分子生物学知识拓展 (10).pdf

2020 年 7 月第 45 卷第 13 期Vol.45，No.13July，2020收稿日期 2020-03-26 基金项目国家自然科学基金项目(81603167，81573725，81774034);安徽省高校自然科学研究项目(KJ2019A0476);安徽省高校优秀青年人才支持计划项目(gxyqZD2018054，gxyq2019030);安徽中医药大学重点学科建设项目(DC18100042)通信作者*邵菁，E-mail:ustcnjnusjtu 126com;*汪长中，E-mail:ahwcz63 sinacom作者简介马克龙，副教授，E-mail:makelong210 126com肉桂醛对白念珠菌定植下 DSS 诱导的溃疡性结肠炎小鼠治疗作用及对 dectin-1/TLs/NF-B信号通路的影响 摘要 观察肉桂醛对白念珠菌(Candida albicans，Ca)定植+葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium，DSS)诱导的小鼠溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)的治疗作用，以及对 dectin-1/TLs/NF-B 信号通路的影响。将 C57BL/6 小鼠随机分为正常组、DSS 组、DSS+Ca 组、肉桂醛(75 mg kg1)组和美沙拉嗪(200 mg kg1)组。DSS+Ca 组小鼠每日灌服 Ca(1108CFU/只)，连续4 d 后给予 3.0%DSS 溶液，自由饮用 7 d;肉桂醛组和美沙拉嗪组则在 DSS+Ca 组的基础上，在给予 DSS 的同时，分别给予药物灌胃治疗;正常组和 DSS 组给予蒸馏水对照处理。每日观察小鼠的一般状态，记录小鼠疾病活动指数(disease activity in-dex，DAI)，平板培养检测小鼠粪便真菌载荷量。末次给药次日，人道处死小鼠，测量结肠长度，计算结肠黏膜损伤指数(colonmucosa damage index，CMDI)，HE 染色法进行组织病理学分析。ELISA 法检测血清抗酿酒酵母抗体(anti-saccharomces cerevi-siae antibody，ASCA)、-1，3-葡聚糖以及血清和组织中细胞因子(TNF-，IL-1，IL-6，IL-8，IL-10)的含量。免疫荧光染色法检测结肠组织-1，3-葡聚糖含量和巨噬细胞浸润程度。Western blot 法和免疫组织化学染色法检测结肠组织 dectin-1，TL2，TL4和 NF-B 的蛋白表达情况。结果显示，肉桂醛可显著改善 Ca 定植下 UC 小鼠的一般状态，降低 DAI 评分和病理学评分;减轻肠道黏膜充血、糜烂和结肠缩短的程度;减少小鼠肠道 Ca 的载荷;下调血清 ASCA 和-1，3-葡聚糖含量;降低血清和结肠组织中 TNF-，IL-1，IL-6 和 IL-8 的含量，升高 IL-10 的含量，抑制结肠巨噬细胞的浸润，下调结肠组织 dectin-1，TL2，TL4 和NF-B的蛋白表达水平。结果表明，肉桂醛对 Ca 定植下 DSS 诱导的小鼠 UC 具有治疗作用，其机制可能在于肉桂醛能够显著抑制 Ca 增殖，调节 dectin-1/TLs/NF-B 信号通路，协调促炎因子和抗炎因子之间的平衡。关键词 肉桂醛;溃疡性结肠炎;白念珠菌;dectin-1/TLs/NF-B 信号通路Therapeutic effect of cinnamaldehyde on ulcerative colitis in mice induced bydextran sulfate sodium with Candida albicans colonization and its effect ondectin-1/TLs/NF-B signaling pathwayMA Ke-long1，2，3，4，HAN Zhi-jun1，PAN Min1，CHEN Meng-li1，GE Yu-zhu1，SHAO Jing1，2，3，4*，WU Da-qiang1，2，3，4，WANG Tian-ming1，2，3，4，YAN Gui-ming1，2，3，4，WANG Chang-zhong1，2，3，4*11232020 年 7 月第 45 卷第 13 期Vol.45，No.13July，2020(1College of