(2.20)--萋_尼氏抗酸染色法和金胺O荧光染_省略_在结核分枝杆菌痰涂片检测.pdf

论 著文章编号 10068147（2018）04-0357-04作者简介 赵慧（1 9 8 1-），女，主管检验技师，硕士在读，研究方向：病原微生物；通信作者：朱泽，E-ma i l：1 3 9 2 0 9 2 2 6 0 9 1 2 6.c o m。萋-尼氏抗酸染色法和金胺 O 荧光染色法在结核分枝杆菌痰涂片检测中的对比摘要目的：比较萋-尼氏抗酸染色法（简称 Z-N）和金胺 O 荧光染色法（简称荧光染色）在痰涂片镜检中对结核分枝杆菌的检测效果差异。方法：纳入 580 份痰标本，挑取相同部位制成两份涂片，分别使用 Z-N 和荧光染色进行染色镜检，比较两种方法的阳性检出率、阳性分级标准及读片时间上的差异。将涂片后余下的痰标本采用全自动分枝杆菌检测/药敏系统做液体培养。结果：Z-N 法阳性检出率为 10.8%，荧光染色法为 15.3%，两种方法比较差异有统计学意义（P0.05）。对两种方法每一级别的结果进行 2检验，结果表明两种染色方法在各个分级没有统计学差异（P0.05）。荧光染色法的读片时间要明显短于 Z-N。结论：荧光染色阳性检出率略高于 Z-N，证明荧光染色法是一种快速、灵敏的检测方法，对肺结核的临床诊断具有重要意义。关键词结核分枝杆菌；荧光染色法；萋-尼氏抗酸染色法；荧光显微镜；图像采集系统中图分类号R52文献标志码AComparison between Z-N staining method and Auramine O fluorescent staining method in detection ofmycobacterium tuberculosis in sputum smearZHAO Hui1，2，WANG Chun-hua2，SUN Rui2，XIE Tong2，MU Cheng2，WANG Zhi-rui2，JU Han-fang2，ZHU Ze1（1.Department of Pathogen Biology，Tianjin Medical University，Tianjin 300070,China;2.Tuberculosis Reference Laboratory,TianjinCenter for Tuberculosis Control，Tianjin 300041，China）AbstractObjective:To compare the difference of mycobacterium tuberculosis detection effect between Z-N staining method andAuramine O fluorescent staining method in microscopy of sputum smear.Methods：Two smears were prepared for the same site of 580clinical sputum specimens.Two smears were followed with Z-N and fluorescent staining respectively.The difference between two methodsincluding positive detection rate,the standard of positive classification and time of reading were compared.At the same time,phosphatebuffer was used to make 60 copies of smear negative control,staining by Z-N and fluorescence respectively.The remaining sputumspecimens were tested by automatic Mycobacterium detection/drug sensitivity system for liquid culture.Results:The positive detectionrate using Z-N was 10.8%,that of fluorescent staining was 15.3%,and the difference between two methods were considered statisicallysignificant（P0.05）.The results showed that there was no statistical difference between the two staining methods in each grade(P0.05).Conclusion:The positive detection rate of fluorescence staining is slightly higher than Z-N.It is proved that fluorescence staining is a fastand sensitive detection method,and it may provide important reference for the clinical diagnosis of tuberculous pleuritis.Key wordsmycobacteriumtuberculosis；fluorescentstaining；Zeihl-Neelsenstaining；fluorescencemicroscope；imageacquisitionsystem结核病是由结核分枝杆菌引起的一种慢性传染性疾病，我国是全球高负担国家之一1。