(1.9)--重建人类免疫系统的人源化小...在血液系统疾病研究中的应用.pdf

第 36 卷第 4 期2019 年 8 月实验动物科学LABOATOY ANIMAL SCIENCEVol 36No 4August 2019櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴櫴毷毷毷毷研究进展收稿日期:20190125*基金项目:广东省科技计划基金项目(No 2014A020212300;2016A020215149);湛江市财政基金科技专项竞争性分配项目(No2016A06003)作者简介:龙杰(1984)，男，在读硕士研究生，研究方向:人源化小鼠模型Email:365591959 qqcom通信作者:杨志刚(1965)，男，医学博士，教授，博士生导师，研究方向:血液病的免疫学机制研究Email:yangzg gdmueducn重建人类免疫系统的人源化小鼠模型及其在血液系统疾病研究中的应用*摘要:动物模型在人类疾病发病机制的研究及药理学实验研究治疗中发挥重要作用。小鼠是目前主要的实验动物，但其与人类背景存在差异，不能完全模拟人类免疫系统及疾病状态。研究人员通过将人类细胞或组织植入免疫缺陷小鼠体内，可构建免疫系统人源化小鼠模型及人源化小鼠疾病模型。人源化小鼠可通过优化人源造血干细胞来源等条件，可得到免疫系统人源化程度较高的小鼠模型。目前，GVHD 人源化小鼠模型及白血病人源化小鼠模型已经应用在研究疾病发病机制及开发新型临床治疗药物等方面。关键词:人源化小鼠;移植物抗宿主病;白血病;动物模型中图分类号:332文献标识码:A文章编号:10066179(2019)04-0086-07DOI:103969/jissn10066179201904020实验动物学在医学研究中发挥重要作用，实验动物模型可以用于模拟人类疾病发病以及药理学实验研究。其中灵长类动物在遗传学上与人类接近，曾在医学研究中有着举足轻重的地位，但由于灵长类动物价格昂贵及存在伦理学方面的限制，近年来逐渐减少在医学研究上的应用。小鼠作为实验动物的历史源远流长，但小鼠的遗传学背景与人类相差较大，为解决该问题，研究人员将人类细胞或组织植入免疫缺陷小鼠体内构建免疫系统人源化小鼠模型及人源化小鼠疾病模型，在这种人源化的小鼠动物模型中进行的研究更能模拟人类免疫系统及人类疾病实际情况。1免疫系统人源化小鼠模型的建立及优化1.1人源造血干细胞来源的选择根据造血干细胞不同的起源部位，可分为胎肝造血干细胞、骨髓造血干细胞、粒细胞集落刺激因子(Granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)动员的外周血造血干细胞、脐带血造血干细胞。其中，胎肝造血干细胞来源于胎儿，人类胎儿肝脏在妊娠第 10周至第 20 周的大部分时间里是主要的造血器官。Kuchma 等1 在免疫表型的研究中，发现胎肝比脐带血含有更丰富的人类造血干祖细胞。oncarolo等2 从胎肝中获得的 HSC 免疫原性较弱，植入人类白细胞抗原(Human leukocyte antigen，HLA)不匹配的胎儿中也不会产生移植物抗宿主病(Graft-versus-host disease，GVHD)。Lepus 等3 在几个不同品系的免疫缺陷小鼠身上比较胎肝、脐带血、成人外周血来源的造血干细胞的植入率，结果表明，胎肝来源的CD34+造血干细胞植入率最高。但胎肝来源于流产的胎儿，各项病原学阴性的流产胎儿的肝脏才成为收集的对象，另外，目前胎肝干细胞库极少，并且，胎肝的应用存在一些伦理相关的问题，使其在应用上受到较大的限制。与胎肝相比，脐带血的来源更丰富、采集更方便，采集过程对母婴均无危害，也不存在应用胎肝造血干细胞所产生的伦理问题。