Integrated Chinese and Western Medicine/College of Life Science，Anhui University of Chinese Medicine，Hefei 230012，China;2Institute of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，Anhui Academy of Chinese Medicine，Hefei 230012，China;3Key Laboratory of Xinan Medicine，Ministry of Education，Anhui Academy of Chinese Medicine，Hefei 230012，China;4Anhui Provincial Key Laboratory for Chinese Herbal Compound，Anhui Academy of Chinese Medicine，Hefei 230012，China)Abstract To observe the efficacy of cinnamaldehyde on dextran sulfate sodium(DSS)-induced ulcerative colitis(UC)with Can-dida albicans(Ca)colonization and its effect on dectin-1/TLs/NF-B signaling pathway in mice C57BL/6 mice were randomlydivided into normal group，DSS group，DSS+Ca group，cinnamaldehyde group and mesalazine group Mice in DSS+Ca group weregiven Ca(1108CFU per mouse)through intragastrical administration for 4 consecutive days and then distilled water with 3.0%DSSfor 7 consecutive days In cinnamaldehyde group and mesalazine group，in addition to the induction method of the DSS+Ca group，micewere given 75 mg kg1cinnamaldehyde and 200 mg kg1mesalazine accompanied with 3.0%DSS for 7 consecutive days，respectivelyMice in normal group and DSS group were correspondingly administered with distilled water The general conditions of the mice wereobserved daily，the diseased activity index(DAI)score was calculated，and fungal loads of feces were detected by plate method Themice were sacrificed on day 12，colon length was measured，colon mucosa damage index(CMDI)score was calculated，and his-topathological analysis was carried out by HE staining Anti-saccharomces cerevisiae antibody(ASCA)and-1，3-glucan in serum，and TNF-，IL-1，IL-6，IL-8，IL-10 in serum and colon tissue were detected by ELISA The contents of-1，3-glucan and macro-phage infiltration in colon tissues were examined by immunofluorescence staining The protein expressions