结核病的诊断与防治一直是我国结核病控制工作面临的重点。早期快速诊断对于结核病的治疗和预防控制起着重要的作用。结核分枝杆菌分离培养实验耗时较长，使用固体改良罗氏培养基（Lowenstein-Jensen，L-J）培养常常需要 20 d2 个月，即使采用较先进的全自动分枝杆菌检测/药敏系统做液体培养也需要720 d 左右。实验室最常用的方法是痰标本直接涂片法，此法操作简单、价格低廉，但是操作起来比较费时，而基层痰检实验室在涂片量大的情况下 1 d之内无法得出结果，这样的现状远远不能满足结核病临床和防治工作的需要。近年来，荧光染色技术得到了飞速发展，作为一种研究方法或实验手段，已被广泛地应用于医学科学领域内各种基础理论研究和临床诊断。目前，金胺 O 荧光染色也逐渐应用在结核分枝杆菌的痰涂片检测上。本文对传统的萋-尼氏抗酸染色法（简称 Z-N）和荧光染色两种染色方法在结核分枝杆菌痰涂片镜检过程中的检测效能进行了初步的比较分析。1材料与方法1.1材料1.1.1标本来源580 例标本均来自于 2012 年 8-12 月天津市结核病控制中心门诊部收取的病人送检痰液。1.1.2试剂和仪器抗酸染色试剂盒和金胺 O 染色试剂盒，购自珠海贝索生物技术有限公司，LED荧光显微镜（carl ZEISS Primo Star iLED），图像采集系统（ZEN.exe 1.0.1.0），Milli-Q Integral 3（A 10），NUAIR class生物安全柜（MODEL NO.NU-425-600E），BACTEC MGIT 960（Becton Dickinson&Company）。1.2方法1.2.1标本的确认痰标本排除口水痰后纳入研究范围。确认纳入的当天，每份痰标本取相同位置痰液制成两张涂片。1.2.2涂片染色镜检每份痰样品各涂片 2 张，分别进行 Z-N 和荧光染色。染色时，Z-N 法复红染色时采用加热 5 min，荧光染色采用金胺 O 冷染 1520 min。镜检时，Z-N 法在 1000镜下观察，金胺 O 法在 400镜下观察。具体的方法及报告标准参见文献2。1.3阴性对照组实验用高压灭菌后的磷酸盐缓冲液（PBS pH=6.8）作为样本，制作 60 张涂片，30 张为一组，第一组采用 Z-N 法涂片，第二组采用荧光染色法涂片。1.4 分枝杆菌全自动分枝杆菌检测/药敏系统培养采用BACTEC MGIT 960 全自动分枝杆菌检测系统进行样本培养，实验方法及结果判定参照文献2。1.5读片时间统计对纳入的 580 张涂片进行读片时间的记录，统计两种染色法对同一标本各自的读片时间。1.6质量控制所有参与研究的人员都是经过统一培训的实验室技术人员。纳入标本的涂片和镜检，均由同一名实验人员完成。1.7统计学处理两率之间的比较采用2检验，两种方法读片时间上的比较采用 t 检验，P0.05 即为差异有统计学意义。2结果2.1Z-N法和荧光染色法与培养结果的比较 580份痰标本抗酸染色法阳性检出率为 10.8%，荧光染色法阳性率为 15.3%，两种方法比较差异有统计学意义（2=5.118，P0.05）（表 1，图 1）。2.2不同检测方法的结果分析见表 2、3。两种染色方法的诊断符合率无统计学差异（2=1.917，P0.05），见表 4；Z-N 正确诊断指数（即约登指数=灵敏度+特异度-1）为 0.398 7，荧光染色正确诊断指数为 0.545 8。2.3对每一例标本在两种染色方法中进行分级比较对每一级别的结果进行 2检验，结果表明两种染色方法在各阳性分级比较中没有统计学差异（P0.05）。另外，在阴性对照组 30 例中，有 1 例在荧光染色时，20物镜下见到两条疑似结核杆菌，在油镜下确认为并非结核杆菌（表 5、6）。表 1Z-N 法和荧光染色法与培养结果的比较Tab 1 ComparisonbetweenZ-Nandfluorescentstainingandculture染色方法标本数阳性涂片数阳性率/%抗酸染色5806310.8荧光染色5808915.3培养58013222.88006004002000抗酸染色荧光染色培养阳性数阴性数标本数图 1两种染色方法及培养阳性数的比较Fig 1 Comparison betweentwostainingmethodsandpositivenumberof culture染色方法培养+培养-总计荧光染色+761389荧光染色-56435491合计132448580表 2Z-N 法与培养的检测结果分析（n）Tab 2 AnalysisoftheresultsofZ-Nandculture（n）染色方法培养+培养-总计抗酸染色+55863抗酸染色-77440517合计132448580表 3荧光染色法与培养的检测结果分析（n）Tab 3 