脐血中 T 淋巴细胞第 4 期龙杰等:重建人类免疫系统的人源化小鼠模型及其在血液系统疾病研究中的应用数较少且较原始，使用 HLA 不匹配的脐带血造血干细胞移植后 GVHD 发生率低4。这些优点都是骨髓和外周血来源的造血干细胞所不具备的。造血干细胞选择时，还要考虑 T 细胞的植入有产生 GVHD 的风险。但是，另一方面，适量的 T 细胞又具有促进移植物植入的优点，这在人类造血干细胞移植领域已经得到了证实5。Hexner 等6 分别在等剂量脐带血单个核细胞与去除 T 细胞的脐带血单个核细胞中，加入了抗 CD3/CD28 单克隆抗体刺激 T 细胞增殖，然后注入 NOD/SCID-2m/小鼠体内。结果表明，未去除 T 细胞组人源 CD45+细胞的植入率明显比第二组高(5.94%1.65%VS0.29%0.79%)，证明了在小鼠体内人源脐带血中T 细胞有克服免疫屏障促进植入的作用。Hayakawa等7 用 CD34+分选的脐带血单个核细胞与未分选的脐带血单个核细胞分别经白消安预处理后输注入NSG(NOD/SCID/IL-2null)小鼠体内比较，发现CD34+分选的脐带血单个核细胞组植入率明显高于其他组，且植入率长期维持在高水平状态。所以，目前主要选择脐带血 CD34+单个核细胞进行人源化小鼠模型的研究。1.2免疫缺陷小鼠的选择小鼠的异种造血干细胞移植如同人类同种异基因造血干细胞移植一样，供者干细胞的植入需克服受者的免疫屏障，而这些免疫屏障就是受者本身的免疫状态，受者免疫缺陷程度越高，更利于供者的细胞植入8。基于上述理论，人源化免疫小鼠通常选择免疫缺陷小鼠。利用免疫缺陷小鼠进行人源化小鼠的研究经历了几个阶段。最早发现的免疫缺陷小鼠是裸鼠，由于 foxn1 基因的缺陷导致该小鼠胸腺发育受损9，从而没有成熟 T 细胞产生导致该小鼠 T 细胞依赖的免疫排斥几乎消失。但人源免疫细胞依然无法在该小鼠体内生存10。1983 年，研究人员发现 CB17 纯系小鼠 16 号染色体上的重症联合免疫缺陷(Severe combinedimmunodeficiency，SCID)基因发生隐性突变后，小鼠缺乏功能成熟的 T 和 B 淋巴细胞，由此得到了 SCID小鼠11。1988 年，Mccune 等12 用 SCID 小鼠植入人胎肝干细胞、胎胸腺、胎淋巴结，可使人源 T 细胞和 B 细胞重建。但由于 SCID 小鼠的免疫缺陷程度不高，体内残留较多 NK 细胞及部分 T 细胞和 B 细胞，人源免疫细胞重建水平不高。由于 SCID 小鼠对放射高度敏感，为降低放射敏感性，有学者通过敲除 ag113(ecombinant activating gene)或 ag214 基因产生 ag/小鼠。ag1 和 ag2 基因在 TC 的重排和抗体生成方面发挥重要作用，是 T 细胞和 B细胞 成 熟 所 必 需 的 基 因，因 此，ag1/小 鼠 及ag2/小鼠均缺乏功能成熟的 T 细胞和 B 细胞，但是也因它们的高 NK 细胞活性阻碍了人源细胞的植入15-16。随后通过 NOD(Non-obese diabetic)背景小鼠与SCID 小鼠回交得到免疫缺陷程度更高的 NOD/SCID 小鼠17。这种小鼠的特点除了 T 细胞和 B 细胞等免疫细胞的功能丧失以外，还影响了部分 NK细胞的功能，所以免疫缺陷程度比前述的小鼠更高。杨海燕等18 利用脐带血 CD34+单个核细胞注入 TBI预处理的 NOD/SCID 小鼠，在第 8 周行流式细胞术检测，发现人源 CD45+细胞植入达到(12.34 2.38)%，远高于 Lewis 等19 定义的 0.5%的植入标准。但 NOD/SCID 小鼠随着年龄的增长，会出现“免疫渗漏”，即部分 T 和 B 细胞的功能恢复，且本身仍有 NK 细胞功能残留，使得其植入效率不高。