of dectin-1，TL2，TL4and NF-B were detected by Western blot and immunohistochemistry staining The results showed that cinnamaldehyde could signifi-cantly improve the general conditions of UC mice with Ca colonization，decrease DAI and histopathological scores，reduce intestinalmucosal congestion，erosion and colon shortening，decrease Ca load in mouse feces and tissues，down-regulate the contents of ASCAand-1，3-glucan in serum，reduce the contents of TNF-，IL-1，IL-6，IL-8 and increase IL-10 in serum and colon tissues，inhibitmacrophages infiltration and down-regulate the protein expression of dectin-1，TL2，TL4 and NF-B in colon tissue These resultssuggested that cinnamaldehyde had a therapeutic effect on UC mice with Ca colonization，which might be related to the inhibition of Caproliferation，the regulation of dectin-1/TLs/NF-B signaling pathways and the coordination of the balance between pro-inflammatoryand anti-inflammatory factors Key words cinnamaldehyde;ulcerative colitis;Candida albicans;dectin-1/TLs/NF-B signaling pathwaydoi:10.19540/jcnkicjcmm20200421.401溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种慢性非特异性肠病，主要累及结肠和直肠，其治愈难度大，复发率高，有较高的癌变率1。近年来，随着我国人民生活水平提高和生活方式改变，UC 的发病率呈上升态势2。UC 的病因尚未明确，一般认为与遗传、环境、肠道微生态和免疫失衡等因素有关2-3。有报道指出肠道微生态与相关的代谢途径和分子机制在 UC 的肠黏膜屏障功能和固有免疫中起着关键作用4，肠道微生态紊乱与 UC 关系的研究愈来愈受到重视。微生态紊乱的特点是微生物多样性减少，组成异常，空间分布改变，菌群之间比例以及与宿主相互作用的改变。对于肠道微生态的研究，以往大多关注于细菌菌群(microbiota)而忽略了真菌菌群(mycobiota)。白念珠菌(Candida albicans，Ca)是一种条件致病真菌，平时定植于肠道、口腔、阴道等黏膜以及皮肤上，在机体抵抗力下降或微生态紊乱时，可大量增殖而致病。UC 患者免疫力降低，白念珠菌繁殖、扩散，进而通过转位穿透肠道黏膜屏障导致黏膜及黏膜下深度感染，加重 UC 患者的病情5-6。研究发现，白念珠菌能诱发或加重 UC 患者的病情，并加重三硝基苯磺酸诱导的大鼠 UC 症状，而抗真菌治疗有利于 UC 结肠损伤的恢复6。故，抗真菌治疗对于提高肠道白念珠菌异常增殖的 UC 患者的临床疗效有重要意义。然而，由于抗生素、糖皮质激素等药物滥用，白念珠菌对抗真菌药物如唑类药物的耐药性日渐增强7。同时，UC 患者若长期使用糖皮质激素、抗生素和免疫抑制剂等药物会导致类固醇依赖和继发感染等毒副反应，进一步恶化肠道微生态，促使病情进展8。因此，研发广谱、高效、低毒的新型 UC 治疗药物已刻不容缓。肉桂醛又名桂皮醛，是肉桂挥发油的主要活性2123马克龙等:肉桂醛对白念珠菌定植下 DSS 诱导的溃疡性结肠炎小鼠治疗作用及对 dectin-1/TLs/NF-B 信号通路的影响成分，具有消炎抗菌作用。