究的材料如DNA、RNA或cDNA用荧光素或同位素标记，在DNA芯片上与探针杂交，通过激光共聚焦显微镜对芯片进行扫描，获取杂交探针的荧光信号，再经计算机比较分析荧光信号强度和分布模式图，从而得到所需的信息。 二、 分类 目前基因芯片可分为两类:寡核昔酸芯片:用照相平版印刷技术和固相合成术结合在基片上生成寡核昔酸。CDNA芯片:将特定的或文库的eDNA经PCR扩增后用机械手点到基片上。DNA芯片的突出特点是不仅可以准确的确定突变位点及突变类型，尤其是它可以同时检测成千上万个基因及整个基因组的所有突变，是对传统突变检测技术的一次重大突破囚。可应用于DNA测序，转录情况分析，基因诊断与基因药物设计，突变及多态性检测遗传作图等多方面的研究。 基因芯片应用于肿瘤的研究 一、 肿瘤基因表达水平的检测 基因芯片应用于基因表达水平检测的优势在于它可同时自动快速检测待测材料中成千上万个不同基因的表达情况。Derisi等将人6号染色体导人人黑色素瘤细胞株(UACC一903)，发现肿瘤细胞的生长速率下降，细胞间的接触抑制恢复，软琼脂肿瘤细胞克隆形成率下降，对裸鼠的致瘤性减低，他们应用1161个分别代表肿瘤抑制基因和分化基因的cDNA微阵列来探索与肿瘤抑制相关基因的不同表达，发现介导p53基因的WAFI(p21)基因在处理组细胞(UACC一903/6)表达升高，而对照组(UACC一903)抑制，人褐色斑蛋白基因仅在对照细胞中有表达，差异表达的结果为研究该肿瘤发生的分子机制提供了重要依据。 二、 肿瘤基因突变及多态性检测检测 基因突变多态性的常规方法有PCR，异源双链分析(HDA)，变性高效液相色谱(DHPLC)，蛋白截短等。这些方法都需要经电泳分析，不利于大规模自动化的要求。而基因芯片方法可克服这些不足. 三、 寻找相关基因行基因诊断及基因药物设计 用cDNA微阵列技术，比较细胞间基因表达谱的差异，可发现未知肿瘤相关基因从而得出病变的DNA信息，进行基因诊断，可针对病变的靶序列设计相应的药物来改变靶序列的表达情况。 在肿瘤生长过程中最严重的破坏性变化是由局部生长转变为转移杀手，肿瘤的这种转变被认为需要大量的分子学改变来完成这种复杂的生物学行为，参与这一事件的基因报道尚少，Clark等困应用DNA微阵列来分析体内具有高度转移性的黑色素细胞瘤，确定了几种与肿瘤转移表型相关的基因表达。特别是几种参与细胞外基质积聚的基因表达增强，这些基因之一小分子GTPase RhoC过度表达时可增强肿瘤的转移性，而无优势区的Rho抑制转移，对优势区有无Rho和RhoC表达的研究表明，Rh0C对肿瘤的侵袭性很重要。此种基因谱分析可以确定参与肿瘤侵袭过程的家族，而不仅仅是一个基因，从而从分子学和细胞学水平来分析转移这一复杂的分子生物学行为。 四、 用于有效药物的筛选和药物治疗效果的评价 基因芯片不仅可用于比较正常及肿瘤组织基因表达的差异用于病因学研究，而且还可用于比较经阳性药物处理前后组织细胞基因表达的变化情况，可提供许多有价值的信息。首先，经药物处理后表达明显改变的基因往往与发病过程及药物作用途径密切相关，很可能是药物作用的靶点或继发事件，可作为进一步药物筛选的靶标或对已有的靶标进行验证阴。其次，药物处理后细胞基因表达的改变对药物作用机理的研究有一定的提示作用;最后，观察药物处理后细胞基因表达谱的改变可使研究者对药物的毒性及代谢特点等有一大致估计，有利于下一步工作的进行。 基因芯片技术应用于卵巢肿瘤的研究 随着卵巢癌遗传和分子生物学迅速发展，目前认为卵巢癌的发生是遗传物质突变逐渐积累而成。卵巢癌细胞通常有癌基因过度表达，抑癌基因失活及耐药性产生等格点。基因芯片技术由于其检测的靶分子种类多，可能成为监测卵巢癌的敏感指标。 一、 检测突变 Wen等8用寡核昔酸芯片和常规DNA序列分析方法检测108例卵巢癌介53的突变，两种方法共检出77例突变，71例由微阵列检出，63例由DNA序列检出。两种方法检出57例有同样的突变，31例有同样的野生型介53序列，检出一致率为81%，14例被寡核昔酸芯片检出而未被常规DNA序列分析法检出;6例被常规DNA序列分析法检出而未被寡核昔酸微阵列检出。寡核昔酸微阵列检测突变的准确率、敏感性、特异性分别为94%，92%，100%，而常规DNA序列分析法为87%，82%，roo%。还发现有Tp53突变患者的总体生存率明显低于无突变者(P=0.02)。突变发生于Tp53区域的比其它区域的突变或无突变者有较低的生存率(P=0.01)，他们认为寡核昔酸微阵列在Tp53突变的检测上是一个有效的工具。 二、 寻找卵巢肿瘤相关基因 通过比较正常卵巢组织细胞及卵巢肿瘤细胞中大量相关基因表达的变化，发现一组卵巢肿瘤相关基因。Sawiris等根据基因表达系列的分析，建立了一个专门的CDNA微阵列研究卵巢癌。