在此基础上，使 NOD/SCID 小鼠编码白介素 2受体 链的基因发生无效突变，产生 NSG20(NOD/SCID/IL-2null)小鼠。因为该受体的 链是白介素 2、白介素 4、白介素 7、白介素 9、白介素 15、白介素 21 等细胞因子的共同受体，所以该基因的突变导致 NK 细胞成熟障碍和功能丧失，并且消除了 T 和B 细胞的免疫渗漏现象，使得小鼠的免疫缺陷程度更高。McDermott 等21 比较了 NSG 小鼠与 NOD/SCID 等品系的小鼠外周组织的人源细胞植入率，结果 表 明，NSG 小 鼠 和 NOG(NOD/Shi-scid/IL-2null)小鼠明显比 NOD/SCID 等品系小鼠的人源细胞植入率要高，而 NSG 小鼠在骨髓中人源细胞的植入率比其它品系的小鼠要高，雌性尤甚，所以NSG 小鼠是目前人源化小鼠模型的最佳受鼠。1.3预处理方式的选择预处理是输入人源细胞前的附加处理方式，目的是:1产生骨髓抑制从而腾空骨髓龛及负反馈刺激造血再生，促进造血干细胞归巢骨髓龛并自我更新、增殖及分化22;2产生免疫抑制预防移植物被排斥，这些作用都有利于人源细胞植入。由于目前接受移植的小鼠主要为 NOD/SCID 小鼠等免疫缺陷鼠，本身由于缺乏 T 细胞和 B 细胞等免疫细胞已产生明显免疫抑制，所以预处理的策略主要是使小78实验动物科学36 卷鼠产生骨髓抑制23。传统小鼠移植的预处理方式有全身射线辐照(Total body irradiation，TBI)等，预处理后，人源细胞植入率比没有接受预处理的组别要高。其主要原因是使受者体内基质细胞衍生因子(Stromal cell-derived factor-1，SDF-1)、干 细 胞 因 子(Stem cellfactor，SCF)等细胞因子水平的升高，SDF-124 是 C-X-C 趋化因子受体 425(C-X-C chemokine receptortype 4，CXC4)的配体，在人鼠之间可以发生交叉反应26，而人源造血干细胞表面表达 CXC4 分子，通过 CXC4SDF-1 轴可以使经尾静脉注入的人源造血干细胞定向归巢到骨髓里，人源造血干细胞只有归巢到骨髓环境里才能自我更新、增殖及定向分化。SCF27 是干细胞生长因子，主要生理作用是促进早期造血前体细胞的增殖和分化，Zheng 等28 利用重组人 SCF 与脐带血 CD34+细胞体外培养植入NOD/SCID 小鼠体内的植入率明显比未经处理的脐带血 CD34+细胞的组别要高。这些细胞因子、趋化因子的水平的上升可以使外源性人源细胞的植入率增高。传统的以 TBI 为主要手段的预处理策略的弊端是小鼠的死亡率较高，小鼠的生存条件要求苛刻，需严格的无菌环境和配备独立通气笼(Individualventilated Cage，IVC)，TBI 设备需远离小鼠饲养的场所等，这些都使得人源化小鼠模型应用受到限制。白消安是一种烷化剂，较早前已应用在人类骨髓移植上，它的特点是强烈的骨髓抑制作用但免疫抑制作用较弱29，其作用与 TBI 相似，但高剂量的TBI 常导致高死亡率，而低剂量的 TBI 导致人源细胞植入率不高。obert-ichard 等23 在 NOD/SCID小鼠回输人源造血干细胞前分别用白消安及 TBI 作预处理的比较，结果表明 SC(scid repopulatingcells)数目没显著差异。Choi 等30 发现接受 2.4Gy剂量 TBI 的 NSG 小鼠组第 24 周的存活率只有33%，而接受 20 mg/kg 和 30 mg/kg 单剂量的白消安的 NSG 小鼠组第 24 周的存活率是 100%。