研究发现，肉桂醛具有抗真菌作用，其体外对白念珠菌的最小抑菌浓度为125 gmL1 9;同时具有保护消化道黏膜10，缓解UC 肠黏膜损伤的功效11。然而，肉桂醛在体内对白念珠菌的抑制效果如何，以及对白念珠菌定植的UC 是否有治疗作用，目前尚不清楚。故本研究建立白念珠菌定植的 UC 小鼠模型，从与真菌感染固有免疫相关的 dectin-1/TLs/NF-B 信号通路探讨肉桂醛治疗白念珠菌定植 UC 的分子机制，为肉桂醛对 UC 的治疗提供理论和实验依据。1材料健康 SPF 级雄性 C57BL/6 小鼠，68 周龄，体质量 2025 g，购于济南朋悦实验动物繁育有限公司，动物合格证号 SCXK(鲁)20190003。白念珠菌标准株 SC5314 由中国人民解放军海军军医大学姜远英教授惠赠。肉桂醛(批号 W228613)购自美国 Sigma 公司;美沙拉嗪肠溶片(批号 10402226)购自葵花药业;葡聚糖硫酸钠(DSS)购自北京毕特博生物技术有限责任公司;牛血清白蛋白(批号 9048-46-8)购自德国Biofroxx 公司;TNF-(批号 CK-E20852)，IL-1(批号 CK-E20174)，IL-6(批号 CK-E20188)，IL-8(批号CK-E20191)，IL-10(批号 CK-E20162)，ASCA(批号CK-E22252)ELISA 试剂盒购自泉州睿信生物科技有限公司;DAPI(批号 C1005)购自上海碧云生物技术公司;F4/80 抗体(批号 123110)购自美国 BioLeg-end 公司;-1，3-葡聚糖抗体(批号 400-2)购自澳大利亚生物科学用品公司;羊抗鼠 IgG/C3(批号143702a)购 自 美 国 Abbkine 公 司;TL2(批 号WL01747)抗体购自沈阳万类生物科技有限公司;NF-B(批号 AF5006)，TL4(批号 AF7017)，-actin(批号 AF7018)抗体购自美国 Affinity 公司;dectin-1(批号 sc-73897)抗体购自美国 Santa Cruz 生物技术公司;羊抗兔 IgG/HP 二抗(批号 SE134)购自北京索莱宝科技有限公司。HWSA150 型二氧化碳恒温培养箱(上海仙象仪器仪表公司);BBS-V800 超净工作台(济南鑫贝西生物技术有限公司);5417 高速离心机(德国Eppendorf);BX51 倒置光学显微镜，IX81 倒置荧光显微镜(日本 Olympus);EG1150H 组织包埋机，TP1020 组织脱水机，M2235 组织切片机(德国 Lei-ca);DYY-6C 型电泳仪(北京六一生物科技有限公司);Biospectrum510 型凝胶成像系统(美国 UVP)。2方法2.1白念珠菌悬液的配制将白念珠菌接种于装有液态沙氏培养基的锥形瓶中，置于 37 恒温摇床中培养 12 h。取出，离心收集后将菌液浓度调整至1109CFU mL1备用。2.2白念珠菌定植小鼠 UC 模型的建立与药物干预采用 Ca 灌胃+DSS 自由饮用的方法构建 Ca 定植小鼠 UC 模型12。小鼠适应性饲养 1 周后，随机分为 5 组:正常组、DSS 组、DSS+Ca 组、肉桂醛(75mg kg1)组13、美沙拉嗪(200 mg kg1)组，每组 10只。正常组小鼠自由饮用蒸馏水;DSS 组小鼠自由饮用 3.0%DSS 溶液，连续 7 d;DSS+Ca 组小鼠每日灌胃给予 1108CFU 的 Ca(每只 0.1 mL)连续 4 d后，自由饮用 3.0%DSS 溶液，连续 7 d。肉桂醛组和美沙拉嗪组在模型组的基础上，给予自由饮用3.0%DSS 溶液的同时，分别灌胃给予肉桂醛(75mg kg1)和美沙拉嗪(200 mgkg1)，连续 7 d。正常组和 DSS 组同时给予蒸馏水对照处理。2.3小鼠一般体征观察和疾病活动指数(diseaseactivity index，DAI)计算每日观察小鼠的精神、饮食、活动和毛发等一般状况，记录小鼠体质量、大便性状和大便隐血情况，对小鼠 DAI 进行评分14。2.4结肠病理形态学观察及结肠黏膜损伤指数(colon mucosa damage index，CMDI)评分小鼠麻醉后眼球取血，离心获取血清，20 冰箱保存备用。颈椎脱臼处死小鼠，无菌操作下迅速剖开腹腔，切取小鼠结肠，测量结肠长度，沿肠系膜纵轴剪开结肠，观察结肠水肿、溃疡等损伤程度，并进行 CMDI 评分15。