(2.33)--病毒血清学试验方法.pdf

病毒血清学试验方法概述 病毒血清学试验方法是实验室诊断病毒感染和鉴定病毒的重要手段。血清学实验的方法很多，最常用的是红细胞凝集及红细胞凝集抑制试验、中和试验、补体结合试验。血凝与血凝抑制试验一、基本原理 某些病毒和病毒表面的血凝素（hemagglutinin,HA)能引起人或某些哺乳动物的红细胞发生凝集，这就是所谓的红细胞凝集现象。一、基本原理 目前在这方面研究得比较清楚的是流感病毒。流感病毒主要由核衣壳和包膜组成，在其包膜上镶嵌着一种糖蛋白，因该糖蛋白可引起多种动物（如鸡、豚鼠）和人的红细胞凝集而得名血凝素。流感病毒表面的血凝素与红细胞表面的受体结合，红细胞上吸附病毒，细胞上的病毒再结合其它红细胞，导致红细胞凝集，并出现肉眼可见的血凝现象。一、基本原理 这一过程可被某此物质所抑制。如血清中血凝素抗体能够与病毒血凝素分子的抗原位点特异性结合，干扰病毒血凝素与红细胞上受体的结合过程，从而抑制红细胞凝集，这是血凝抑制试验的基本原理。二、血凝试验的基本方法1.实验材料：96孔板、红细胞悬液和PBS溶液二、血凝试验的基本方法2.基本实验步骤选择合适的96孔板，96孔板可分成V型和U型，如果使用鸡或火鸡红细胞，则应选择V型微量血凝板；如果使用豚鼠或人O型红细胞，应选择U型微量血凝板。以便于结果观察。并做好标记。二、血凝试验的基本方法2.基本实验步骤病毒液的倍比稀释。一般选择连续的二倍稀释，做12个稀释梯度。加入等体积的1%的红细胞悬液，振荡，使红细胞与病毒充分混合。混匀后室温静止，鸡和火鸡红细胞静置25-30min后观察结果，人“O”型和豚鼠红细胞45-60min后观察结果，并记录。二、血凝试验的基本方法3.血凝试验结果判断方法一：为无凝集，红细胞于孔底形成一个小团。：指红细胞形成一个小团，但边缘不整齐，有小凝集块者；：指红细胞形成一个小团，周围有小凝集块者；：指红细胞铺在管底，面积稍小，边缘不整齐；：指红细胞均匀铺在管底；血凝试验是判断病毒存在与否的重要环节，如果出现血凝现象，说明病毒存在的可能性。在倍比稀释的病毒液与红细胞作用时，出现“+”的稀释度的倒数，我们将其设置为判定终点。例如，如果1/640稀释度出现“+”的凝血结果，则640为该病毒的判定终点。判定终点越大，则病毒的滴度越高。同时，出现“+”的稀释度的病毒滴度被称之为1个血凝单位。血凝单位的计算是血凝抑制试验的重要参数。三、血凝抑制试验的基本方法 血凝抑制试验需要的病毒滴度是4个血凝单位，即血凝单位稀释度的4倍。例如，1个血凝单位的病毒液稀释度是1/640，则四个血凝单位的稀释度时1/6404，即1/160稀释度。配置好的4个血凝单位的病毒液，再一次通过滴度复核滴定明确后，就可以直接用于血凝抑制试验了。三、血凝抑制试验的基本方法1.实验材料 反应体系包括四个血凝单位的病毒液与等体积的二倍梯度稀释的抗病毒标准参考血清，如抗A(H1N1)pdm09流感病毒标准参考血清；以及与前两种液体总体积相等的1%的红细胞悬液。三、血凝抑制试验的基本方法2.基本实验步骤 混匀反应体系，室温孵育30min，观察结果。在这个过程中，病毒如果遇上特异性的病毒标准参考血清，其血凝素活性被中和，血凝现象被抑制，达到一定的程度，则可判断为阳性。三、血凝抑制试验的基本方法3.血凝抑制试验结果判断方法结果依据：红细胞凝集抑制效价 红细胞凝集抑制效价是指血凝现象完全被抑制时，血清的最高稀释度的倒数。例如1:80稀释的血清孔不出现凝集，即凝集现象完全被抑制；1:160稀释的血清孔出现凝集，即凝集现象没有被完全抑制，所以，该血清对测定病毒的红细胞凝集抑制效价为80。三、血凝抑制试验的基本方法3.血凝抑制试验结果判断方法判断血凝抑制试验的结果标准是：标准参照抗血清对待检抗原的抑制效价20才可以算为阳性。待检抗原与标准参照抗血清有交叉抑制，但与一种型/亚型的标准参照抗血清抑制效价大于其它型/亚型参照抗血清4倍以上时，便可以判定为此种亚型的流感病毒。