王镜岩生物化学课件PPT-第14、15章 核酸的物理化学性质28957.pptx

Chapter13 核酸的物理化学性质核酸的物理化学性质Chapter14 核酸的研究方法核酸的研究方法Chapter13 核酸的物理化学性质核酸的物理化学性质一、核酸的水解一、核酸的水解（一）核酸的酸水解或碱水解（一）核酸的酸水解或碱水解l核酸分子中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水解切断。核酸分子中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水解切断。lDNADNA和和RNARNA对酸或碱的耐受程度有很大差别。对酸或碱的耐受程度有很大差别。例如，在例如，在0.1 mol/L NaOH0.1 mol/L NaOH溶液中，溶液中，RNARNA几乎可以完全水解，几乎可以完全水解，生成生成22或或33磷酸核苷；磷酸核苷；DNADNA在同样条件下则不受影响。这种水在同样条件下则不受影响。这种水解性能上的差别，与解性能上的差别，与RNARNA核糖基上核糖基上2-OH2-OH的邻基参与作用有很大的邻基参与作用有很大的关系。在的关系。在RNARNA水解时，水解时，2-OH2-OH首先进攻磷酸基，在断开磷酯键首先进攻磷酸基，在断开磷酯键的同时形成环状磷酸二酯，再在碱的作用形成水解产物。的同时形成环状磷酸二酯，再在碱的作用形成水解产物。DNADNA一般对碱稳定，一般对碱稳定，RNARNA对碱不稳定。对碱不稳定。（二）核酸的酶水解（二）核酸的酶水解一、核酸的水解一、核酸的水解l生物体内存在多种核酸水解酶。这些酶可以催化水解多聚生物体内存在多种核酸水解酶。这些酶可以催化水解多聚核苷酸链中的磷酸二酯键。核苷酸链中的磷酸二酯键。l以以DNADNA为底物的为底物的DNADNA水解酶（水解酶（DNasesDNases）和以）和以RNARNA为底物的为底物的RNARNA水解酶（水解酶（RNasesRNases）。）。l根据作用方式又分作两类：根据作用方式又分作两类：核酸外切酶核酸外切酶和和核酸内切酶核酸内切酶。l核酸外切酶的作用方式是从多聚核苷酸链的一端（核酸外切酶的作用方式是从多聚核苷酸链的一端（33端或端或55端）开始，逐个水解切除核苷酸；核酸内切酶的作用方式端）开始，逐个水解切除核苷酸；核酸内切酶的作用方式刚好和外切酶相反，它从多聚核苷酸链中间开始，在某个位刚好和外切酶相反，它从多聚核苷酸链中间开始，在某个位点切断磷酸二酯键。点切断磷酸二酯键。l在在分分子子生生物物学学研研究究中中最最有有应应用用价价值值的的是是限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶。这种酶可以特异性的水解核酸中某些特定碱基顺序部位。这种酶可以特异性的水解核酸中某些特定碱基顺序部位。Chapter13 核酸的物理化学性质核酸的物理化学性质Chapter13 核酸的物理化学性质核酸的物理化学性质一、核酸的水解一、核酸的水解（二）核酸的酶水解（二）核酸的酶水解脱氧核糖核酸酶类脱氧核糖核酸酶类1、牛胰脱氧核糖核酸酶、牛胰脱氧核糖核酸酶(DNaseI)(DNaseI)：从：从55磷酸末端切下寡聚核苷酸。磷酸末端切下寡聚核苷酸。2 2、牛脾脱氧核糖核酸酶牛脾脱氧核糖核酸酶(DNaseII)(DNaseII)：从：从55磷酸末端切下寡聚核苷磷酸末端切下寡聚核苷酸。酸。3 3、限制性内切酶：存在于细菌体内，用于专一性地降解外源的、限制性内切酶：存在于细菌体内，用于专一性地降解外源的DNADNA，限制性内切酶已成为基因工程最重要的工具酶。如，限制性内切酶已成为基因工程最重要的工具酶。如 EcoRI EcoRI （请看教材（请看教材503504503504页）页）二、核酸的分子量、溶解性、粘度和酸二、核酸的分子量、溶解性、粘度和酸碱性质碱性质Chapter13 核酸的物理化学性质核酸的物理化学性质 1、分子量在数百至数百万之间；微溶于水，不溶于分子量在数百至数百万之间；微溶于水，不溶于有机溶剂；变性时粘度降低；有机溶剂；变性时粘度降低；2、核酸的碱基、核苷和核苷酸均能发生解离。在一、核酸的碱基、核苷和核苷酸均能发生解离。在一定的条件下可形成兼性离子，为两性电解质，具有等定的条件下可形成兼性离子，为两性电解质，具有等电点。