切取一部分结肠，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，4 m 连续切片，HE 染色，光学显微镜下观察结肠病理学变化，按照文献方法进行评分16。剩余结肠组织80 冰箱保存，用于后续实验。2.5小鼠肠道白念珠菌载荷量评估收集各组小鼠第 1，3，5，7，9，11 天的粪便，干燥、称重后重悬于预冷的 PBS 中，涂布在含有双抗的科玛嘉显色固体培养基上。37 恒温培养 48 h，计数平板上白念珠菌微菌落的数量(CFU mg1)。2.6肠道组织-1，3-葡聚糖测定取部分新鲜的结肠组织，匀浆后置于牛血清白蛋白中封闭，8 000r min1离心，弃上清，-1，3-葡聚糖抗体 4 孵育 12h，8 000 rmin1离心，弃上清，IgG/Cy3 抗体室温下31232020 年 7 月第 45 卷第 13 期Vol.45，No.13July，2020避光孵育 1 h，倒置荧光显微镜下观察、拍照。2.7血清抗酿酒酵母抗体(anti-saccharomces cere-visiae antibody，ASCA)和-1，3-葡聚糖的含量测定取各组小鼠的血清，按照试剂盒检测方法测定各组小鼠血清中 ASCA 和-1，3-葡聚糖的含量。2.8血清和结肠组织 TNF-，IL-1，IL-6，IL-8，IL-10的含量检测取各组小鼠血清，按照 ELISA 试剂盒说明书检测 TNF-，IL-1，IL-6，IL-8，IL-10 的含量。取各组小鼠组织，称重，加适量 PBS，匀浆，离心，收集上清液，用 ELISA 法进行检测。2.9巨噬细胞检测结肠组织经最佳切削温度(OCT)包埋剂固定后切成 4 m 切片，4%多聚甲醛固定，10%山 羊 血 清 封 闭，F4/80 单 克 隆 抗 体(1200)4 孵育 12 h，PBS 漂洗后加 DAPI 孵育 4min，荧光显微镜下观察、拍照。2.10免疫组织化学染色肠组织石蜡切片二甲苯脱蜡，乙醇水化，0.1%Triton x-100 孵育 20 min，3%过氧化氢甲醇封闭 10 min，柠檬酸盐缓冲液微波辐射抗原修复，羊血清封闭。加 dectin-1(1 200)，TL2(1 100)，TL4(1 100)一抗，4 孵育过夜。加二抗 37 孵育 30 min，加 SABC 和 DAB 显色剂后经苏木精复染，乙醇脱水，二甲苯透明，封片。显微镜下观察显色结果，显示有棕黄色或棕褐色颗粒的细胞为阳性细胞。2.11Western blot 法检测取结肠组织，加液氮后用研钵研碎，根据组织蛋白提取试剂盒说明书提取蛋白样品。BCA 法对蛋白样品进行定量后，SDS-PAGE 分离蛋白，转膜、封闭。PBST 漂洗后加 dec-tin-1(1500)，TL2(1 250)，TL4(1 300)，NF-B(1500)和-actin(1 1 000)一抗，4 孵育过夜。PBST 漂洗后加 1 1 000 稀释后的 HP 标记的二抗，室温 2 h，漂洗后 ECL 化学发光液显色，凝胶成像系统观察结果，并进行灰度分析。2.12统计学分析所有实验数据用 SPSS 20 统计分析软件进行处理，数据用 珋xs 表示。采用单因素方差(One-way ANOVA)分析和 LSD 检验(方差不齐时用 Dunnetts T3 检验)对组间变量进行多重比较。P0.05 视为差异具有统计学意义。3结果3.1肉桂醛对小鼠一般状态和 DAI 的影响正常组小鼠毛发色泽、饮食、精神、大便均正常;DSS 组小鼠在自由饮用 DSS 溶液 3 d 后，出现行动迟缓、食欲减退和稀便，且随着时间延长，症状逐渐加重，出现黏液便和血便，DAI 逐渐增大;DSS+Ca 组小鼠的症状和体征与 DSS 组相似，但出现稀便和血便的时间稍早，DAI 升高更明显，与同时间点正常组相比有显著差异(P0.01);肉桂醛和美沙拉嗪治疗后，上述症状均得到不同程度的改善，随着治疗时间的延长，DAI 增加幅度变缓，与同时间点模型组相比有显著差异(P0.05 或 P0.01)(表 1)。表 1肉桂醛对 Ca 定植的 DSS 诱导溃疡性结肠炎小鼠疾病活动指数(DAI)评分的影响(珋xs，n=10)Table 1Effect of cinnamaldehyde on the DAI score against ulcerative colitis induced by DSS with Ca colonization in mice(珋xs，n=10)组别剂量/mg kg1DAI 评分第 1 天第 3 天第 5 天第 7 天第 9 天第 11 天正常0.