命名为Ovaehip，包含516个与卵巢癌相关的eDNA微阵列，基因表达形式表明Ovachip具有高度的可重复J性和对标本检测的一致性。这种微阵列对区分卵巢癌和直肠癌具有高度的敏感性。Matei等应用含12600个mRNA的cDNA微阵列分析原代培养的9例正常卵巢组织和21例卵巢癌组织，应用聚类分析揭示了正常卵巢组织和癌组织表达显著差异的基因，IH种基因在癌组织中有超过2.5倍的升高，62种基因在正常卵巢组织中有超过2.5倍的升高，对进一步研究卵巢癌的发生发展提供了有效的手段。 Wong等应用MICROMAX cDNA微阵列技术，确定了30种猜测基因，其不同的过表达于卵巢癌细胞系，这些基因的不同表达进一步用实时定量PCR进行确定。已经证实这些基因或在所有卵巢癌细胞系中过表达，或仅在于某些癌细胞系过表达。对这些基因特征进一步研究确证，可使其用于卵巢癌诊断、预后、抗癌治疗和分子学分类。 上皮性卵巢癌是妇科肿瘤中死亡率最高的肿瘤，部分是因为缺乏有效的早期监测指标，虽然 象c一erb一B2，c一myc和p53基因的改变在卵巢癌的发生中起重要作用，但仍不能作为诊断恶变和预测肿瘤行为的指标。Welsh等应用含6000个寡核昔酸探针的微阵列来确定与卵巢癌相关的基因的表达。用正常的卵巢组织作对照，结果发现正常的卵巢组织明显不同于肿瘤组织，且肿瘤可根据组织学、临床观察及特异基因型的表达被再分为许多亚组。用这种方法发现的一系列基因极大的丰富了卵巢癌的分子标记，对确定新的基因作为卵巢癌的候选分子标记具有重要意义。 三、 发现新的功能基因 近来许多研究提示同源框基因族参与肿瘤的发生，Msxl是含homebox的基因之一。Park等研究Msxl过表达的人卵巢癌细胞系OVCAR3，观察Msxl是否参与了细胞增殖和细胞周期的调节。发现Msxl通过显著的延长GI期抑制细胞增殖。与这个结果一致，观察到细胞周期蛋白Dl、D3、E，细胞周期蛋白依赖激酶4、Cjun、Rb的表达受到明显的抑制。CDNA表达阵列分析发现参与生长阻滞和凋亡的基因表达升高(GADD153和凋亡半胧氨酸蛋白酶MCH4)而增殖相关蛋白基因(PAG)表达受抑。这些结果为Msxl在细胞周期进展过程中的潜在抑制功能提供了进一步的证据。 四、 探索基因作用的不同机制 p53蛋白是诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡的重要蛋白，其活性主要由p53基因所诱导的p21蛋白来调节，但是有许多研究表明p21WAF，柳1蛋白的上调不依赖于p53，更重要的是p21，参与了细胞的分化和凋亡，对p21的这种功能尚不清楚。Qun等用腺病毒载体介导的p53和pZI耀转染卵巢癌细胞株2774、2774qwl和2774qw2，来模仿p53依赖的和非p53依赖的pZIWAF，肥，的上调，应用含60000cDNA的微阵列来检测，发现159个表达差异的基因，其中有66个是依赖p53途径，93个非依赖p53途径。这93个基因可以解释p21wAFI翻不依赖p53的功能。对于卵巢癌的深人研究提供了新思路。 五、 寻找简易可行的分子标记 绝大部分卵巢肿瘤起源于卵巢表面上皮的转化。为确定引起卵巢恶变表型的基因，应用cDNA代表差异分析来比较原代培养的正常人卵巢表面上皮细胞(HosE)和卵巢肿瘤来源的上菠细胞(CSOC)。总共确定了255个不同表达的基因，160个表达于HOSE，95个表达于CSOC。应用CDNA阵列杂交分析了另外5种HOSE和10种CSOC细胞系的基因表达谱，并由cDNA代表差异分析来鉴定，每种基因平均信号的比较揭示44种HOSE特异和16种CSOC特异基因至少有2.5倍表达的不同，此研究中确定的大量基因编码膜相关或分泌蛋白，因此这些基因或许可用于卵巢癌的血清学诊断标记。 展望 基因芯片在基因检测中有快速、灵敏、高通量和自动化的特点，但许多技术问题尚待解决，如提高芯片的特异性，简化样品制备和操作程序，增加信号检测的灵敏度等。基因芯片的技术优势已引起世界广泛重视，基因芯片技术丰富和完善了肿瘤分子遗传学和细胞遗传学的分析技术，许多肿瘤相关基因芯片如p53、Ras、BRCAI、Rb、Bcr-Abl等基因已经上市，介绍基因芯片技术因特网站的建立，可方便查询有关基因芯片技术创新、产品开发和应用领域的最新资料。基因芯片技术用于卵巢肿瘤研究的前景广阔，可建立一套准确高效的检测方法。若应用于临床可作为一种早期诊断、治疗和评估预后的指标和依据。 摘要：由人类基因组计划实施带动分子生物学进步而发展起来的基因芯片技术是一种具有划时代意义的新的基因分析方一法。肿瘤是一种进行性的多基因紊乱疾病，基因芯片技术在肿瘤细胞基因妇产科论文表达模式及肿瘤相关基因的发掘中具有极其重要的作用，该技术可为卵巢肿瘤的研究提供强大的技术支持。 关键词：基因芯片；卵巢肿瘤；应用 专心-专注-专业