电点。Chapter13 核酸的物理化学性质核酸的物理化学性质三、三、核酸的紫外吸收核酸的紫外吸收n在核酸分子中，由于在核酸分子中，由于嘌呤碱嘌呤碱和和嘧啶碱嘧啶碱具有具有共轭双键体系，因而共轭双键体系，因而具有独特的紫外线吸具有独特的紫外线吸收光谱，最大吸收峰收光谱，最大吸收峰波长（波长（maxmax）在）在260nm260nm处处，可以作为，可以作为核酸及其组份定性和核酸及其组份定性和定量测定的依据。定量测定的依据。Chapter13 核酸的物理化学性质核酸的物理化学性质三、三、核酸的紫外吸收核酸的紫外吸收摩尔磷消光系数摩尔磷消光系数 508 508页页 增色效应：增色效应：核酸发生变核酸发生变性时，摩尔磷消光系数性时，摩尔磷消光系数 增加增加的现象。的现象。减色效应：减色效应：复性后，摩复性后，摩尔磷消光系数尔磷消光系数 又降低的效应。又降低的效应。Chapter13 核酸的物理化学性质核酸的物理化学性质四、核酸四、核酸的变性、复性及分子杂交的变性、复性及分子杂交n(一一)核酸的变性核酸的变性(denaturation)(denaturation)n核酸的变性核酸的变性:维系核酸三维结构的碱基堆积力和氢键维系核酸三维结构的碱基堆积力和氢键如果受到某些理化因素的破坏，其三维结构就要改变，如果受到某些理化因素的破坏，其三维结构就要改变，从而引起理化性质及生物学功能的改变，这种现象称从而引起理化性质及生物学功能的改变，这种现象称为核酸的变性。为核酸的变性。变性核酸将失去其部分或全部的生物活性。核酸的变性并不涉变性核酸将失去其部分或全部的生物活性。核酸的变性并不涉及磷酸二酯键的断裂，所以它的一级结构及磷酸二酯键的断裂，所以它的一级结构(碱基顺序碱基顺序)保持不变。保持不变。n能能够够引引起起核核酸酸变变性性的的因因素素很很多多。温温度度升升高高、酸酸碱碱度度改改变变、甲甲醛醛和和尿素等的存在均可引起核酸的变性。尿素等的存在均可引起核酸的变性。变性与降解的区别：是否涉及共价键的断裂和分子量的改变。变性与降解的区别：是否涉及共价键的断裂和分子量的改变。Chapter13 核酸的物理化学性质核酸的物理化学性质四、核酸四、核酸的变性、复性及分子杂交的变性、复性及分子杂交核酸的变性的特征核酸的变性的特征nDNADNA的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。因此，通常将引起成。因此，通常将引起DNADNA变性的温度称为融点，用变性的温度称为融点，用TmTm表示。表示。n一般一般DNADNA的的TmTm值在值在70-8570-85 C C之间。之间。DNADNA的的TmTm值与分子中值与分子中的的G G和和C C的含量有关。的含量有关。nG G和和C C的含量高，的含量高，TmTm值高。因而测定值高。因而测定TmTm值，可反映值，可反映DNADNA分分子中子中G,CG,C含量，可通过经验公式计算：含量，可通过经验公式计算：n （G+C)%=(Tm-69.3)X2.44G+C)%=(Tm-69.3)X2.44 影响影响DNA Tm大小的因素：大小的因素：DNA的均一性；的均一性；GC的的含量；介质中的离子强度。含量；介质中的离子强度。Chapter13 核酸的物理化学性质核酸的物理化学性质四、核酸四、核酸的变性、复性及分子杂交的变性、复性及分子杂交n当当DNADNA的稀盐溶液加热到的稀盐溶液加热到80-10080-100时，双螺旋结构即发生解体，时，双螺旋结构即发生解体，两条链彼此分开，形成无规线团。两条链彼此分开，形成无规线团。nDNADNA变性后，它的一系列性质也随之发生变化，如紫外吸收变性后，它的一系列性质也随之发生变化，如紫外吸收(260(260 nm)nm)值升高值升高,粘度降低等。粘度降低等。Chapter13 核酸的物理化学性质核酸的物理化学性质四、核酸四、核酸的变性、复性及分子杂交的变性、复性及分子杂交(二二)核酸的复性核酸的复性(renaturation)(renaturation)n核酸的复性核酸的复性:变性变性DNADNA在适当的条件下，两条彼此分在适当的条件下，两条彼此分开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为复性。为复性。