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.00DSS0.000.000.000.000.260.060.480.081.770.172.560.25DSS+Ca0.140.042)0.230.052)0.520.082)1.520.172)2.450.312)3.380.392)肉桂醛750.140.030.230.050.440.051.230.213)1.810.244)2.260.274)美沙拉嗪2000.130.040.240.040.460.061.200.194)1.740.404)2.010.264)注:Ca白念珠菌;DSS葡聚糖硫酸钠;与正常组比较1)P0.05，2)P0.01;与 DSS+Ca 组比较3)P0.05，4)P0.01(表 25，图 4，5 同)。3.2肉桂醛对小鼠肠道白念珠菌载荷的影响收集小鼠第 1，3，5，7，9，11 天的粪便，在科玛嘉的培养板上培养，长出的蓝色光滑菌落是白念珠菌17。给予白念珠菌灌胃后，DSS+Ca 组小鼠粪便白念珠菌增多，CFU 明显增大，与正常组和 DSS 组相比有显著差异(P0.05 或 P0.01);肉桂醛治疗后，CFU随着治疗时间延长逐渐减小，与同时间点 DSS+Ca组相比有明显差异(P0.05 或 P0.01);美沙拉嗪组的 CFU 在治疗过程中也逐渐减小，但与同时间点正常组和 DSS 组相比，无显著差异(表 2)。3.3肉桂醛对小鼠血清 ASCA 含量的影响与正常组相比，DSS+Ca 组小鼠血清中 ASCA 含量显著升4123马克龙等:肉桂醛对白念珠菌定植下 DSS 诱导的溃疡性结肠炎小鼠治疗作用及对 dectin-1/TLs/NF-B 信号通路的影响表 2肉桂醛对 DSS 诱导溃疡性结肠炎小鼠肠道白念珠菌载荷的影响(珋xs，n=10)Table 2Effect of cinnamaldehyde on the colonic Candida albicans loading against ulcerative colitis induced by DSS in mice(珋xs，n=10)组别剂量/mg kg1lg CFU第 1 天第 3 天第 5 天第 7 天第 9 天第 11 天正常0.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.00DSS0.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.000.00DSS+Ca5.680.521)5.760.382)4.600.642)3.430.482)2.710.202)2.230.152)肉桂醛755.570.365.580.773.550.483)2.640.284)1.890.153)1.680.103)美沙拉嗪2005.370.555.820.724.280.993.000462.360.451.880.26注:CFU 为每毫克粪便的 CFU 数。高(P0.01);肉桂醛和美沙拉嗪治疗后小鼠血清中ASCA 的含量显著降低(P0.05)(表 3)。3.4肉桂醛对小鼠血清和肠道组织-1，3-葡聚糖含量的影响-1，3-葡聚糖是真菌细胞壁主要成分，可反应真菌感染程度。与正常组相比，DSS+Ca组小鼠血清中的-1，3-葡聚糖含量明显增加(P0.01);肉桂醛治疗后，-1，3-葡聚糖含量降低，与DSS+Ca 组相比有明显差异(P0.01)(表 3);免疫荧光染色检测肠道-1，3-葡聚糖暴露情况，结果显示，与正常组和 DSS 组相比，模型组染色深度明显增高;肉桂醛治疗后，染色深度降低(图 1)。表 3肉桂醛对 Ca 定植的 DSS 诱导溃疡性结肠炎小鼠血清中 ASCA 和-1，3-葡聚糖含量的影响(珋xs，n=10)Table 3Effect of cinnamaldehyde on the contents of ASCA and-1，3-glucan in the serum against ulcerative colitis induced byDSS with Ca colonization in mice(珋xs，n=10)组别剂量/mg kg1ASCA/ng mL1-1，3-葡聚糖/pg mL1正常8.441.4930.034.02DSS9.331.5431.743.02DSS+Ca13.222.422)41.204.722)肉桂醛7511.031.793)35.104.254)美沙拉嗪20011.411.933)39.594.67A 正常组;B DSS 组;C DSS+Ca 组;D 肉桂醛(75 mg kg1)组;E 美沙拉嗪(200 mg kg1)组(图 25 同)。