Analysisoftheresultsoffluorescentstainingandculture（n）染色方法灵敏度/%特异度/%诊断符合率/%正确诊断指数抗酸染色41.6798.2185.340.3987荧光染色57.5897.1088.100.5458表 4两种染色方法检测对比Tab 4 Comparisonbetweentwostainingmethods表 5实验组 Z-N 染色和荧光染色结果的分级比较n(%)Tab5 ClassificationcomparisonbetweenZ-Nandfluorescentstainingintheexperimentalgroupn(%）组别 标本数阳性分级总计1+2+3+4+抗酸5807（11.1）16（25.4）17（27.0）14（22.2）9（14.3）63荧光58010（11.3）29（32.6）23（25.8）15（16.9）12（13.5）8920.0005788 0.91440.02479 0.68860.01995P0.98080.33900.87490.50070.8877第 24 卷天津医科大学学报358图 9 抗酸染色+（10100）Fig 9 Z-N+（10100）2.4两种方法读片时间比较观察 580 张涂片，抗酸染色累计用时 2 505 min，平均用时 4.32 min/张；荧光染色累计用时 1 220 min，平均用时 2.10 min/张。两种方法的时间用 t 检验，结果具有显著的统计学差异（P0.01）。可见，荧光染色法的效率远远高于抗酸染色法。见表 7，图 29。3讨论随着实验室诊断技术的进步，分子检测技术被更多地运用到痰标本检测中。其中多色巢式荧光定量 PCR（Xpert MTB/RIF）无论在灵敏度还是特异度方面都远远高于传统的细菌学检测3，但是考虑到明显的成本效益和普及程度，痰涂片镜检在国家结核病控制规划中仍是最有效的病人发现方法，传统的萋-尼氏染色镜检是目前国内主要的镜检方式4。不论是从结核病控制、流行病学调查和研究，还是从临床诊疗的角度看，分枝杆菌的分离培养都是结核病病原学诊断的“金标准”2。本次研究中，以分枝杆菌培养结果为参照分析，荧光染色灵敏度（57.58%）高于 Z-N 灵敏度（41.67%），而两种方法的特异度相差不大，诊断符合率也无统计学差异（2=1.917，P0.05）；在正确诊断指数（即约登指数=灵敏度+特异度-1）方面，荧光染色（0.545 8）要高于 Z-N（0.398 7），而约登指数越高，说明筛查实验的效果越好，真实性越大。综合多组实验数据，说明荧光染色法诊断效果优于抗酸染色法。有文献报道5荧光染色法检测痰中结核杆菌的灵敏度高，特异性和准确率也比较高。也有报道称6，荧光染色法特异性与抗酸染色法相似，但敏感性平均要高 10%，本次实验结果与其相一致。也有报道7显示，对于结果为 1+的标本，两种染色方法的检出率差异有统计学意义，而对于结果为，2+,3+,4+的标本，两种方法的检出率无明显差异，表明两者阳性率的差异主要体现在含菌量较少的痰液标本。本实验与其研究并不一致，这可能与本次实验标本收集时间短，数据少有关。在操作上，抗酸染色法较荧光染色法繁琐，加热时易产生气溶胶。荧光染色镜检抗酸杆菌在暗色背景下会发出橙黄色荧光，醒目易发现。并且荧光染色在 20物镜视野大，镜检速度快，而抗酸染色100油镜视野小，镜检速度较慢。镜检时间的分析显示，镜检 580 份涂片，荧光染色法的镜检时间要远远低于抗酸染色法的镜检时间。这对工作效率的提高有着重要的意义。有资料表明，荧光染色的假阳性率可高达 5.9%，本研究结果与之相近，在 30 例阴性对照标本中，其中有 1 例在荧光染色时，20物镜下见到两条疑似结核杆菌，在油镜下确认为并非结核杆菌。故对于菌量少的样本，在高倍镜下观察仍为疑似者，要在油镜下再次确认其形态，方可得出结论。另外，实验中造成假阳性可能原因为荧光染色镜检使用的放大倍数（400）较 Z-N 法镜检（1 000）低，所以在菌量少的情况下，加上杂质也会方法阴性对照数结果假阳性率/%-抗酸染色303000荧光染色302913.33表 6阴性对照组 Z-N 染色和荧光染色的结果Tab 6 Results of Z-N and fluorescent staining in negative controlgroup表 7两种染色方法的读片时间分析Tab 7 Analysisofthereadingtimebythetwomethods检测方法总数总时间/min平均时间/min抗酸染色5802 5054.32荧光染色5801 2202.10图 2荧光染色+（1040）Fig 2 Fluorescent staining+（1040）图 3 荧光染色+（1040）Fig 3 Fluorescent staining+（1040）图 4 荧光染色+（1040）Fig 4 Fluorescent staining+（1040）图 5 荧光染色+（1040）Fig 5 Fluorescent staining+（1040）图 6 抗酸染色+（10100）Fig 6 Z-N+（10100）图 7 抗酸染色+（10100）Fig 7 Z-N+（10100）图 8 抗酸染色+（10100）Fig 8 Z-N+（10100）赵 慧，等.萋-尼氏抗酸染色法和金胺 O 荧光染色法在结核分枝杆菌痰涂片检测中的对比第4期359有荧光显色的干扰，镜下对菌体形态不容易辨认8。