DNADNA复性后，一系列性质将得到恢复，但是生复性后，一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只能得到部分的恢复。物活性一般只能得到部分的恢复。lDNADNA复性的程度、速率与复性过程的条件有关。复性的程度、速率与复性过程的条件有关。l将将热热变变性性的的DNADNA骤骤然然冷冷却却至至低低温温时时，DNADNA不不可可能能复复性性。但但是是将将变变性性的的DNADNA缓缓慢慢冷冷却却时时，可可以以复复性性。分分子子量量越越大大复复性性越越难难。浓浓度度越越大大，复复性性越越容容易易。此此外外，DNADNA的的复复性性也与它本身的组成和结构有关。也与它本身的组成和结构有关。(二二)核酸的复性核酸的复性(renaturation)(renaturation)Chapter13 核酸的物理化学性质核酸的物理化学性质四、核酸四、核酸的变性、复性及分子杂交的变性、复性及分子杂交(三三)核酸的杂交核酸的杂交(hybridization)(hybridization)n热变性的热变性的DNADNA单链，在复性时并不一定与同源单链，在复性时并不一定与同源DNADNA互补互补链形成双螺旋结构，它也可以与在某些区域有互补序链形成双螺旋结构，它也可以与在某些区域有互补序列的异源列的异源DNADNA单链形成双螺旋结构，叫单链形成双螺旋结构，叫核酸杂交核酸杂交。l这样形成的新分子称为杂交这样形成的新分子称为杂交DNADNA分子。分子。DNADNA单链与互补单链与互补的的RNARNA链之间也可以发生杂交。链之间也可以发生杂交。l核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要意义。意义。Southern blotting（Southern印迹法）：印迹法）：DNA-DNA杂交杂交Northern blotting（Northern印迹法）：印迹法）：DNA-RNA杂交杂交Western blotting（Western印迹法）：抗原印迹法）：抗原-抗体结合抗体结合 510页页(三三)核酸的杂交核酸的杂交五、核酸的沉降特性五、核酸的沉降特性Chapter13 核酸的物理化学性质核酸的物理化学性质 超速离心法纯化核酸。分离超速离心法纯化核酸。分离DNADNA常用氯化铯密度梯常用氯化铯密度梯度；分离度；分离RNARNA常用蔗糖密度梯度；应用啡啶嗅红常用蔗糖密度梯度；应用啡啶嗅红-氯化氯化铯密度梯度平衡超离心可将不同构象的铯密度梯度平衡超离心可将不同构象的DNADNA、RNARNA及蛋及蛋白质分开，是实验室最常用的纯化质粒白质分开，是实验室最常用的纯化质粒DNADNA的方法的方法请看请看515515页页Chapter13 核酸的物理化学性质核酸的物理化学性质六、核酸的凝胶电泳六、核酸的凝胶电泳1、琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳：分分析分子量大于析分子量大于1000bp的的DNA片段片段请看请看516页页 2、聚丙烯酰胺凝胶电泳：聚丙烯酰胺凝胶电泳：分析分子量小于分析分子量小于1000bp的的DNA片段片段七、七、DNA的固相合成的固相合成 520页页八、八、DNA的限制酶图谱的限制酶图谱限制性限制性内切酶内切酶 来源于细菌，高度专一地识别外源来源于细菌，高度专一地识别外源DNA上的特定位上的特定位点，并将其切断，形成形成粘性末端或平齐末端。不降点，并将其切断，形成形成粘性末端或平齐末端。不降解自身细胞的解自身细胞的DNA。因为在自身相应位点上经甲基化修。因为在自身相应位点上经甲基化修饰而受到保护。饰而受到保护。DNA的限制性的限制性内切酶图谱内切酶图谱 何叫回文结构？何叫回文结构？ATCGATCGATCGATTAGCTAGCTAGCTA即对某即对某DNADNA上所有的限制性酶切上所有的限制性酶切位点的确定。位点的确定。本节完本节完谢谢观看/欢迎下载BY FAITH I MEAN A VISION OF GOOD ONE CHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TO SEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESS OF OBSTACLES.BY FAITH I BY FAITH