图 1肉桂醛对 Ca 定植的 DSS 诱导结肠-1，3-葡聚糖含量的影响(免疫荧光染色，200)Fig1Effect of cinnamaldehyde on the content of-1，3-glucan in colon against ulcerative colitis induced by DSS with Ca colonizationin mice(IF，200)3.5肉桂醛对小鼠结肠长度、CMDI 和组织病理学的影响与正常组相比，DSS+Ca 组小鼠结肠的长度明显缩短(P0.05);肉桂醛组和美沙拉嗪组小鼠结肠的长度明显长于 DSS+Ca 组(P0.05);DSS+Ca组小鼠结肠黏膜水肿、溃疡和糜烂，黏膜下见大量炎性浸润，上皮细胞破损，杯状细胞核腺体减少或排列不整齐，CMDI 和组织病理学评分升高，与正常组相比有明显差异(P0.05);肉桂醛和美沙拉嗪治疗后，小鼠结肠黏膜水肿、糜烂和溃疡明显减轻，上皮细胞破损明显减少，杯状细胞核腺体排列不整齐明显改善，CMDI 和组织病理学评分降低，与 DSS+Ca组相比有显著差异(P0.01)(表 4，图 2)。3.6肉桂醛对小鼠血清和结肠组织中 TNF-，IL-1，IL-6，IL-8，IL-10 含量的影响与正常组相比，DSS+Ca组血清和结肠组织中促炎因子 TNF-，IL-1，IL-6和 IL-8 含量明显升高，抗炎因子 IL-10 含量明显降51232020 年 7 月第 45 卷第 13 期Vol.45，No.13July，2020表 4肉桂醛对 Ca 定植的 DSS 诱导溃疡性结肠炎小鼠结肠长度、CMDI 和病理学评分的影响(珋xs，n=10)Table 4Effect of cinnamaldehyde on the colon length，CMDIand histopathological scores against ulcerative colitis induced byDSS with Ca colonization in mice(珋xs，n=10)组别剂量/mg kg1结肠长度/cmCMDI评分病理学评分正常6.270.490.191.490.040.02DSS5.660.551.870.382.050.41DSS+Ca4.900.521)3.010.401)2.910.551)肉桂醛755.380.513)1.860.314)1.930.344)美沙拉嗪2005.410.473)1.900.294)2.080.294)低(P0.01);DSS+Ca 组促炎因子高于 DSS 组，而抗炎因子低于 DSS 组，表明白念珠菌加重肠道的炎症;与 DSS+Ca 组相比，肉桂醛和美沙拉嗪组小鼠血清和结肠组织中 TNF-，L-1，IL-6 和 IL-8 明显降图 2肉桂醛对 Ca 定植的 DSS 诱导溃疡性结肠炎小鼠结肠组织形态学的影响(HE 染色，200)Fig2Effect of cinnamaldehyde on the histomorphology againstulcerative colitis induced by DSS with Ca colonization in mice(HE staining，200)低，而 IL-10 明显升高(P0.05 或 P0.01);肉桂醛组和美沙拉嗪组的表达无明显差异(表 5)。表 5肉桂醛对 Ca 定植的 DSS 诱导溃疡性结肠炎小鼠血清和结肠组织中 TNF-，IL-1，IL-6，IL-8 和 IL-10 含量的影响(珋xs，n=10)Table 5Effect of cinnamaldehyde on the contents of TNF-，IL-1，IL-6，IL-8 and IL-10 in the serum and colon tissue against ulcera-tive colitis induced by DSS with Ca colonization in mice(珋xs，n=10)组别剂量/mg kg1血清结肠组织TNF-/g