接受30 mg/kg 单剂量的白消安的 NSG 小鼠组重建人源B 细胞亚群的程度比接受 2.4Gy 剂量 TBI 的 NSG小鼠组高，而接受 40 mg/kg 单剂量的白消安的 NSG小鼠组在 7 周内全部死亡。也有研究报道相隔 24 h给予两次 25 mg/kg 剂量的白消安预处理在 NOD/SCID 小鼠31 和在 NSG 小鼠22 上都达到最佳人源细胞植入率。使用白消安预处理的小鼠存活率高，不需要极度严格要求的小鼠饲养环境，操作简便，近年来逐渐取代 TBI，成为小鼠移植研究的主要预处理方式。1.4输注造血干细胞方式的选择目前使用最广泛的输注造血干细胞的方式是小鼠尾静脉注射，这种方式主要特点是便于操作，但造血干细胞经尾静脉进入血液循环后大多数的造血干细胞都被滞留在外周器官，仅有少数造血干细胞在各种趋化因子等介导下归巢骨髓。Yahata 等32 比较骨髓腔内输注与尾静脉输注两种方法，发现经骨髓腔内注射产生的 SC 是经尾静脉注射的 15 倍，因为骨髓腔内输注造血干细胞避开了各种外周器官滞留及各种细胞因子、趋化因子等因素的影响而直接归巢骨髓。但骨髓腔内注射技术要求较高，注射成功率不高，目前在做人源化小鼠各方面研究时两种方法均有研究人员使用。2人源化小鼠模型在血液疾病上的应用2.1人源化小鼠在研究 GVHD 上的应用GVHD 是异基因造血干细胞移植后非复发死亡的主要原因之一，目前 GVHD 的发病机制仍未完全明确及治疗手段有限33，所以，利用人源免疫细胞注入免疫缺陷小鼠，并在此基础上诱导出 GVHD 对其发病机制的研究及指导临床治疗意义重大。利用人源细胞注入免疫缺陷小鼠构建异种GVHD 模型已有多年历史。大约 30 年前，Mosier等34 率先利用人的外周血单个核细胞腹腔注射入经 TBI 预处理后的 SCID 小鼠体内，成功诱导出类似GVHD 样的症状。但这种方法诱导的 GVHD 的发病的异质性很大，需大量的外周血单个核细胞诱导，经腹腔注射的方式也不能模拟人类骨髓造血干细胞移植，因为所有的骨髓造血干细胞移植都是经静脉输注的。随着 ag/C/小鼠的出现，Van ijn 等35 第一次利用静脉注射 30106个人外周血单个核细胞到 ag/C/小鼠内诱导出 GVHD，但仍需要大量的单个核细胞及 TBI 预处理。Ito 等36 利用 NOG 小鼠、NOD/SCID 小鼠及ag2nullIL-2null小鼠进行比较，结果表明，NOG 小鼠输注人源外周血单个核细胞后诱导 GVHD 的发病时间最快，死亡的时间较统一，当使用 10106个人源外周血单个核细胞移植时，只有 NOG 小鼠在没有使用 TBI 预处理的情况下能诱导出 GVHD。King88第 4 期龙杰等:重建人类免疫系统的人源化小鼠模型及其在血液系统疾病研究中的应用等37 的研究发现，在使用 5106个人源外周血单个核细胞情况下，所有 NSG 小鼠在 2Gy 剂量的 TBI 预处理后都能诱导出 GVHD 样的症状。综上述，通过将人源外周血注入预处理或未预处理的免疫缺陷小鼠体内，可诱导出 GVHD 样症状，小鼠的免疫缺陷程度越高，诱导出 GVHD 需要的人源外周血细胞数量就越少。目前，人源化 GVHD 小鼠模型主要应用在研究GVHD 的发病机制及开发临床新型治疗药物。Wu等38 通过尾静脉高压注射质粒的方法，把人类 IL-21 基因导入 BG(BALB/c-ag2/IL-2null)小鼠的基因组中，然后分别利用人源外周血单个核细胞注入转基因表达人类 IL-21 的 BG 小鼠和对照组的 BG 小鼠，在移植后第 6 天发现转基因表达人类IL-21 小鼠脾脏聚集大量的 CD19+的细胞，并观察转基因表达人类 IL-21 的 BG 小鼠死亡时间明显缩短;同时将去除供者 B 细胞单个核细胞注入 BG 小鼠，长达 25 天内没有 GVHD 症状，结果表明 IL-21和 B 细胞可能参与 GVHD 的发病，靶向供者 B 细胞的治疗有可能成为预防和治疗 GVHD 的一种新方法。