本研究结果表明，荧光染色镜检的敏感度比 Z-N 法镜检提高 15%多，特异度并没有明显降低；另外荧光染色镜检可以明显缩短读片时间，且染色无需加热。所以使用荧光染色法镜检痰涂片，是一种快速、灵敏的检测方法9-11。同时，该方法若配套图像采集系统，能更直观的看到菌体情况，为临床诊断和患者提供更快捷、更直接的报告方式。荧光染色法更适用于日工作量较大，并且人员镜检经验丰富的实验室。参考文献：1WHO.Global Tuberculosis Report 2015R.Geneva:World HealthOrganization，2015:1-22赵雁林.结核病实验室诊断技术培训教程M.北京:人民卫生出版社，2014:12，323黄芳，党丽云，孙惠平，等.三种分子生物学诊断技术对结核病诊断价值的比较J.中华结核和呼吸杂志，2015，38（9）:6804李欣，青清，李多孚.荧光染色法与萋-尼染色法检测结核分枝杆菌的效果评价J.国际检验医学杂志，2015，36（6）:7455肖静，杨元好，金瑛，等.荧光染色法检测痰中结核杆菌的应用J.贵阳中医学学院学报，2013，35（4）:10026Steingart K R，Henry M，Ng V，et al.Fluorescence versus conventional sputum smear microscopy for tuberculosis:a systematic reviewJ.Lancet Dis，2006，6（9）:5707张立，周洪经，冯爽.荧光染色法在结核分支杆菌检测中的应用J.山东医药，2014，54（7）:558曾希鹏，张小芬，陈烨，等.2 种染色方法查找痰中结核杆菌的比较J.中国卫生检验杂志，2014，24（23）：34029夏辉，赵冰，李强，等.发光二极管荧光显微镜在基层应用的多中心研究J.中国防痨杂志，2011，9（33）:59210 桂静，李金莉，王峰.荧光染色法与萋-尼氏抗酸染色法检测痰液中抗酸杆菌的对比观察J.中国卫生检验杂志，2010，20（11）：283611 毛小芳，杨敏，谢英，等.金胺“O”荧光染色 LED 显微镜检测痰中抗酸杆菌的应用J.实验与检验医学，2016，34（1）:82（2017-12-30 收稿）论 著文章编号 10068147（2018）04-0360-03TCT、活检病理在宫颈上皮瘤变及早期宫颈癌诊断中的价值分析曲首辉，鲍志敏，刘荣欣（郑州市第一人民医院产二科，郑州 450003)摘要目的：探讨液基薄层细胞学（TCT）、术前活检病理在宫颈上皮瘤变（CIN）、早期宫颈癌诊断中的价值。方法：选取经手术后病理学最终确诊的 276 例 CIN 患者、19 例宫颈癌患者进行回顾性分析，所有患者均接受了术前 TCT 检查、活检病理学检查，以术后最终病理检查结果作为金标准，判断两种方法鉴别诊断 CIN、宫颈癌的临床价值。结果：TCT 诊断 CIN、鳞状细胞癌（SCC）结果与最终病理学诊断结果的相关性分析 R=0.522，P0.001；术前活检病理诊断 SCC、CIN 结果与最终病理学诊断结果的相关性分析 Spearman R=0.831，P0.001；TCT 鉴别诊断 CIN、SCC 的灵敏度为 54.71%、特异度为 63.16%、漏诊率为 45.29%、误诊率为36.84%；术前活检病理鉴别诊断 CIN、SCC 的灵敏度为 99.28%、特异度为 78.95%、漏诊率为 0.72%、误诊率为 21.05%。结论：对于 CIN 及宫颈癌患者，活检病理学诊断较 TCT 具有更高的临床价值，与术后病理学结果的相关性更高。关键词液基薄层细胞学；活检病理；宫颈上皮瘤变；宫颈癌中图分类号R737.33文献标志码A宫颈癌是女性常见肿瘤之一，本病高发年龄集中于 3545 岁，但近年来逐步呈年轻化趋势。高危型人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染、性行为及分娩次数过高、营养不良、卫生条件较差等是宫颈癌的重要危险因素1。随着宫颈细胞学筛查的逐步推广，宫颈癌及宫颈上皮瘤变的早期发现和治疗率逐年增高，宫颈癌死亡率明显下降2。液基薄层细胞学（thinprep cytologic test，TCT）、术前活检病理是宫颈癌及其他癌前病变的主要细胞学筛查方式3。为分析 TCT 与术前活检病理在宫颈上皮瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）、早期宫颈癌诊断中的价值，本研究对 CIN 和早期宫颈癌患者的临床资料进行回顾性分析。1资料与方法1.1一般资料选取我院2013年1月-2016年1月经手术后病理学最终确诊的 276 例 CIN 患者、19 例宫颈癌患者，年龄 2759 岁(45.4 岁15.0 岁），孕次 15 次（2.9 次1.3 次），产次 14 次（2.1 次作者简介 曲首辉（1 9 7 6-），女，副主任医师，研究方向：妇产科危重症及并发症，E-ma i l：f a c a i f a c a i 6 5 0 1 1 6 3.c o m。Vol 24,No 4Jul 2018第 24 卷 4 期2018 年 7 月天津医科大学学报Journal of Tianjin Medical University360