L1IL-1/g L1IL-6/g L1IL-8/g L1IL-10/g L1TNF-/g L1IL-1/g L1IL-6/g L1IL-8/g L1IL-10/g L1正常42.105.5425.252.8746.345.8331.333.4597.429.3161.545.6337.493.0266.0911.0651.814.71107.899.31DSS73.307.8140.144.1161.603.4447.894.0469.206.5693.445.5151.445.3690.887.0284.238.7198.299.34DSS+Ca85.126.222)43.112.482)67.705.232)55.615.622)55.444.972)94.314.902)60.125.142)98.197.132)93.397.882)86.937.252)肉桂醛7577.505.703)38.404.434)60.254.983)51.175.023)62.217.333)87.189.053)50.524.044)85.1510.884)75.606.534)94.386.113)美沙拉嗪20072.027.114)39.393.073)58.205.774)49.143.854)61.896.123)79.658.314)49.295.174)87.849.113)78.667.124)97.568.624)3.7肉桂醛对小鼠结肠组织巨噬细胞浸润的影响与正常组相比，DSS+Ca 组和 DSS 组巨噬细胞浸润明显增多;DSS+Ca 组和 DSS 组无明显差异;肉桂醛和美沙拉嗪治疗后，巨噬细胞浸润明显减少，肉桂醛和美沙拉嗪组之间无明显差异(图 3)。图 3肉桂醛对 Ca 定植的 DSS 诱导溃疡性结肠炎小鼠结肠巨噬细胞浸润的影响(免疫荧光染色，200)Fig3Effect of cinnamaldehyde on the macrophages infiltration in colon against ulcerative colitis induced by DSS with Ca colonizationin mice(IF，200)3.8肉桂醛对小鼠结肠组织 dectin-1，TL2，TL4，NF-B 表达的影响DSS+Ca 组小鼠结肠组织 dec-tin-1，TL2，TL4，NF-B 表达上调，与正常组相比有显著差异(P0.01)，且 DSS+Ca 组的表达水平高6123马克龙等:肉桂醛对白念珠菌定植下 DSS 诱导的溃疡性结肠炎小鼠治疗作用及对 dectin-1/TLs/NF-B 信号通路的影响于 DSS 组;肉桂醛治疗后，dectin-1，TL2 和 NF-B的蛋白表达水平下调，与 DSS+Ca 组相比有明显差异(P0.05 或 P0.01);肉桂醛和美沙拉嗪组的表达无明显差异(图 4，5)。图 4肉桂醛对 Ca 定植的 DSS 诱导溃疡性结肠炎小鼠结肠组织 dectin-1，TL2，TL4 和 NF-B 蛋白表达的影响Fig4Effect of cinnamaldehyde on the protein expressions ofdectin-1，TL2，TL4 and NF-B against ulcerative colitis in-duced by DSS with Ca colonization in mice4讨论白念珠菌是人体肠道中天然存在的一种真菌，对维持肠道微生态平衡有重要作用。白念珠菌异常增殖可导致肠道微生态紊乱，黏膜生物屏障受损，进而诱导炎症因子释放，促进 UC 的发生和进展。为了探讨白念珠菌定植对于 UC 免疫炎症损伤和肠微生态紊乱的影响，笔者建立了白念珠菌定植下的 UC小鼠模型。不同于先 DSS 诱导结肠炎后白念珠菌定植的建模方式17，笔者采用先白念珠菌定植后DSS 诱导的建模策略来模拟人肠道微生态紊乱后的UC。结果显示，DSS+Ca 组小鼠粪便培养出的白念珠菌远多于正常组和 DSS 组，小鼠肠黏膜损伤程度，血清和组织炎症因子水平均明显高于正常组和DSS 组，说明白念珠菌可在肠道微生态紊乱和免疫低下的小鼠肠道内定植，造成局部和系统感染，加重UC 的症状，这与文献报道一致18。肉桂醛是一种有效的抗真菌药物，既往研究表明其能够破坏白念珠菌细胞壁和微管蛋白的聚合，抑制白念珠菌增殖9，19。-1，3-葡聚糖是真菌细胞壁的主要成分，当白念珠菌受到药物等外界因素刺激时，