也有 Ito 等39 分别利用 CD4+人源外周血 T 细胞和 CD8+人源外周血 T 细胞注入 NOG 小鼠，结果发现，只有注入 CD4+人源外周血 T 细胞的 NOG 小鼠发生严重的皮肤 GVHD;然后利用 CD8+人源外周血 T 细胞与至少 0.5106个 CD4+人源外周血 T 细胞一起注入 NOG 小鼠，或者 CD8+人源外周血 T 细胞直接注入转基因表达人类 IL-2 的 NOG 小鼠内，都能诱发严重的皮肤 GVHD，结果表明 CD4+细胞可能通过 IL-2 的信号通路促进 CD8+细胞植入和扩增，并证实皮肤 GVHD 的病理结果是由 TH17 细胞分泌的 IL-17 和 IFN 所介导的，使用抗 IL-17 抗体可明显减轻皮肤 GVHD。虽然人源化 GVHD 小鼠模型为人类造血干细胞移植后产生的 GVHD 的发病机制和治疗提供了新思路。但由于种属差异性，异种移植产生 GVHD的发病机制不完全等同于同种移植。于是，Covassin等40 将 HLA-D4 阴性供者的人源 CD4+外周血单个核细胞注入缺失小鼠 MHC 分子及转基因表达HAL-D4 的 NSG 小鼠中，可构建同种异基因 GVHD模型。这种 GVHD 小鼠模型比异种 GVHD 小鼠模型，更好地模拟人类 GVHD 的发病。2.2人源化小鼠在研究白血病上的应用白血病是血液系统最常见的肿瘤之一，该病的预后与白血病细胞的形态、免疫分型、遗传学、分子生物学等因素有很大的相关性，且异质性很大。因此建立一种稳定的人源化的白血病小鼠模型对于抗白血病药物研发及白血病的免疫治疗具有重要意义。纵观白血病人源化小鼠模型的历史，最早使用裸鼠行白血病模型研究。Potter 等41 使用 HL-60 细胞系皮下注射经环磷酰胺预处理的裸鼠内，能够在裸鼠局部长出急性早幼粒细胞肉瘤。但这种动物模型的白血病表现与人类白血病相差较大，应用意义不大。1989 年，Kamel-eid 等42 使用急性淋巴细胞白血病细胞系注射入 SCID 小鼠内，成功重建白血病小鼠模型。这种小鼠模型中的白血病细胞在各器官的分布与儿童急性淋巴细胞白血病类似，基本重现了白血病细胞的生物学行为，对白血病的生长和发展的研究有一定帮助。但这种白血病细胞系无法保留肿瘤的异质性，为了体现出肿瘤的异质性，Uckun43 使用患者来源的高危 B 细胞谱系急性淋巴细胞白血病细胞注入 SCID 小鼠内，结果表明，白血病细胞在 SCID 小鼠内生长越快，患者的预后就越差。随后，Steele 等44 将 19 例患者来源的急性 T 淋巴细胞白血病细胞注射入 SCID 小鼠内，只有 12 例白血病细胞能在小鼠内生长，且进展的速度与患者的预后相关;剩余未能在 SCID 小鼠内生长的 7 例白血病细胞，再次注射入 NOD/SCID 小鼠体内，均能在小鼠内生长，但进展与患者预后无相关性。结果表明，小鼠免疫缺陷程度越高，白血病细胞越容易植入，但白血病细胞在 NOD/SCID 小鼠内的进展不能作为患者预后的一项指标。为了进一步提升人源白血病细胞的植入率，也随着免疫缺陷小鼠的发展，有学者逐渐使用 NSG 小鼠等新一代免疫缺陷小鼠行人源化白血病小鼠模型研究。Diamanti 等45 利用 NOD/SCID 小鼠及 NSG小鼠分别注入儿童患者的急性淋巴细胞白血病细胞，并比较了这两种品系小鼠之间的白血病细胞植入率，结果表明，不管患者的白血病亚型及危险度分层如何，NSG 小鼠的白血病细胞植入率是 NOD/SCID 小鼠的 1.2 7.7 倍。Woiterski J 等46 将 200多只 NSG 小鼠分别注入 54 名原发儿童急性白血病患者来源的骨髓细胞，结果表明，植入中位时间为710 周，90%的小鼠植入，雄性小鼠比雌性小鼠具98实验动物科学36 卷有显着更高的植入水平，NSG 小鼠的植入水平及总生存时间与患者白血病危险度分层有关。人源化白血病小鼠模型主要应用在临床前药物试验及研究白血病的发病机制。Her 等47 利用新生的 NSG 小鼠经肝内注入 FLT3 突变的急性髓系白血病细胞，成功建立白血病小鼠模型，并行索拉菲尼、瑞戈非尼临床前药物试验。Willmann 等48 利用NSG 小鼠植入 CD34+分选的慢性粒细胞白血病细胞，成功建立慢性粒细胞白血病动物模型，并在其基础上评价伊马替尼、尼洛替尼、维达列汀等药物疗效。这种疾病模型虽然可以行药物筛选实验，但不能反映人类白血病的发病情况。为了 解 决 这 一 问 题，Trivial 等49 和 Tezuka等50 以病毒为载体将白血病致病基因导入人类造血干细胞，进一步在免疫缺陷小鼠中诱发白血病的人源化小鼠模型逐渐发展起来。这种模型弥补了上述小鼠模型在白血病发病机制研究上的不足。3小结与展望人源化小鼠是一种很好的反应人类的免疫系统及某些疾病状态的工具。通过对人源造血干细胞来源、免疫缺陷小鼠品系、预处理方式等各方面因素的优化，可能建立一种免疫系统人源化程度较高的小鼠模型。过去的 10 余年人源化小鼠在血液学、免疫学等方面取得了令人瞩目的进步，多种人源化小鼠模型可以直接对人类疾病进行模拟，这在以前的免疫缺陷动物身上是不可能完成的。但是，目前的人源化小鼠模型仍有几方面的不足之处。首先，人源化小鼠模型的免疫缺陷小鼠的体内环境与人类的体内环境存在差异;其次，人源造血干细胞分化出来的各种免疫细胞存在不完整、不成熟、细胞间的接触不足等劣势。为了解决这些存在的问题，目前正在尝试研究出可以在免疫缺陷小鼠体内促进人源造血干细胞定向分化、成熟的基因工程方法，可能产生更适合应用于医学研究的人源化小鼠模型。参 考 文 献1Kuchma M D，Kyryk V M，Svitina H M，et al ComparativeAnalysis of the Hematopoietic Progenitor Cells from Placenta，Cord Blood，and Fetal Liver，Based on Their ImmunophenotypeJ Biomed es Int，2015，2015:4187522oncarolo M G，Bacchetta T cell repertoire and tolerance afterfetal stem cell transplantationJ Bone Marrow Transplant，1992，9 Suppl 1:127-1283Lepus C M，Gibson T F，Gerber S A，et al Comparison ofhuman fetal liver，umbilical cord blood，and adult bloodhematopoietic stem cell engraftment in NOD-scid/gammac/，Balb/c-ag1-/gammac-/，and CB17-scid/bg immunodeficientmiceJ Hum Immunol，2009，70(10):790-8024Vyas，Dudhat D，Navik P，et al Clinical safety in usingunmatched allogeneic umbilical cord blood mononuclear cellstransplantations in 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